瘤胃微生物以及瘤胃内环境的稳恒在反刍动物对饲粮营养物质的消化过程中起着重要作用。饲粮中的蛋白质进入奶牛瘤胃后，70%能够被微生物所消化，其余30%进入真胃和小肠等部位进行消化[1]。大部分饲粮中蛋白质被瘤胃微生物转化为微生物蛋白，其品质较优质蛋白质差，使饲粮中优质蛋白质的利用率降低。在奶牛饲粮中添加非蛋白氮会为瘤胃微生物合成微生物蛋白提供氮源，从而能够提高过瘤胃蛋白含量，有利于优质蛋白质在小肠段被消化吸收，进而提高其利用率[2]。但是，非蛋白氮的使用需要注意诸多问题，如需添加能量饲料、配合粗蛋白质使用和防止氨中毒等[3]。因此，探寻安全、有效的新型饲料添加剂有利于奶牛对饲粮中优质蛋白质的吸收利用，提高饲料转化率，改善乳品质。
小肽(SP)通常是指由2~3个氨基酸组成的寡肽，具有转运速度快、耗能低和不易饱和等特点[4]，比单一氨基酸更容易被机体组织吸收和利用[5]。因为小肽可被反刍动物机体完全吸收，对反刍动物自身的蛋白质营养具有重要意义[6]，所以，小肽在反刍动物生产中的应用逐渐增多。司丙文等[7]在奶牛饲粮中分别添加5、10和15 g/(头·d)小肽，结果表明，添加10 g/(头·d)小肽效果最佳，能够显著提高奶牛的产奶性能和氮的表观消化率。涂瑞等[8]发现在不同精粗比饲粮条件下添加小肽对体外产气量、养分降解率和发酵参数有显著影响。张智安等[9]研究表明，在湖羊饲粮中添加蜜蜂肽能够增加瘤胃微生物群落丰富度和多样性，同时抑制革兰氏阴性菌生长与繁殖，促进瘤胃发酵模式趋于乙酸发酵，提高乙酸/丙酸值。综上所述，目前关于小肽对瘤胃发酵的调控还鲜有报道，尤其是对奶牛瘤胃微生物区系的影响的报道更少。棉籽酶解蛋白是以优质的植物蛋白质为原料，经组合液态酶酶解工艺生产的小肽产品，该产品对奶牛瘤胃发酵有无影响还需进一步研究。因此，本试验主要通过体外批次培养法，旨在研究棉籽酶解蛋白对奶牛瘤胃发酵和微生物区系的影响，为该产品作为饲料添加剂在奶牛养殖中的进一步应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用棉籽酶解蛋白是通过植物蛋白酶解得到的功能肽产品，总蛋白质含量在45%以上，其中小肽含量为28%(谷氨酸含量9.55%、天冬氨酸含量4.20%、精氨酸含量4.47%、赖氨酸含量2.86%、亮氨酸含量2.76%、甘氨酸含量2.27%和苯丙氨酸含量2.27%)，由成都某公司提供。
1.2 试验设计选取4头健康、体况和泌乳天数相近的荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体，每天07：00和18：00饲喂和挤奶，饲粮精粗(干物质基础)比为50 ∶ 50，其组成及营养水平如表 1所示。体外发酵底物与供体奶牛饲粮水平相同，粉碎后过1 mm筛。本试验采用单因素随机试验设计，将采集的瘤胃液混匀后分为4组，即对照组(C组)、低浓度组(E组)、中浓度组(F组)和高浓度组(G组)，并分别在其底物中添加0、0.3%、0.5%和0.7%的棉籽酶解蛋白(干物质基础)，每组每个时间点3个重复，体外发酵培养48 h，分别在2、4、6、8、12、24和48 h进行样品采集，每次3个重复全部采集瘤胃上清液。
|
表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis) |
瘤胃液采集：本试验选取4头健康、体况和泌乳天数相近的荷斯坦奶牛，于07：00进行晨饲，11：00采用口腔采集法收集瘤胃液，每头牛收集800 mL瘤胃液[10]。将采集的瘤胃液均匀混合后经4层纱布过滤后，倒入用热水预热和充有二氧化碳的保温瓶中，带回实验室。
瘤胃液缓冲液参照Menke等[11]的方法制备：400 mL蒸馏水、200 mL A液(39 g NaHCO3和2 g NH4HCO3溶于1 L蒸馏水)、0.1 mL B液(13.2 g CaCl2·2H2O、10 g MnCl2·4H2O、1 g CoCl2·6H2O、8 g FeCl3·6H2O溶于100 mL蒸馏水)、200 mL C液(5.7 g Na2HPO4、6.2 g KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O溶于1 L蒸馏水)、1 mL刃天青溶液以及40 mL还原剂溶液(95 mL蒸馏水、4 mL NaOH和0.625 g Na2S·9H2O)。在与瘤胃液混合前加入还原剂溶液并置于39 ℃水浴锅中并持续通入二氧化碳直至混合液颜色变淡或无色时即可使用。
