传统检测乳汁中病原体的方法是细菌培养，然而此方法对25%的临床乳腺炎样本和30%的隐型乳腺炎样本检测不出病原体^[1]，因此奶牛乳腺炎的分子诊断技术越来越受到学者们的关注。近几年，16S rRNA高通量测序分析为评估乳汁中微生物的多样性和丰度提供了相对快速有效的方法，并有助于病原体的发现和鉴定^[2]。研究发现健康奶牛常乳中存在核心菌群，并且泌乳阶段和胎次不同的奶牛，其乳汁中核心菌群存在显著差异^[2-3]。据报道，影响乳汁微生物区系变化的因素有多种，包括奶牛的主要组织相容性复合物(BoLA)基因突变、亚急性瘤胃酸中毒导致的代谢紊乱、饲养方式不同及乳腺炎的发生均会导致乳汁中微生物区系改变^[4-7]。值得注意的是，乳汁微生物区系有较强的自我调节能力，单一的外源性因素如抗生素的使用不会对乳汁中微生物区系造成显著持久的影响^[7-8]。本文将围绕以上主题，结合近几年国内外研究进展进行综述。

1 乳汁中微生物的来源

哺乳动物的乳汁对幼仔意义重大，不仅是完整能量的来源，还包括一系列生物活性物质，调节幼仔的免疫稳态，为进入充满微生物的外部环境做准备^[9-10]。传统上认为健康乳区的乳汁是无菌的^[11]，乳腺内部物质(尤其是乳汁)中微生物群落的定植是环境污染物通过乳头管(teat canal，TC)导致的^[12]，而且联合国粮食组织及农业组织在1990年也表明，分泌到奶牛乳腺中的乳汁是无菌的^[13]。然而，这些结论源于细菌培养的方法，既耗时又无法真正检测出代表性的微生物群落^[1]。目前，基于16S rRNA高通量测序分析乳汁中微生物群落结构的研究结果表明，乳汁中含有丰富的微生物群落^{[1, 14-16]}，而且乳腺内良好的温度条件和丰富的营养物质，十分有利于微生物的生长^[10]。

虽然人们普遍认为乳汁中的微生物来源于乳腺皮肤或者幼畜口腔，但一种新见解提出某些乳汁细菌能通过内源性途径到达乳腺^{[13, 17-18]}。对于人类和啮齿动物，机体中存在肠-乳腺途径，可以将细菌从肠道转移至乳腺^[19]，这种假设表明肠-乳腺之间存在内源性途径，肠道树突状细胞(intestinal dendritic cells，DC)和巨噬细胞将活细菌内化后，通过淋巴和外周血循环转移到乳腺。尽管DC和巨噬细胞通常会在被吞噬的细菌降解之前迁移到淋巴样组织(例如脾脏和淋巴结)^[20]。也有人提出，在母乳中有来自肠道相关淋巴组织中的树突状细胞，它们捕获管腔微生物区系，然后将这些微生物输送到乳腺^[17]。但反刍动物的泌乳生理不同，它们的乳腺免疫系统和肠道免疫系统之间的联系较差，局部免疫的大多数淋巴细胞都来自外周淋巴结而不是黏膜部位(如肠道黏膜)^[21]。某些病原体可通过血源性和淋巴转移的内源性途径引起乳腺内感染(intramammary infections，IMI)^[22]。值得注意的是，同时检测出乳汁、身体组织和淋巴结中的同一种病原体，不能完全证明这些病原体导致的IMI是由内源性途径引起的^[22]。同样，检测出奶牛粪便、体细胞和血液白细胞中的某些肠道相关细菌，不能完全证实奶牛中肠道细菌迁移到乳腺的假设，但可以合理推测某些细菌可以通过循环中的白细胞进入乳腺^[13]。

