饲粮添加活性干酵母对肉牛营养物质表观消化率和瘤胃真菌菌群组成的影响

引用本文

彭全辉, 岳双明, 王之盛, 薛白, 王立志, 田刚, 康坤, 胡瑞. 饲粮添加活性干酵母对肉牛营养物质表观消化率和瘤胃真菌菌群组成的影响[J]. 动物营养学报, 2021, 33(8): 4456-4466.

PENG Quanhui, YUE Shuangming, WANG Zhisheng, XUE Bai, WANG Lizhi, TIAN Gang, KANG Kun, HU Rui. Effects of Dietary Active Dried Yeast on Nutrient Apparent Digestibilities and Rumen Fungal Community Composition of Beef Cattle[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2021, 33(8): 4456-4466.

饲粮添加活性干酵母对肉牛营养物质表观消化率和瘤胃真菌菌群组成的影响

彭全辉¹ , 岳双明² , 王之盛¹ , 薛白¹ , 王立志¹ , 田刚¹ , 康坤¹ , 胡瑞¹

1. 四川农业大学动物营养研究所, 四川省牛低碳养殖与安全生产高校重点实验室, 成都 611130;
2. 四川水利职业技术学院, 成都 611230

收稿日期: 2021-01-23

基金项目: “十三五”国家重点研发计划（2017YFD0502005）；农业农村部重大技术协同推广计划（2019-2020）

作者简介: 彭全辉(1981-), 男, 四川广安人, 副教授, 博士, 主要从事反刍动物营养研究。E-mail: pengquanhui@126.com.

通信作者: 彭全辉, 副教授, 硕士生导师, E-mail: pengquanhui@126.com.

摘要: 本试验旨在研究饲粮添加活性干酵母对肉牛营养物质表观消化率和瘤胃真菌群落组成的影响。选取体重（110±13）kg和日龄相近的18头肉牛（西杂牛♂×犏牛♀），随机分为3个组，每组6头牛。各组分别饲喂基础饲粮（对照组）、基础饲粮+2 g/（d·头）活性干酵母（ADY2组）、基础饲粮+4 g/（d·头）活性干酵母（ADY4组）。预试期为10 d，正试期110 d。结果表明：ADY2组和ADY4组的中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）表观消化率显著高于对照组（P < 0.05），但ADY2组和ADY4组之间无显著差异（P>0.05）。对照组鉴定出272个真菌操作分类单元（OTUs），ADY2组和ADY4组分别鉴定出543和527个OTUs。ADY2和ADY4组的Simpson、Shannon和PD指数均极显著高于对照组（P < 0.01），且ADY2组显著或极显著高于ADY4组（P < 0.05或P < 0.01）。主坐标分析（PCoA）结果表明，对照组与ADY2组和ADY4组能够明确区分开。从18个瘤胃样品中共鉴定出7个真菌门，分别是子囊菌门（Ascomycota）、新丽鞭毛菌门（Neocallimastigomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、毛霉门（Mucoromycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、隐真菌门（Rozellomycota）和其他真菌门（Fungi_NA）。ADY2组和ADY4组子囊菌门、新丽鞭毛菌门、担子菌门的相对丰度显著高于对照组（P < 0.05）；ADY2组和ADY4组其他真菌门的相对丰度显著低于对照组（P < 0.05），且ADY2组显著低于ADY4组（P < 0.05）。ADY2组和ADY4组未分类真菌属（unclassified_fungi）的相对丰度显著低于对照组（P < 0.05）；ADY2组新丽鞭菌属（Neocallimastix）、根囊鞭菌属（Orpinomyces）和念珠菌属（Candida）的相对丰度显著高于对照组和ADY4组（P < 0.05），ADY4组与对照组之间差异不显著（P>0.05）。综上所述，饲粮添加活性干酵母提高了瘤胃中子囊菌门、新丽鞭毛菌门和担子菌门的相对丰度，提高了新丽鞭菌属、根囊鞭菌属和念珠菌属的相对丰度，降低了未分类真菌属的相对丰度。在本试验条件下，饲粮添加2 g/（d·头）活性干酵母足以改变瘤胃真菌菌群组成，从而提高饲粮纤维物质表观消化率。

关键词: 活性干酵母瘤胃真菌纤维降解

Effects of Dietary Active Dried Yeast on Nutrient Apparent Digestibilities and Rumen Fungal Community Composition of Beef Cattle

PENG Quanhui¹ , YUE Shuangming² , WANG Zhisheng¹ , XUE Bai¹ , WANG Lizhi¹ , TIAN Gang¹ , KANG Kun¹ , HU Rui¹

1. Key Laboratory of University in Cattle Low Carbon Breeding and Safety Production in Sichuan Province, Animal Nutrition Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;
2. Sichuan Water Conservancy Vocational College, Chengdu 611230, China

Corresponding author: PENG Quanhui, associate professor, E-mail: pengquanhui@126.com.