1.3.2 体外发酵培养与样品采集采用瓶口向上且盖有橡胶塞的250 mL玻璃瓶作为人工瘤胃培养瓶。试验前，将精确称取的2.00 g基础培养底物放入人工瘤胃培养瓶中，C组、E组、F组和G组分别加入0、6.00、10.00和14.00 mg棉籽酶解蛋白。参照Menke等[12]的体外培养方法，将过滤后的瘤胃液与配制好的缓冲液按照1 ∶ 2的比例混匀于持续通入二氧化碳的三角瓶中，制成人工瘤胃培养液，三角瓶置于39 ℃水浴中。抽取200 mL人工瘤胃培养液分装于预热至39 ℃并通有二氧化碳的培养瓶中，盖紧瓶塞，放入39 ℃水浴摇床上开始厌氧培养。将玻璃瓶的2/3浸于控温水浴摇床中，摇床频率为40 r/min。试验过程中，每30 min进行1次排气，培养时间48 h。
在体外发酵培养过程中，分别在2、4、6、8、12、24和48 h取出3瓶，停止发酵。取出的样品使用EL20型酸度计测定培养液pH后，分为3部分：一部分取5 mL瘤胃液装在含有2 mL 25%偏磷酸的10 mL离心管中，-20 ℃保存，用于测定瘤胃液挥发性脂肪酸(VFA)浓度；一部分放到10 mL离心管中，-20 ℃保存，用于测定瘤胃液中氨态氮(NH3-N)和菌体蛋白(MCP)浓度；一部分装在50 mL离心管中，-80 ℃保存，用于后期瘤胃微生物DNA的提取和测定。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 饲料常规指标的测定饲粮中粗蛋白质含量使用凯氏定氮法测定(GB/T 6432—2018)；粗脂肪含量使用滤袋法测定(GB/T 6433—2006);粗灰分含量按照国家标准GB/T 6438—2007进行测定；酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量采用范氏(Van Soest)[13]洗涤纤维分析法测定；钙和磷含量分别使用高锰酸钾法(GB/T 6436—2002)和钼黄分光光度法(GB/T 6437—2002)测定。
1.4.2 瘤胃内环境指标的测定样品解冻后5 000×g离心10 min，收集上清液，用气相色谱法测定VFA浓度[14]。NH3-N浓度采用靛酚比色法测定[15]。MCP浓度使用考马斯亮蓝法测定[16]。
1.4.3 瘤胃微生物的测定解冻瘤胃液样品，采用TIANGEN粪便基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA，具体操作参考说明书步骤。用分光光度计测定DNA样品的浓度与OD260/OD280值；取5 μL DNA样品进行2%的琼脂糖凝胶电泳并拍照，检测DNA的完整性和质量。
以提取的瘤胃液总微生物DNA为模板，检测瘤胃黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、反刍月形单胞菌、布氏普雷沃氏菌、易北普雷沃氏菌、总细菌绝对含量变化。各细菌的扩增引物序列如表 2所示。参考王尧悦[17]的方法计算各样品中每种细菌的拷贝数。荧光定量PCR反应体系如表 3所示，反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环；荧光信号采集设置在60 ℃(每循环第2步反应时)。
|
|
表 2 引物序列 Table 2 Sequence of primers |
|
|
表 3 荧光定量PCR反应体系 Table 3 Fluorescence quantitative PCR reaction system |
试验数据采用Excel 2019软件进行整理，并运用SPSS 24.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行各组间的显著性比较，并使用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值和均值标准误(SEM)表示，显著水平为P < 0.05。
2 结果 2.1 棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵的影响 2.1.1 棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液pH的影响由表 4可知，在整个培养过程中，瘤胃发酵液pH均处于正常水平之中。在体外培养的8 h以内，各组的pH均显著低于对照组(P < 0.05)；当培养8~48 h，除24 h的E组pH高于对照组外，其他各时段试验组的pH均低于对照组，但差异不显著(P>0.05)。
|
|
表 4 棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液pH的影响 Table 4 Effects of enzymatic hydrolysate of cottonseed protein on in vitro rumen fermentation fluid pH |