2 不同类型乳汁微生物区系的特点 2.1 健康乳汁及乳腺炎乳汁

从“生态”的角度来看，哺乳动物是一个由各种生态器官组成的复杂生态系统^[23]，这些生态器官都具有独特专一的微生物结构，它们各自独立却又相互作用，共同协调机体的微生物定植^[24]。通过对不同微生物区系特征的乳汁分析，共同的研究结果发现，与健康乳汁相比，乳腺炎发生时乳汁中的微生物菌群多样性显著降低^{[1-3, 5, 16]}。Oikonomou等^[2]发现，根据微生物区系特征很容易区分健康、隐性乳腺炎或临床乳腺炎奶牛的生物学样本，并且这3种乳汁样本中都含有丰富的特有微生物群落。在所有健康牛乳中都检测出了粪杆菌属、毛螺菌科中的某种菌属、丙酸菌属和好氧芽孢杆菌属。随着体细胞数(SCC)升高，鞘氨醇菌属(Sphingobacterium)和链球菌属(Streptococcus)的丰度增加，而奴卡氏菌属(Nocardiodes)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的丰度降低；也有研究表明，健康乳汁中丰度较高的菌群为假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和雷尔氏菌属(Ralstonia)^[25]。Tong等^[16]的研究结果表明，乳腺炎奶牛的乳汁中微生物菌群与健康奶牛存在显著差异，乳腺炎组链球菌属(Streptococcus)的丰度显著高于健康组，而变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)丰度显著低于健康组。Wang等^[26]也检测出隐性乳腺炎奶牛乳汁中放线菌门、拟杆菌门(Bacteroidetes)和螺旋体门(Spirochaetes)的丰度相对于健康组显著升高，临床乳腺炎奶牛乳汁中的厚壁菌门(Firmicutes)丰度显著升高。

根据这些研究结果可以得出，健康乳汁中含有大量“核心菌群”，但没有炎症反应和多形核中性粒细胞(PMN)趋化性的表现，说明乳腺的免疫细胞将这些细菌识别为“自我”。虽然乳房链球菌和金黄色葡萄球菌被认为是导致乳腺炎的病原体，但在一些低、中SCC的牛乳中也有少量存在，因此可以假设这些细菌是乳腺正常菌群的一部分^[27]。若这是2种细菌主导菌群引发的乳腺炎，可认为是一种菌群失调，而不是简单的原发感染^[2]。此外，丙酸杆菌属(Propionibacterium)和乳杆菌属(Lactobacillus)是大多健康乳汁中最常见的菌，它可能在机体的先天免疫中发挥作用，抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等主要的乳腺炎病原体^[3]。值得注意的是，研究发现隐型乳腺炎和临床乳腺炎中最常见的细菌为鞘氨醇单胞杆菌，并且它的比例增加与SCC升高有强相关性^[8]，因此推测鞘氨醇单胞杆菌是导致乳腺炎的一种潜在菌属。综上所述，健康奶牛乳汁中微生物多样性丰富，既包含有益共生菌也包含少量致病菌。当单一菌属大量增殖“占领”乳腺，则标志着乳腺炎的发生，伴随着乳汁中微生物多样性降低以及其他菌种丰度减少。

2.2 初乳及不同胎次乳汁

初乳在生命的初期发挥关键作用，支持新生儿的生长和健康。初乳不仅营养丰富，还含有生长因子和有益的微生物等，如被广泛用作益生菌的双歧杆菌属(Bifidobacterium)和乳杆菌属(Lactobacillus)^[28]。初乳转变为常乳的过程中伴随着免疫成分和代谢物的变化，这可能导致乳汁中微生物区系的改变。有学者研究发现，初乳具有高度多样化和丰富的微生物群落，最常见的6种菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门和软皮菌门，其中最丰富的菌属为葡萄球菌属(Staphylococci)^[3]。健康奶牛初乳中软皮菌门(Tenericutes)和梭杆菌门(Fusobacteria)以及梭杆菌属(Fusobacterium)和支原体属(Mycoplasma)丰度显著高于乳腺炎奶牛初乳中的丰度，且菌群多样性也更丰富^[3]。此外，研究发现不同胎次的奶牛初乳菌群结构存在显著不同，初产牛比经产牛初乳菌群更丰富，其中厚壁菌门丰度要高的多，而经产奶牛初乳中的梭杆菌门丰度更高。并且发现最终发展为乳腺炎的初乳菌群多样性，显著低于产后30 d仍然健康的初乳^[3]。这表明初乳中菌群多样性的高低与乳腺炎的发生密切相关。据报道，奶牛对不同的非金黄色葡萄球菌(NAS)引起的乳腺内感染(IMI)敏感性不同，并且与胎次和泌乳阶段密切相关^[29]。有学者对加拿大某牛群进行分析，发现产色葡萄球菌(Staphylococcus chromogenes)和模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)在初产奶牛中更常见，而表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)在经产牛乳中更普遍^[30]。初乳中微生物区系与常乳不同的原因可能是产前免疫球蛋白G(IgG)在乳汁中积累，产后乳汁中IgG含量快速下降，IgG可以通过结合特定表面位点和补体激活来灭活细菌抗原^[5]，因此产后乳汁抑制病原菌的能力降低；并且一些代谢物如乳寡糖含量也显著降低，它能与微生物竞争附着在上皮细胞的受体，进一步影响微生物的定植^[5]。但为何某些细菌在初产牛的乳汁中更为常见，它们定植的具体机理是什么，还需要进一步的研究。