Abstract: This experiment was conducted to investigate the effects of dietary active dried yeast on nutrient apparent digestibilities and rumen fungal community composition of beef cattle. A total of 18 beef cattle (Simmental crossbred♂×Pian cattle ♀) with body weight of (110±13) kg and similar age were randomly divided into three groups with 6 cattle in each group. Cattle in 3 groups were fed basal diet (control group), basal diet+2 g/(d·head) active dried yeast (ADY2 group) and basal diet+4 g/(d·head) active dried yeast (ADY4 group), respectively. The pre-experimental period lasted for 10 days, and the experimental period lasted for 110 days. The results showed that the nutrient apparent digestibilities of neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) of ADY2 group and ADY4 group were significantly higher than those of the control group (P < 0.05), however, there was no significant difference between ADY2 group and ADY4 group (P>0.05). A total of 272 fungal operational taxonomic units (OTUs) were detected in control group, while 543 and 527 OTUs were detected in ADY2 group and ADY4 group, respectively. The Simpson, Shannon and PD indexes of ADY2 group and ADY4 group were significantly higher than those of the control group (P < 0.01), and ADY2 group was significantly higher than ADY4 group (P < 0.05 or P < 0.01). The principal coordinate analysis (PCoA) results showed that the control group could be clearly distinguished from the ADY2 group and ADY4 group. Seven phyla were identified from 18 rumen samples, which were Ascomycota, Neocallimastigomycota, Basidiomycota, Mucoromycota, Glomeromycota, Rozellomycota and Fungi_NA. The relative abundances of Ascomycota, Neocallimastigomycota and Basidiomycota of ADY2 group and ADY4 group were significantly higher than those of the control group (P < 0.05); the Fungi_NA relative abundance of ADY2 group and ADY4 group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05), and ADY2 group was significantly lower than ADY4 group (P < 0.05). The unclassified fungi relative abundance of ADY2 group and ADY4 group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05); the relative abundances of Neocallimastix, Orpinomyces and Candida of ADY2 group were significantly higher than those of control group and ADY4 group (P < 0.05), but there was no significant difference between ADY4 group and control group (P>0.05). In conclusion, dietary active dried yeast increases the relative abundances of Ascomycota, Neocallimastigomycota and Basidiomycota in rumen, increases the relative abundances of Neocallimastix, Orpinomyces and Candida, and decreases the fungi_NA relative abundance. Under this experimental conditions, dietary supplementation of 2 g/(d·head) active dried yeast is enough to change the of rumen fungal community composition and improve the fiber apparent digestibilities.

Key words: active dried yeast rumen fungi fiber degradation

酵母菌属于兼性厌氧菌，其家族庞大，种类超过1 000种，其中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为饲料添加剂在反刍动物中使用已超过70年。众多研究表明，反刍动物饲粮中添加酿酒酵母或酵母培养物可提高饲粮纤维消化率^[1-4]，提高奶产量，改善乳品质^[5-7]，提高日增重^[8]。但是，前人的报道多认为酵母起作用主要是因为其能够消耗瘤胃内氧气，提高乳酸利用菌如巨型球菌属(Megasphaera)和月形单胞菌属(Selenomonas)和纤维分解菌如纤维杆菌属(Fibrobacter)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)等的相对丰度，降低蛋白质降解菌如普雷沃氏菌属(Prevotella)、互养球菌属(Syntrophococcus)和光岗菌属(Mitsuokella)等的相对丰度^[9-11]，从而加速瘤胃内乳酸分解代谢，稳定瘤胃pH^[8]，降低氧化还原电位，改善瘤胃内环境，改善动物健康，提高生产性能。但是，这些研究主要从细菌的角度解释了酿酒酵母起作用的原因。厌氧真菌于1975年被发现是瘤胃微生物重要的组成部分^[12]，因为具有纤维小体和氢化酶体而被认为是瘤胃内最为有效的降解木质纤维素的微生物类群^[13]，工业上用作帮助降解纤维从而更高效率地生产生物能源^[14-15]。目前，饲粮添加活性干酵母对瘤胃真菌的影响未见报道。因此，本试验旨在研究饲粮添加活性干酵母对肉牛营养物质表观消化率和瘤胃真菌群落组成的影响，并从瘤胃真菌的角度解释活性干酵母提高饲粮营养物质消化率的原因，为酿酒酵母在反刍动物饲粮中的应用提供理论支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验使用的活性干酵母为反刍动物专用酿酒酵母，活细胞数≥2×10¹⁰ CFU/g。