由表 5可知，随着培养时间的增加，各组NH3-N浓度均呈现先下降后上升的趋势。当培养8 h后，各试验组瘤胃发酵液中NH3-N浓度明显上升，24~48 h则趋于平缓。在培养2~12 h，各组瘤胃发酵液中NH3-N浓度均显著低于对照组(P < 0.05)；在培养24和48 h时，F组瘤胃发酵液中NH3-N浓度均显著高于其他3组(P < 0.05)。除在2 h，F组和G组之间差异不显著(P>0.05)外，其余各时间段各组之间NH3-N浓度均呈差异显著(P < 0.05)。
|
|
表 5 棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液NH3-N浓度的影响 Table 5 Effects of enzymatic hydrolysate of cottonseed protein on NH3-N concentration in in vitro rumen fermentation fluid |
由表 6可知，在整个培养过程中，各组瘤胃液中MCP浓度均呈先上升再下降，再上升，再下降的趋势；在培养2~8 h，对照组MCP浓度呈上升状态，之后趋于平缓。在各时间点，与对照组相比，各试验组瘤胃发酵液中MCP浓度显著升高(P < 0.05)；除2、12和24 h外，G组在各时间点瘤胃发酵液中MCP浓度显著高于其他组(P < 0.05)。
|
|
表 6 棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液中MCP浓度的影响 Table 6 Effects of enzymatic hydrolysate of cottonseed protein on MCP concentration in in vitro rumen fermentation fluid |
由表 7可知，在整个培养过程中，各试验组总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸浓度和乙酸/丙酸均呈先急剧上升，后缓慢上升趋势。各试验组之间TVFA、乙酸、丙酸、丁酸浓度在各时间段内均呈差异显著(P < 0.05)；其中，C组和G组的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸浓度均在较高水平波动，显著高于E组和F组(P < 0.05)；各时间点的E组和F组乙酸/丙酸总体上显著低于对照组和G组(P < 0.05)。
|
|
表 7 棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液中VFA浓度的影响 Table 7 Effects of enzymatic hydrolysate of cottonseed protein on VFA concentration in in vitro rumen fermentation fluid |
由表 8可知，在整个培养过程中，布氏普雷沃氏菌数量呈平缓式下降，易北普雷沃氏菌数量呈波动式下降；F组布氏普雷沃氏菌数量显著高于其他3组(P < 0.05)，E组布氏普雷沃氏菌数量显著低于对照组(P < 0.05)；G组布氏普雷沃氏菌数量在2~12 h培养过程中显著低于对照组(P < 0.05)。在培养2 h时，F组易北普雷沃氏菌数量显著高于其他3组(P < 0.05)，而E组易北普雷沃氏菌数量显著低于对照组和G组(P < 0.05)；在培养8 h时，G组易北普雷沃氏菌数量显著低于其他3组(P < 0.05)；在培养24 h时，E组易北普雷沃氏菌数量显著低于其他3组(P < 0.05)；在培养48 h时，F组和G组易北普雷沃氏菌数量显著高于对照组和E组(P < 0.05)。
|
|
表 8 棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液中普雷沃氏菌数量的影响 Table 8 Effects of enzymatic hydrolysate of cottonseed protein on Prevotella brevis numbers in in vitro rumen fermentation fluid |
由表 9可知，在整个培养过程中，各试验组反刍兽新月形单胞菌数量的变化趋势相似，在培养2~4 h呈下降趋势，在4~6 h急剧上升，之后趋于平缓趋势。在培养2~6 h，F组反刍兽新月形单胞菌数量显著高于其他3组(P < 0.05)；各时间点G组反刍兽新月形单胞菌数量显著低于其他3组(P < 0.05)。
|
|