3 乳汁中微生物群落的影响因素

乳腺对微生物定植和防御机制受多种因素的调节，主要为奶牛的基因型，特别是编码先天性和适应性免疫系统各个组成部分的基因^[31]，奶牛代谢失衡^{[6, 32]}及抗生素的使用等^{[7-8, 33-34]}。上述每个因素在调节乳腺免疫稳态和对IMI的抵抗中都起着重要作用，因此对乳汁微生物群的组成有直接或间接影响^{[5-8, 32-34]}。

3.1 基因型及环境因素

机体为各种微生物的生长提供了营养和生长环境，同时微生物群落也为机体执行一些重要的生理功能^[35]。然而，一些机会型病原菌在某些情况下影响微生物区系，扰乱机体的免疫动态平衡，激活炎症反应^[36]。为了应对这种持续不断的挑战，维持促炎和抑炎之间的平衡，哺乳动物的免疫系统已经采用了特定的机制区分共生菌、机会型病原菌和绝对病原菌^[5]。例如主要组织相容性复合体(MHC)基因Ⅱ类区域的多态性，在牛中也称BoLA基因^[37]。它的某些等位基因变异可以影响T淋巴细胞受体的多样性，从而触发其更广泛的抗原免疫反应的能力，而影响微生物的定植^[38]。此外，有学者对BoLA基因变异的奶牛第1周乳汁进行检测，发现BoLA基因的多态性对第0天初乳的变化影响最大，此后逐渐消退，这与初乳到常乳过程中IgG的含量变化相一致；并且每个BoLA亚型的初乳中，通过分泌抗菌肽从而发挥定植抗性的细菌均富集^[5]，提示BoLA基因多态性在调节奶牛初乳微生物区系组成方面具有潜在的作用。因此，确定这种基因型介导的乳汁中微生物区系的变化是由免疫系统直接调节的，还是由微生物衍生的定植抗性间接调节的，对未来防治乳腺炎具有重要的意义。

乳汁中微生物区系作为一个表型性状，除了受基因控制，必定受到环境的影响。近几年，由于生产的集约化，乳制品行业面临微生物多样性减少、细菌耐药性等问题。为了恢复农业生态系统的自我调节能力，全球各地都大力推广有机农业。与传统农业相比，有机农业禁止使用人工肥料、杀虫剂和除草剂，并限制抗生素的使用^[29]。这是否会对牛乳中微生物区系造成影响？针对这一问题，Gomes等^[4]研究表明，有机农场与传统农场奶牛的乳汁中微生物区系的真菌差异显著，特别是座囊菌纲(Dothideomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)和格孢腔菌目(Pleosporales)。这可能是化学原料及抗生素的限制，从而导致奶牛乳汁微生物区系改变。此外，不同的饲养方式对乳汁微生物区系也会产生一定的影响，虽然对于室内饲养的奶牛，挤奶前乳头消毒对乳汁微生物区系没有显著影响，但在室外放牧季节，接受消毒处理的奶牛乳汁微生物区系比未消毒组更加丰富^[39]；此外，在取样前进行乳头消毒的奶牛，与室内饲养相比，室外放牧的奶牛乳汁微生物区系存在较高比例的假单胞菌属和不动杆菌属(Acinetobacter)^[39]。而在另一项研究中发现，与奶牛胎次和SCC等因素相比，卧床对乳汁微生物区系的影响最大。相对于沙子和铺垫材料的卧床，使用秸秆垫料卧床的奶牛乳汁细菌丰度较低，且检测出的变形杆菌丰度也更高。因此，饲养管理因素对奶牛乳汁中的微生物群落结构起到重要作用^[29]。