1.2 试验设计与饲养管理

试验选取体重(110±13) kg和日龄相近的18头肉牛(西杂牛♂×犏牛♀)为研究对象，采用完全随机设计，分为3个组，每组6头牛。各组分别饲喂基础饲粮(对照组)、基础饲粮+2 g/(d·头)活性干酵母(ADY2组)、基础饲粮+4 g/(d·头)活性干酵母(ADY4组)。预试期10 d，正试期110 d。

基础饲粮参照我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815-2004)^[16]，按照体重150 kg、日增重1.1 kg设计配方，基础饲粮组成及营养水平见表 1。牛只单栏饲养，试验前对场地进行消毒，并对供试牛进行驱虫。每天08:00和20:00按时饲喂，将活性干酵母与饲粮拌均匀后供牛只采食，自由饮水。

表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)

%
项目 Items	含量 Content
原料 Ingredients
玉米 Corn meal	26.50
麦麸 Wheat bran	3.50
豆粕 Soybean meal	2.00
棉籽粕 Cottonseed meal	5.30
尿素 Urea	0.20
豆油 Soybean oil	0.20
碳酸钙 CaCO₃	0.70
磷酸氢钙 CaHPO₄	0.20
硫酸钠 Na₂SO₄	0.20
小苏打 NaHCO₃	0.40
氯化钠 NaCl	0.50
预混料 Premix¹⁾	0.30
白酒糟 Distilled grain	30.00
皇竹草青贮 Silage hybrid giant napier	30.00
合计 Total	100.00
营养水平 Nutrient levels²⁾
综合净能 NE_mf/(MJ/kg)	5.11
粗蛋白质 CP	11.67
酸性洗涤纤维 ADF	28.43
中性洗涤纤维 NDF	46.45
粗脂肪 EE	2.13
钙 Ca	0.65
磷 P	0.44
1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of the diet：VA 8 000 IU，VD₃ 1 000 IU，VE 60 IU，Cu (as copper sulfate) 10 mg，Fe (as ferrous sulfate) 50 mg，Mn (as manganese sulfate) 40 mg，Zn (as zinc sulfate) 60 mg，I (as potassium iodide) 0.5 mg，Se (as sodium selenite) 0.2 mg，Co (as cobalt chloride) 0.2 mg。 2)综合净能为计算值，参考NY/T 815-2004^[16]，其余为实测值。NE_mf was a calculated value, which reference to NY/T 815-2004^[16], while the others were measured values.

表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)

1.3 样品收集与处理

于正试期第80天开始，每2周取1次饲粮样品，每次4份，每份2 kg，混匀后按照四分法收集饲粮样品，装入密封袋并于-20 ℃冰箱保存待测。于正式试验结束的前4天开始对所有18头牛采用全收粪法连续收集新鲜粪便，用10%硫酸固氮保存。将饲粮和粪便样品于65 ℃烘干后粉碎过1 mm筛保存，用以测定营养物质含量。干物质(DM)含量参照GB/T 6435-2014测定，粗蛋白质(CP)含量参照GB/T 6432-2018测定，粗脂肪(EE)含量参照GB/T 6433-2006测定，中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量分别参照GB/T 20806-2006和NY/T 1459-2007测定，钙含量参照GB/T 6436-2002测定，磷含量参照GB/T 6437-2002测定。各营养物质表观消化率的计算公式如下：

试验结束后全部牛只屠宰后分别在瘤胃背囊、腹囊、左纵沟和右纵沟等部位共收集瘤胃内容物约100 g，混匀后置于-80 ℃冰箱保存，用以测定瘤胃真菌组成。

1.4 瘤胃液微生物总DNA提取、扩增和测序

采用十六烷基三甲基溴化铵(hexade-cyltrimethy ammonium bromide，CTAB)法提取瘤胃液样品的基因组总DNA，检测纯度和浓度后，稀释至1 ng/μL备用。以稀释后的基因组DNA为模板，使用ITS1-5F(200~400 bp)进行瘤胃液真菌PCR扩增，通用引物为：ITS5-1737F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；ITS2-2043R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR产物经2%凝胶电泳检测，使用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen公司，德国)纯化PCR产物。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库通过Qubit和PCR进行定量，构建文库合格后，使用Illumina HiSeq 2500进行上机测序。