表 9 棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液中反刍新月形单胞菌数量的影响 Table 9 Effects of enzymatic hydrolysate of cottonseed protein on Selenomonas ruminantium number in in vitro rumen fermentation fluid |
由表 10可知，在整个培养过程中，各试验组的黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌数量变化趋势大体相同；黄色瘤胃球菌数量呈先增加后降低趋势，白色瘤胃球菌数量呈平缓上升趋势。各个时间点F组的黄色瘤胃球菌数量和白色瘤胃球菌数量显著高于其他3组(P < 0.05)。
|
|
表 10 棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液中黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌数量的影响 Table 10 Effects of enzymatic hydrolysate of cottonseed protein on Ruminococcus flavefaciens and Ruminococcus albus number in in vitro rumen fermentation fluid |
瘤胃液pH是评价瘤胃发酵状况的一项重要指标，其数值主要在5.5~6.8变化，呈现中性或弱酸性[18]。瘤胃是瘤胃微生物发酵的主要场所，pH过高或过低可直接影响瘤胃微生物的生长代谢，同时还可以反映反刍动物瘤胃内发酵和有机酸的代谢情况。在本试验中，各组瘤胃发酵液pH均在6.31~6.74变化，表明本试验条件下能够保证瘤胃微生物正常生长代谢。在培养2~8 h，各组pH显著低于对照组，而在培养12~48 h，各试验组之间pH没有显著差异。王梦芝等[19]使用4种形式的氮源底物研究其对山羊瘤胃发酵的影响，结果显示pH呈现降低趋势，与本试验结果一致，说明小肽能够促进瘤胃中碳水化合物的发酵，使VFA生成增多。
瘤胃液中NH3-N浓度是瘤胃氮代谢过程中外源蛋白质和内源性含氮物质降解的重要产物。瘤胃中NH3-N浓度处于一个动态平衡状态，经常受到氮摄入、饲粮蛋白质降解、MCP合成速率和瘤胃对NH3-N的吸收等因素影响[20]。在本试验中，各组瘤胃液NH3-N浓度显著低于对照组，表明添加棉籽酶解蛋白可以增加微生物对氨氮的利用。殷云浩[21]和Jones等[22]研究发现，添加小肽可显著降低瘤胃液中NH3-N浓度，与本试验研究结果一致。当瘤胃液NH3-N浓度为8.5 mg/dL时，瘤胃微生物合成蛋白质的能力达到饱和，即使超过这一浓度，MCP产量不再增加[23]，而过高的NH3-N，既不能被微生物充分利用，还会导致大量的NH3-N通过瘤胃壁吸收进入血液。最后，被吸收NH3-N在肝脏中转化成尿素，并以尿液的形式排出体外。NH3-N的过量吸收不但会导致氮资源的浪费，而且还会导致氨中毒[24]。因此，在奶牛饲粮中添加小肽能够在正常范围内降低NH3-N浓度，减少通过瘤胃壁进入血液的NH3-N，从而减轻机体对氮代谢的负担。
饲粮中大部分的蛋白质饲料均在瘤胃中被瘤胃微生物所降解，形成肽、氨基酸及NH3-N，瘤胃微生物能够利用NH3-N合成MCP，供给奶牛机体利用，是其最主要的氮源供应者，可满足机体蛋白质需要量的40%~80%[25]。前人研究报道，在饲粮中添加小肽可以促进瘤胃细菌生长和纤维降解[26]，并发现无论是体内还是体外大豆小肽均可显著提高瘤胃MCP浓度[27-28]。在本试验中，各组瘤胃发酵液MCP浓度显著高于对照组，与前人研究结果一致。因此，在奶牛饲粮中添加棉籽酶解蛋白能够有效促进其瘤胃微生物对NH3-N的利用，提高瘤胃微生物合成MCP的能力，从而提高奶牛对蛋白质饲料的利用率。
VFA是碳链为1~6的脂肪酸，对反刍动物瘤胃的代谢有着极为关键的作用，其中，乙酸、丙酸和丁酸约占瘤胃发酵VFA总产量的95%[29]。有研究表明，瘤胃中VFA不仅为瘤胃消化吸收提供能量，而且还与瘤胃壁组织的发育密切相关[30]。可见，VFA对反刍动物的作用以及对反刍动物瘤胃的功能有着重要影响。前人研究表明，小肽能够显著提高瘤胃中VFA浓度，降低乙酸/丙酸[21, 31]。而在本试验中，TVFA和乙酸、丙酸、丁酸浓度总体呈上升趋势，与前人研究结果一致。因此，在饲粮中添加不同浓度的棉籽酶解蛋白对瘤胃微生物体外发酵产生VFA具有一定的调控作用。
