2. 青海大学畜牧兽医科学院, 西宁 810016
2. Academy of Animal Husbandry and Veterinary Sciences, Qinghai University, Xining 810016, China
牦牛(Bos grunniens)是青藏高原地区的主要反刍动物之一，为我国青藏高原地区提供了主要的生活支持和经济来源。牦牛繁殖率是牦牛生产中重要的经济指标之一，但目前牦牛繁殖率低下已成为亟待解决的问题。就经产母牦牛而言，传统自由放牧的饲养模式使其围产期常常处于冬春季的枯草期，这一时期的草场状况和环境较为恶劣，直接影响牦牛的营养状况[1]。另外，青藏地区的牧民几乎对围产期牦牛没有任何保健护理的措施，这使牦牛在围产期常处于营养缺乏状态[2-4]，牦牛的营养供给不足是降低其繁殖性能的主要原因之一[5]。目前已有围产期营养显著影响奶牛下一次妊娠的研究报道[6]，但牦牛围产期营养与下一次妊娠的关系尚未明确。围产期一般界定为产前第28天至产后第28天，该阶段是母畜生产中的一个重要时期，包括牦牛[7]。有相关研究显示，围产期奶牛容易表现出能量负平衡[8]。能量负平衡是指母畜分娩后体内血糖水平下降并伴随脂肪动员，造成体内游离脂肪酸[又称非酯化脂肪酸(nonestesterified fatty acid，NEFA)]和酮体浓度大量增加[9]。酮体作为机体发生能量负平衡时的标志产物，其主要成分β羟丁酸(β hydroxybutyric acid，BHBA)浓度在奶牛围产后期的血液中升高，存在明显的消长规律。血液中酮体浓度的升高直接影响奶牛生产性能、泌乳性能及免疫状态等，并严重影响其繁殖性能[10]。然而，对于青藏地区牦牛围产期的研究在国内外报道甚少，而且酮体对牦牛繁殖的影响也属于研究空白。基于此，本试验研究了围产期母牦牛血清酮体的消长规律以及酮体对牦牛产后生殖激素分泌的影响，旨在探究母牦牛由于产犊间隔过长引起繁殖性能低下的原因。
1 材料与方法 1.1 试验设计和样品采集试验选择25头年龄[(7.00±1.23)岁]、胎次[(2.00±0.07)次]和体况[(3.00±0.63)分]相近的经产母牦牛作为试验动物。牦牛自由放牧，早出牧、晚归牧，延长放牧时间，让牦牛多采食。从4月开始每7 d采集1次试验动物自产前第28天至产后第28天的血液，用以探究母牦牛围产期血清酮体的消长规律，分为9个时间点：产前第28天、产前第21天、产前第14天、产前第7天、分娩当天(第0天)、产后第7天、产后第14天、产后第21天及产后第28天。直到6月结束。另外，继续跟踪试验动物至产后第49天，同样每7 d采集试验动物血液，分为3个时间点：产后第35天、产后第42天和产后第49天，用以研究母牦牛酮体对生殖激素分泌的影响。并借助直检或肉眼观测试验母牦牛阴户流出的黏液情况、是否频繁排尿、相互舔嗅和外阴部等发情情况。
采用颈静脉采血法采集全血10 mL，不做抗凝处理，静置4 h后用离心机离心10 min，转速为3 000 r/min，收集血清分装后，再次离心5 min，转速为12 000 r/min。收集上清液后，置于-80 ℃冰箱保存备用。
1.2 血清指标的检测各时间点血清样品应用多功能酶标仪(型号：SYNERGY2，美国BioTek公司)进行检测，包括酮体指标(BHBA)、肝功能指标[NEFA、葡萄糖(glucose，GLU)、甘油三酯(triglyceride，TG)和谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，AST)]、蛋白质营养状况指标[总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)和球蛋白(globulin，GLO)]及生殖激素指标[雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P4)、促卵泡素(follicle stimulating hormone，FSH)和促黄体素(luteinizing hormone，LH)]。其中，GLU浓度应用葡萄糖氧化酶法进行检测，试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司(批号：1023-01-01-07)；其余指标应用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测，试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司(BHBA批号：MB-9690A；NEFA批号：MB-5201A；TG批号：MB-4922A；AST批号：MB-9689SA；TP批号：MB-9693A；ALB批号：MB-9688A；GLO批号：MB-4899A；E2批号：MB-2163A；P4批号：MB-4772A；FSH批号：MB-5413A；LH批号：MB-5289A)。