1.5 序列分析

根据Barcode和PCR扩增引物序列从原始数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags(raw Tags)数据，经过严格的过滤处理得到高质量Tags(clean Tags)数据。高质量Tags数据序列通过UCHIME Algorithm与数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到有效Tags(effective Tags)数据。

1.6 操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)聚类和物种注释

利用Uparse软件对所有样品的全部有效Tags进行聚类，默认以97%的一致性(identity)将序列聚类成为OTUs，同时筛选出OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列进行物种注释，用QIIME 1.9.1软件^[17]中的Blast方法与Unit数据库进行物种注释分析，并分别在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)各个分类水平统计各样本的群落组成。对各样品的数据进行均一化处理，以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的多样性分析均基于均一化处理后的数据。

1.7 数据统计分析

数据采用Excel 2016进行初步处理，然后采用SAS 9.3统计软件中的随机区组设计进行组间差异显著性比较，数据用平均值和均值标准误(SEM)表示，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。

2 结果 2.1 饲粮添加活性干酵母对肉牛营养物质表观消化率的影响

由表 2可知，ADY2组和ADY4组的NDF和ADF表观消化率显著高于对照组(P < 0.05)，但ADY2组和ADY4组之间无显著差异(P>0.05)。各组之间DM、CP和EE表观消化率无显著差异(P>0.05)。

表 2 饲粮添加活性干酵母对肉牛营养物质表观消化率的影响 Table 2 Effects of dietary active dried yeast on nutrient apparent digestibilities of beef cattle

2.2 OTUs比较分析

3个组的OTUs比较韦恩图见图 1。按97%一致性的原则对序列进行聚类，对照组仅鉴定出272个OTUs，ADY2组和ADY4组分别鉴定出了543和527个OTUs。对照组与ADY2组共有17个OTUs，对照组与ADY4组共有63个OTUs，ADY2组与ADY4组共有19个OTUs，3个组共有93个OTUs。

CON：对照组control group；ADY2：ADY2组ADY2 group；ADY4：ADY4组ADY4 group。下图同the same as below. 图 1 OTUs比较韦恩图 Fig. 1 Venn graph of OTUs comparison

2.3 α多样性指数

由图 2可知，ADY2组和ADY4组的Simpson和Shannon指数均极显著高于对照组(P < 0.01)，且ADY2组极显著高于ADY4组(P < 0.01)。ADY2组和ADY4组的Chao1和PD指数均极显著高于对照组(P < 0.01)，ADY2组的PD指数显著高于ADY4组(P < 0.05)，ADY2组的Chao1指数与ADY4组差异不显著(P>0.05)。

*：差异显著(P < 0.05)；* *：差异极显著(P < 0.01)；NS：差异不显著(P>0.05)。 *: significant difference (P < 0.05); * *: extremely significant difference (P < 0.01); no significant difference (P>0.05). 图 2 α多样性指数比较 Fig. 2 α diversity indexes comparison

2.4 主坐标分析(PCoA)

3个组基于Unweighted和Weighted Unifrac距离的PCoA见图 3。Weighted Unifrac距离的PCoA见图 3-A，对照组在纵坐标方向与ADY2组和ADY4组区分开来，主坐标1(PCo1)解释87%的变量。ADY2组和ADY4组的样品相互交叉，不能清晰地区分开。基于Unweighted Unifrac距离的PCoA见图 3-B，3个组的样本组内差异较小因而距离较小，对照组与ADY2组在纵坐标上能够明确区分开，PCo1解释29.4%的变量。对照组与ADY4组在横坐标上能够明确区分开，主坐标2(PCo2)解释16.9%的变量。

图 3 基于Unweighted和Weighted Unifrac距离的PCoA Fig. 3 PCoA based on Unweighted and Weighted Unifrac distance

2.5 UPGMA聚类分析

通过Mothur软件将18个样本进行UPGMA分类树分类，结果见图 4。由图 4-A可知，ADY2组和ADY4组在门水平上在0.2的距离上聚为一类，之后再与对照组在>0.6的距离上进行聚类。由图 4-B可知，在属水平也与门水平相似，ADY2组和ADY4组在属水平上在0.3的距离上聚为一类，之后再与对照组在>0.6的距离上进行聚类。