3.2 棉籽酶解蛋白对瘤胃微生物数量的影响奶牛的瘤胃可以为多种微生物(细菌、原虫和真菌)提供栖息地[32]，并保证微生物发酵顺利进行，其发酵本质是瘤胃内微生物对饲料纤维素、蛋白质等物质进行发酵、降解，以实现更有效的利用[33]。瘤胃菌群结构与反刍动物机体健康和生产性能密切相关[34]。瘤胃的主要功能菌群包括：纤维分解菌、半纤维素分解菌、蛋白质分解菌、淀粉分解菌、脂肪分解菌、乳酸产生菌和乳酸利用菌[35]。在本试验中，主要研究了棉籽酶解蛋白对纤维分解菌(白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌)和蛋白分解菌(普雷沃氏菌和反刍兽新月形单胞菌)数量的影响。
瘤胃中主要的纤维分解菌包括：产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌[36]。在本试验中，添加棉籽酶解蛋白制剂能够明显增加瘤胃中黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的数量，且添加量为干物质的0.5%时，黄色瘤胃球菌数量在培养8~12 h均显著增加，白色瘤胃球菌数量在各时段均增加，效果较为理想。目前，国内外尚无肽和纤维分解菌之间关联的统一观点，但是，一部分学者认为非氨态氮(蛋白质、肽和氨基酸)能够促进瘤胃微生物的纤维降解能力[37]。王文娟等[38]也通过瘤胃灌注方法，发现大豆小肽能够提高鲁西黄牛对于纤维素的表观消化率。李琍等[39]通过混合瘤胃微生物体外培养方法，证明肽能够显著提高纤维分解菌的活力和粗纤维的降解率，这与本试验的结果相一致。
目前研究报道的蛋白降解菌主要包括嗜淀粉瘤胃杆菌、反刍兽新月形单胞菌、溶纤维丁酸弧菌和普雷沃氏菌属，除了一些纤维降解菌没有蛋白酶活性外，大多数的瘤胃细菌都具有一定的降解蛋白质的能力，其中反刍兽新月形单胞菌还可以利用瘤胃中的乳酸将其生成挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)[40]。本试验中选取了反刍兽新月形单胞菌和普雷沃氏菌属中的易北普雷沃氏菌与布氏普雷沃氏菌为研究对象，试验结果表明，在整个培养过程中，F组布氏普雷沃氏菌和反刍兽新月形单胞菌数量显著高于其他3组，可能是添加棉籽酶解蛋白能为其生长提供底物。虽然瘤胃中反刍兽新月形单胞菌数量显著增加，但是并未提高瘤胃中挥发性脂肪酸浓度，具体原因需进一步试验论证。有研究指出，一定浓度的肽反而会降低某些蛋白分解菌的数量，进而会抑制蛋白质的降解[39]，而本试验中G组布氏普雷沃氏菌数量在培养2~12 h过程中显著低于对照组，与其说法相似。
4 结论① 添加棉籽酶解蛋白能够在合理的范围内降低瘤胃液pH和NH3-N的浓度，增加MCP浓度，促进瘤胃发酵，但对VFA的产生有一定抑制作用。
② 添加棉籽酶解蛋白能够增加瘤胃球菌的数量，促进瘤胃微生物对纤维的降解能力。同时，棉籽酶解蛋白会减少瘤胃中普雷沃氏菌的数量，有可能会抑制瘤胃微生物对蛋白质的降解。通过瘤胃发酵参数和微生物数量综合比较各组结果，棉籽酶解蛋白的最适添加剂量为0.5%。
| [1] |
张文丽. 反刍动物对蛋白质饲料的利用[J]. 畜牧与饲料科学, 2012, 33(8): 56-57. ZHANG W L. Utilization of protein feed in ruminants[J]. Animal Husbandry and Feed Science, 2012, 33(8): 56-57 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1672-5190.2012.08.032 |
| [2] |
潘宝海, 秦玉昌, 于荣. 非蛋白氮饲料原料在奶牛生产中的应用[J]. 中国乳业, 2004(2): 22-24. PAN B H, QIN Y C, YU R. Application of non-protein nitrogen feed materials in dairy production[J]. China Dairy, 2004(2): 22-24 (in Chinese). |
| [3] |
于千桂. 奶牛用非蛋白氮类饲料的注意事项[J]. 科学种养, 2011(6): 42. YU Q G. Notes on non-protein nitrogen feed for dairy cows[J]. Scientific Planting and Breeding, 2011(6): 42 (in Chinese). |
| [4] |
GANAPATHY V, LEIBACH F H. Peptide transport in intestinal and renal brush border membrane vesicles[J]. Life Sciences, 1982, 30(25): 2137-2146. DOI:10.1016/0024-3205(82)90287-9 |