1.3 数据分析试验应用SPSS 26.0软件对各时间点数据进行统计学分析，其中各时间点间的比较应用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以平均值±标准差(mean±SD)表示；对围产期(产前28 d至产后28 d)的BHBA浓度和生殖激素指标之间应用双变量相关的方法进行相关性分析，以皮尔逊相关系数(R)表示。P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 酮体指标检测结果根据表 1可知，试验母牦牛血清BHBA浓度自分娩当天开始升高，并在产后第7天达到峰值，产后第14天开始下降，产后第21天恢复至产前水平。分娩当天、产后第7天和产后第14天的血清BHBA浓度显著高于其他各时间点(P＜0.05)。以上结果表明，试验母牦牛在产后第0~14天可能发生了能量负平衡。
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表 1 试验动物血清BHBA浓度检测结果 Table 1 Detection results of serum BHBA concentration of experimental animals |
根据表 2可知，试验母牦牛血清GLU浓度在分娩当天开始降低，并随着产后时间的推移逐渐升高。分娩当天、产后第7天和产后第14天的血清GLU浓度显著低于产前各时间点(P＜0.05)。
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表 2 试验动物血清肝功能指标检测结果 Table 2 Detection results of serum liver function indexes of experimental animals |
试验母牦牛血清NEFA浓度在产后第7天达到峰值，产后第14天开始下降，产后第21天恢复至产前水平。产后第7天和产后第14天的血清NEFA浓度显著高于其他各时间点(P＜0.05)。
血清AST活性在分娩当天开始升高，并在产后第7天、产后第14天、产后第21天和产后第28天持续升高。分娩当天、产后第7天、产后第14天、产后第21天和产后第28天的血清AST活性显著高于产前各时间点(P＜0.05)。
血清TG浓度在当天达到峰值，产后开始降低，并低于产前。产后第21天和产后第28天的血清TG浓度显著低于其他各时间点(P＜0.05)。
以上结果表明，试验母牦牛分娩时消耗大量糖类，分娩后血清GLU浓度伴随机能恢复而提高。分娩使母牦牛的能量大量消耗，机体通过过度的脂肪动员为其供能，这也是在分娩当天开始产生大量BHBA的原因，进一步说明试验母牦牛在产后可能发生能量负平衡的推论，进而引起了机体的代谢障碍。
2.3 蛋白质营养状况指标的检测结果根据表 3可知，试验母牦牛血清TP浓度自分娩当天开始升高，至产后第14天达到峰值，虽然在产后第21天有所降低，但仍高于产前。分娩当天、产后第7天、产后第14天、产后第21天和产后第28天的血清TP浓度显著高于产前各时间点(P＜0.05)。
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表 3 试验动物血清蛋白质营养状况指标检测结果 Table 3 Detection results of serum protein nutritional status indexes of experimental animals |
血清ALB浓度在产后第7天达到峰值，虽然在产后第21天有所降低，但仍高于产前。产后各时间点的血清ALB浓度无显著差异(P>0.05)，产后第7天、产后第14天和产后第28天的血清ALB浓度显著高于分娩当天和产前各时间点(P＜0.05)。
血清GLO浓度从分娩当天至产后第14天缓慢升高，在产后第21天降至最低。产后第14天的血清GLO浓度显著高于其他各时间点(P＜0.05)。
以上结果表明，试验母牦牛机体在产后蛋白质浓度整体升高，表明机体蛋白质代谢也参与了能量供给。
2.4 生殖激素指标的检测结果通过对母牦牛从产前第28到产后第49天进行跟踪式监测发现，试验母牦牛经过休情期之后仍未出现发情行为。
根据表 4可知，试验母牦牛血清P4、FSH和LH浓度在产后均维持在较高水平，血清E2浓度在产后逐渐降低并在产后第49天略有升高。分娩当天和产后各时间点的血清FSH和LH浓度显著高于产前各时间点(P＜0.05)。
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表 4 试验动物血清生殖激素指标浓度检测结果 Table 4 Detection results of serum reproductive hormone indexes of experimental animals |
以上结果表明，试验母牦牛在产后乏情可能与生殖激素发生紊乱有关。
2.5 围产期酮体与生殖激素指标相关性分析的结果根据表 5可知，血清BHBA浓度与E2浓度呈极显著正相关(P＜0.01)，与P4和LH浓度呈显著正相关(P＜0.05)，与FSH浓度不相关(P>0.05)。血清E2浓度与P4和LH浓度呈极显著正相关(P＜0.01)，与FSH浓度不相关(P>0.05)。血清P4浓度与FSH、LH浓度呈极显著正相关(P＜0.01)。血清FSH浓度与LH浓度呈极显著正相关(P＜0.01)。