3.2 代谢失衡

热应激导致的代谢失衡、围产期能量负平衡等都会造成奶牛血液中免疫指标和代谢产物的变化，发生免疫抑制，代谢紊乱，导致机体清除病原菌的能力下降，这与乳汁中的微生物群落结构变化具有直接联系。例如，亚急性瘤胃酸中毒(SARA)是一种因长期饲喂高精料而引起的代谢紊乱，导致瘤胃和后肠中微生物群失调^[40]。有研究表明，SARA与初产奶牛的初乳中机会型细菌的丰度增加呈正相关，包括嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)和缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)^[32]，说明SARA的奶牛患乳腺炎风险较高。胡晓宇^[6]也发现，奶牛发生SARA后，乳汁和瘤胃中的微生物菌群更加相近，且两者的寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)丰度显著上升。并且，与健康奶牛相比，SARA的奶牛感染金黄色葡萄球菌后乳成分变化更加明显，乳汁中金黄色葡萄球菌丰度更高^[6]，说明SARA弱化了奶牛乳腺组织对病原菌的清除能力。有研究表明，SARA期间菌群变化可能是由于机体调节免疫稳态导致的，当SARA发生后，胃肠道上皮屏障损坏导致游离的脂多糖(LPS)转移到血液和淋巴系统，并与脂多糖结合蛋白(LPS-binding proteins，LBP)结合，形成LPS-LBP免疫调节复合物，复合物再通过血液或淋巴系统转移到乳腺等局部激活促炎反应^[41]。而且，SARA导致乳汁中炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和血清淀粉样蛋白含量显著升高，这表明血乳屏障受到损害，增加乳腺炎发生的概率^[6]。但是，SARA期间是否存在细菌从胃肠道到乳腺的迁移，具体作用途径还需要进一步研究。

3.3 抗生素的使用

虽然大量研究已经证实了各种抗生素在消除或控制主要乳腺炎病原体方面的有效性，但关于抗生素对乳腺微生物区系的影响相关报道较少^[29]。Ganda等^[7]通过对奶牛2个乳区内注射大肠杆菌(Escherichia coli)诱导奶牛发生乳腺炎，接着对一个感染乳区注射头孢噻呋钠进行治疗，对另一个感染乳区注射生理盐水作为对照。结果发现感染大肠杆菌后乳汁中主导菌群由反刍球菌科(Ruminococcaceae)转变为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，随着时间推移，乳汁中肠杆菌科丰度减少，微生物多样性恢复，且随着乳腺炎症状的消退。而试验期间，抗生素并没有加速肠杆菌科丰度，也没有显著恢复乳汁微生物的多样性。另一个有趣的发现为，健康乳区长时间注射头孢噻呋钠并不会对乳汁微生物群产生持久的影响^[7]。因此，学者们推测乳腺内微生物群具有较强的自我调节能力，能够在感染环境型病原体导致微生物区系剧烈变化后自我恢复；同时，在接受广谱抗生素如第3代头孢菌素注射后，微生物区系依然表现出多样性和稳定性，说明乳汁中微生物区系受到动物机体严格的调控。

此外，干奶牛抗菌治疗(antimicrobial dry cow therapy，DCT)是控制乳腺炎的关键部分，旨在消除现有的IMI，并防止在泌乳期出现新的感染。研究发现，牛干奶期前和经过DCT的初乳微生物区系有高度的共性，并且都有高比例的乳腺炎病原菌和机会型病原菌，如葡萄球菌属、肠杆菌科和棒状杆菌属等^[8]。Biscarini等^[42]也表明，对干奶期奶牛不同乳区分别注射乳头密封剂和抗生素，对照乳区不做任何处理。结果显示产后5 d内乳汁中变形杆菌门、厚壁菌门和放线杆菌门在所有乳区中都有较高丰度，对照组与试验组之间微生物区系的α和β多样性指数没有显著差异，说明抗生素治疗干奶期奶牛对乳汁微生物区系没有显著影响。这些结果一方面说明了干奶期抗生素治疗对乳汁微生区系的改变有限，乳汁中微生物区系在长期接触抗生素后具有较强的“弹性”^[42]；另一方面说明乳汁中微生物区系受到机体严格的调控^[7]。因此，在奶牛生产中应有目的地使用抗生素，乳汁微生物区系有较强的自我调节能力^[7]，某些病原菌主导菌群导致的乳腺炎可以自我清除，无需乳腺内抗生素治疗。

4 小结

健康奶牛的乳汁及初乳中具有丰富的微生物多样性和特殊的微生物区系，且初产牛的初乳中微生物多样性更高。而乳腺炎奶牛的乳汁中微生物多样性显著降低，伴随着某些菌属的比例显著变化。此外，奶牛基因型不同、代谢紊乱、饲养管理条件的差异均会导致乳汁中微生物区系的改变。然而这些变化的菌属具体包括哪些菌种，它们在机体中发挥何种生物学功能，对乳腺健康发挥什么作用并不清楚。接下来的研究中，结合菌属功能得到某些标志性菌属来指示乳腺健康，是一项很有研究意义的课题。此外，能否通过培育特定基因型奶牛、改变饲养方式等非治疗性手段改善乳汁菌群结构，从而提高奶牛乳腺健康也值得进一步探索。