| [5] |
BOZA J J, MOËNNOZ D, VUICHOUD J, et al. Protein hydrolysate vs free amino acid-based diets on the nutritional recovery of the starved rat[J]. European Journal of Nutrition, 2000, 39(6): 237-243. DOI:10.1007/s003940070001 |
| [6] |
NEWEY H, SMYTH D H. Intracellular hydrolysis of dipeptides during intestinal absorption[J]. The Journal of Physiology, 1960, 152(2): 367-380. DOI:10.1113/jphysiol.1960.sp006493 |
| [7] |
司丙文, 张晓东, 张杰, 等. 小肽对奶牛产奶量、血清生化指标和营养物质消化率的影响[J]. 中国奶牛, 2019(9): 19-23. SI B W, ZHANG X D, ZHANG J, et al. Effects of small peptides on milk yield, serum biochemical indices and apparent digestibility of dairy cows[J]. China Dairy Cattle, 2019(9): 19-23 (in Chinese). |
| [8] |
涂瑞, 苗建军, 彭忠利, 等. 不同精粗比日粮中添加小肽对牦牛瘤胃体外发酵特性的影响[J]. 草业学报, 2020, 29(3): 78-88. TU R, MIAO J J, PENG Z L, et al. An in vitro study of dietary concentrate: forage ratio and small peptide supplementation effect on ruminal fermentation parameters of yaks[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2020, 29(3): 78-88 (in Chinese). |
| [9] |
张智安, 李世易, 武刚, 等. 蜜蜂肽对育肥湖羊生长性能和瘤胃微生物区系的影响[J]. 动物营养学报, 2020, 32(2): 756-764. ZHANG Z A, LI S Y, WU G, et al. Effects of honeybee peptide on growth performance and rumen microflora of fattening Hu sheep[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2020, 32(2): 756-764 (in Chinese). |
| [10] |
KLEEN J L, CANNIZZO C. Incidence, prevalence and impact of SARA in dairy herds[J]. Animal Feed Science and Technology, 2012, 172(1/2): 4-8. |
| [11] |
MENKE K H, RAAB L, SALEWSKI A, et al. The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro[J]. The Journal of Agricultural Science, 1979, 93(1): 217-222. |
| [12] |
MENKE K H, STEINGASS H. Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and gas production using rumen fluid[J]. Animal Research and Development, 1988, 28(1): 7-55. |
| [13] |
GOERING H K, VAN SOEST R L. Forage fiber analysis[M]. Washington D.C.: Agriculture Handbook, 1972: 379.