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表 5 试验动物围产期血清酮体与生殖激素指标相关性分析 Table 5 Correlation analysis between serum ketone body and reproductive hormone indexes of experimental animals during perinatal period |
以上结果表明，试验母牦牛血清BHBA浓度影响了后期生殖激素的分泌，由此推测高原地区母牦牛围产后期发生能量负平衡影响了生殖激素的分泌模式，导致其产犊间隔延长，进而引起繁殖率低下。
3 讨论牦牛营养代谢是影响其繁殖性能的主要原因之一，而围产期营养代谢与牦牛繁殖性能的关系尚未明确。酮体是脂肪代谢产物之一，也是机体发生能量负平衡时的代谢产物[11-12]，可以作为判定能量负平衡的指标。本研究对试验母牦牛围产期血清酮体、肝功能指标、蛋白质营养状况指标和生殖激素指标进行跟踪式监测，结果发现试验母牦牛在围产后期发生了能量负平衡，并伴随糖类、脂类及蛋白质代谢的异常。另外，研究还发现试验牦牛产后E2和LH分泌发生异常，且与BHBA浓度呈现显著的相关性，说明能量负平衡的发生影响了生殖激素的分泌模式，这与Tsukamura等[13]的研究结果一致。
3.1 牦牛围产期酮体的消长规律母畜由于分娩消耗机体大量的能量，产犊后碳水化合物加速代谢，一方面补充分娩时的能量消耗，另外一方面为乳汁合成供能。当机体消耗量大于供给量时，就会发生能量负平衡[14]。在本研究中，试验母牦牛在分娩当天血清GLU浓度降低，说明试验母牦牛分娩时血清GLU的代谢消耗提高。在机体GLU浓度降低时，原本进入到三羧酸循环消耗GLU的草酰乙酸参与到糖异生过程合成GLU[15]。与此同时，机体会动员脂肪以继续提供能量，在这过程中会产生大量的NEFA[16-17]，而NEFA浓度升高与能量负平衡有关[18]。母牦牛产后第7~14天血清NEFA浓度达到了峰值，并且血清TG浓度降低，说明试验母牦牛发生能量负平衡，且机体在GLU浓度低时，动员脂肪以提供能量。根据试验结果可知，血清TG浓度的降低持续至围产期结束，且低于产前，这说明母牦牛在产后发生着过度的脂肪动员。脂肪动员中产生大量的乙酰辅酶A，当大量的草酰乙酸参与到糖异生时，乙酰辅酶A同样无法进入三羧酸循环中，进而转向其他途径，其中之一就是生成酮体[19]。在奶牛的研究中，围产后期常发生能量负平衡，酮体的产生是诊断能量负平衡的金标准。当血清BHBA浓度高于1.2 mmol/L时，则认定奶牛发生了能量负平衡[20-21]。虽然在母牦牛的研究中，没有相关的标准对是否处于能量负平衡进行判定，但是试验母牦牛自分娩开始直至产后14 d，BHBA浓度急剧升高，峰值达到1.961 mmol/L，也能够说明母牦牛在围产后期发生着能量负平衡。另外，血清GLU和TG浓度的降低，NEFA浓度的升高，也说明母牦牛机体内发生了代谢变化。蛋白质是动物机体供能的最后来源。脂肪过度消耗后，机体会通过减弱脂肪分解而加强蛋白质分解代谢来维持生存[22]。本研究中，试验母牦牛产后体内血清TP、ALB、GLO浓度升高，说明产后试验母牦牛体内的糖类与脂肪为其供能不足，蛋白质也参与了供能过程。
3.2 围产期酮体对生殖激素分泌的影响为了探究母牦牛围产期酮体生成后对其生殖激素分泌的影响，本研究还对围产期母牦牛主要生殖激素指标和发情情况进行了监测，并对BHBA浓度与生殖激素指标进行了相关性分析。结果发现，试验母牦牛在产后E2和LH分泌异常，并未出现发情的分泌模式，这可能是试验牦牛未表现发情的原因。另外，BHBA浓度分别与E2、P4和LH浓度存在相关性，说明血液BHBA浓度的改变直接或间接影响生殖激素的分泌。虽然BHBA浓度与P4浓度呈显著正相关，但P4产后的分泌模式并未表现异常，这可能是由于能量缺乏会造成孕酮分泌量的下降而产生的相关性[23]。LH的主要作用是促进卵泡生长与成熟，并诱导排卵[24]，但当机体发生能量负平衡时，体内蓄积的BHBA会抑制LH的脉冲频率，而产后早期脉冲式LH的分泌对于排卵前卵泡的生长、E2的分泌以及优势卵泡的排卵是非常重要的[25-26]。E2主要是促进雌性动物器官成熟及第二性征出现，并维持发情周期的变化和生殖活动[27]。研究发现，严重的能量负平衡会通过降低卵泡E2含量而降低卵泡的功能，使得卵泡的排卵滞后[26, 28]。在对生殖激素和发情表现持续跟踪监测发现，母牦牛的生殖激素仍分泌异常，且直至产后第49天母牦牛仍没有发情表现。有研究表明，牦牛的受胎率和营养水平是呈正相关的[29]。这可能是由于营养物质补充不足引起了能量负平衡，进而影响牦牛生殖激素的分泌模式，使牦牛在分娩后首次排卵时间间隔延长，休情期后不发情，导致繁殖性能低下[30-31]。这也可能是营养供给不足影响母牦牛繁殖力低下的一个主要原因，但具体发生机制需要进一步验证。
4 结论本研究首次对青海地区围产期母牦牛血清酮体及相关指标进行检测，通过数据分析得出围产期母牦牛血清酮体浓度的变化规律，并发现母牦牛分娩造成其机体能量的大量流失，导致机体脂肪过度动员产生了能量负平衡。能量负平衡的发生能够通过影响生殖激素的分泌模式，进而导致母牦牛繁殖率低下。
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