|
| [14] |
秦为琳. 应用气相色谱测定瘤胃挥发性脂肪酸方法的研究改进[J]. 南京农业大学学报, 1982, 5(4): 110-116. QIN W L. Determnation of rumen bolatile fatty acids by means of gas chromatography[J]. Journal of Nanjing Agricultural College, 1982, 5(4): 110-116 (in Chinese). |
| [15] |
CHANEY A L, MARBACH E P. Modified reagents for determination of urea and ammonia[J]. Clinical Chemistry, 1962, 8(2): 130-132. |
| [16] |
CONE J W, VAN GELDER A H, DRIEHUIS F. Description of gas production profiles with a three-phasic model[J]. Animal Feed Science and Technology, 1997, 66(1/2/3/4): 31-45. |
| [17] |
王尧悦. 日粮营养水平对滩羊瘤胃细菌区系及pH和VFA的影响[D]. 硕士学位论文. 杨凌: 西北农林科技大学, 2017: 13-19. WANG Y Y. Effects of dietary nutrient levels on the bacterial flora, pH and VFA levels in rumen of Tan sheep[D]. Master's Thesis. Yangling: Northwest A & F University, 2017: 13-19. (in Chinese) |
| [18] |
王庆丽, 田兰英, 赵仁义, 等. 影响奶牛瘤胃pH值的因素[J]. 河南畜牧兽医, 2008, 29(19): 36-37. WANG Q L, TIAN L Y, ZHAO R Y, et al. Factors affecting rumen pH of dairy cows[J]. Henan Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2008, 29(19): 36-37 (in Chinese). |
| [19] |
王梦芝, 喻礼怀, 王洪荣, 等. 不同分子形式氮源对瘤胃微生物发酵及蛋白合成的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2010, 46(5): 20-24. WANG M Z, YU L H, WANG H R, et al. Study on effects of different nitrogen forms on rumen microbial fermentation and protein synthesis[J]. Chinese Journal of Animal Science, 2010, 46(5): 20-24 (in Chinese). |
| [20] |
JOHN W R. Ruminal microbial metabolism of peptides and amino acids[J]. The Journal of Nutrition, 1996, 126(4): 1326S-1334S. |
| [21] |
殷云浩. 不同氮硫比尿素饲粮条件下小肽对南江黄羊瘤胃体外发酵特性的影响[D]. 硕士学位论文. 雅安: 四川农业大学, 2012: 34-36. YIN Y H. Effect of small peptide on in vitro rumen fermentation characteristic of nanjiang brown goat under the condition of different nitrogen-sulfur ratio of urea diet[D]. Master's Thesis. Ya'an: Sichuan Agricultural University, 2012: 34-36. (in Chinese) |
| [22] |
JONES D F, HOOVER W H, Webster T K M. Effects of concentrations of peptides on microbial metabolism in continuous culture[J]. Journal of Animal Science, 1998, 76(2): 611-616. |
| [23] |
COTTA M A, RUSSELL J B. Effect of peptides and amino acids on efficiency of rumen bacterial protein synthesis in continuous culture[J]. 1982, 65(2): 226-234.
|
| [24] |
WALLACE R J, ATAŞOĞLU C, NEWBOLD C J. Role of peptides in rumen microbial metabolism-review[J]. Asian Australasian Journal of Animal Sciences, 1999, 12(1): 139-147. |
| [25] |
ARAMBEL M J, BARTLEY E E, DUFVA G S, et al. Effect of diet on amino and nucleic acids of rumen bacteria and protozoa[J]. Journal of Dairy Science, 1982, 65(11): 2095-2101. |
| [26] |
CHIKUNYA S, NEWBOLD C J, RODE L, et al. Influence of dietary rumen-degradable protein on bacterial growth in the rumen of sheep receiving different energy sources[J]. Animal Feed Science and Technology, 1996, 63(1/2/3/4): 333-340. |
| [27] |
WANG L J, LIU Y, LIU S, et al. Effect of soybean peptides on in vitro ruminal fermentation and microbial population[J]. Journal of Northeast Agricultural University (English Edition), 2017, 24(4): 40-52. |
| [28] |
WANG W J, YANG W R, WANG Y, et al. Effects of soybean small peptides on rumen fermentation and on intestinal and total tract digestion of Luxi yellow cattle[J]. Asian Australasian Journal of Animal Sciences, 2013, 26(1): 72-81. |
| [29] |
王洪荣, 陈旭伟, 王梦芝, 等. 茶皂素和丝兰皂苷对山羊人工瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响[J]. 中国农业科学, 2011, 44(8): 1710-1719. WANG H R, CHEN X W, WANG M Z, et al. Effect of yucca schidigera saponin and tea saponin mixture on the rumen fermentation and its fibrolytic bacterial activity in the rusitec substrates with different concentrateto forage ratio[J]. Scientia Agricultural Sinica, 2011, 44(8): 1710-1719 (in Chinese). |
| [30] |
STORM A C, HANIGAN M D, KRISTENSEN N B. Effects of ruminal ammonia and butyrate concentrations on reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption kinetics under washed reticulorumen conditions in lactating dairy cows[J]. Journal of Dairy Science, 2011, 94(8): 3980-3994. |
| [31] |
王文娟. 瘤胃灌注小肽对肉牛瘤胃发酵与营养物质消化代谢的影响[D]. 硕士学位论文. 泰安: 山东农业大学, 2011: 35-47. WANG W J. Effect of small peptides on rumen fermentation and digestion of nutrition on beef cattle[D]. Master's Thesis. Tai'an: Shandong Agricultural University, 2011: 35-47. (in Chinese) |
| [32] |
田梅, 赵义良, 刘松雁, 等. 大豆小肽对肉牛瘤胃发酵和养分消化的影响[J]. 中国饲料, 2020(16): 55-58. TIAN M, ZHAO Y L, LIU S Y, et al. Effect of soybean peptides on rumen fermentation and nutrient apparent digestibility in beef cattle[J]. China Feed, 2020(16): 55-58 (in Chinese). |
| [33] |
王超, 刘国道. 瘤胃微生物降解纤维素的研究进展[J]. 安徽农业科学, 2007, 35(13): 3771-3772, 3799. WANG C, LIU G D. Progress of studies on cellulose degradation by rumen microorganism[J]. Anhui Agricultural Science, 2007, 35(13): 3771-3772, 3799 (in Chinese). |
| [34] |
WELKIE D G, STEVENSON D M, WEIMER P J. Arisa analysis of ruminal bacterial community dynamics in lactating dairy cows during the feeding cycle[J]. Anaerobe, 2009, 16(2): 94-100. |
| [35] |
胡小丽. 不同粗饲料和蛋白质类型日粮对奶牛瘤胃功能细菌数量的影响[D]. 硕士学位论文. 北京: 中国农业科学院, 2013: 50-57. HU X L. Effects of different forage and protein sources of diet on the quantity of functional bacteria in the rumen of dairy cows[D]. Master's Thesis. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2013: 50-57. (in Chinese) |
| [36] |
陈旭伟. 不同皂苷对山羊瘤胃原虫和细菌种属变化以及纤维降解的影响[D]. 硕士学位论文. 扬州: 扬州大学, 2009: 35-43. CHEN X W. Effect of different saponins on species variety of rumen protozoa and bacteria and fibre digestibilities[D]. Master's Thesis. Yangzhou: Yangzhou University, 2009: 35-43. (in Chinese) |
| [37] |
HINO T, SHIMADA K, MARUYAMA T. Substrate preference in a strain of Megasphaera elsdenii, a ruminal bacterium, and its implications in propionate production and growth competition[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60(6): 1827-1831. |
| [38] |
王文娟, 杨维仁, 宋恩亮, 等. 瘤胃灌注大豆小肽对鲁西黄牛营养物质消化代谢的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2011, 47(17): 22-26. WANG W J, YANG W R, SONG E L, et al. Effects of soybean small peptide infusion on nutrient digestion and metabolism of Luxi cattle[J]. Chinese Journal of Animal Science, 2011, 47(17): 22-26 (in Chinese). |
| [39] |
李琍, 丁角立. 肽对体外混合培养瘤胃微生物发酵和生长影响的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2000, 31(2): 113-119. LI L, DING J L. Effects of peptides on the fermentation and growth of mixed ruminal microorganisms in vitro[J]. Acta Veterinaria Et Zootechnica Sinica, 2000, 31(2): 113-119 (in Chinese). |
| [40] |
冯仰廉. 反刍动物营养学[M]. 北京: 科学出版社, 2004: 235-238. FENG Y L. Ruminant nutrition[M]. Beijing: Science Press, 2004: 235-238 (in Chinese). |