Ascomycot：子囊菌门；Neocallimastigomycota：新丽鞭毛菌门；Basidiomycota：担子菌门；Mucoromycota：毛霉门；Glomeromycota：球囊菌门；Rozellomycota：隐真菌门；Chytridiomycota：壶菌门；Others其他。Neocallimastix：新美鞭菌属；Orpinomyces：根囊鞭菌属；Candida：念珠菌属；Symbiotaphrina：烟草甲体内共生菌；Priomyces：梨囊鞭菌属；Aspergillus：曲霉菌属；Yarrowia：亚罗酵母属；Macrorhabdus：鹦鹉胃癌酵母菌；Cercospora：尾孢菌属；Rhexocercosporidium：山豆根内生真菌。图 5同the same as Table 5. 图 4 门和属水平上基于Weighted Unifrac距离的UPGMA聚类树 Fig. 4 UPGMA clustering tree based on Weighted Unifrac distance at phylum and genus levels

2.6 瘤胃真菌菌群组成差异变化分析 2.6.1 门水平

从表 3和图 5-A可知，从18个瘤胃样品中共鉴定出7个门，分别是子囊菌门(Ascomycota)、新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、毛霉门(Mucoromycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、隐真菌门(Rozellomycota)和其他真菌门(Fungi_NA)。ADY2和组ADY4组的子囊菌门、新丽鞭毛菌门、担子菌门的相对丰度显著高于对照组(P < 0.05)；ADY2组和ADY4组其他真菌门的相对丰度显著低于对照组(P < 0.05)，且ADY2组显著低于ADY4组(P < 0.05)。

表 3 饲粮添加活性干酵母对肉牛瘤胃菌群门水平相对丰度差异分析 Table 3 Analysis of difference in relative abundance of rumen microflora at phylum level of beef cattle supplemented with active dried yeast

图 5 在门和属水平上真菌的相对丰度 Fig. 5 Relative abundance of fungus at phylum and genus levels

2.6.2 属水平

本试验共鉴定出98个真菌属，表 4列出了相对丰度较高的26个属。由表 4和图 5-B可知，ADY2组和ADY4组未分类真菌属(unclassified_fungi)的相对丰度显著低于对照组(P < 0.05)；ADY2组新丽鞭菌属(Neocallimastix)、根囊鞭菌属(Orpinomyces)和念珠菌属(Candida)的相对丰度显著高于对照组和ADY4组(P < 0.05)，ADY4组与对照组之间差异不显著(P>0.05)。

表 4 饲粮添加活性干酵母对肉牛瘤胃菌群属水平相对丰度差异分析 Table 4 Analysis of difference in relative abundance of rumen microflora at genus level of beef cattle supplemented with active dried yeast

项目 Items	组别 Groups			SEM	P值 P-value
项目 Items	对照 Control	ADY2	ADY4	SEM	P值 P-value
未分类真菌属 Unclassified_fungi	0.636^a	0.041^c	0.209^b	0.062	< 0.001
螺旋藻属 Incertae_sedis	0.111	0.116	0.152	0.013	0.398
新丽鞭菌属 Neocallimastix	0.031^b	0.202^a	0.042^b	0.020	< 0.001
未分类新丽鞭菌科属 Unclassified_Neocallimastigaceae	0.002^c	0.026^b	0.153^a	0.018	< 0.001
根囊鞭菌属 Orpinomyces	0.030^b	0.080^a	0.042^b	0.007	0.004
念珠菌属 Candida Phaeosphaeriaceae_NA	0.022^b	0.085^a	0.036^b	0.007	< 0.001
念珠菌属 Candida Phaeosphaeriaceae_NA	0.012^b	0.042^a	0.032^a	0.004	< 0.001
酵母样共生体 Symbiotaphrina	0.008^b	0.029^a	0.027^a	0.004	0.023
梨囊鞭菌属 Piromyces	0.004^b	0.037^a	0.007^b	0.004	< 0.001
曲霉菌属 Aspergillus	0.008^c	0.024^a	0.013^b	0.002	< 0.001
亚罗酵母属 Yarrowia	0.006^c	0.022^a	0.017^b	0.002	< 0.001
鹦鹉胃癌酵母菌 Macrorhabdus Didymellaceae_NA	0.006	0.015	0.016	0.003	0.243
鹦鹉胃癌酵母菌 Macrorhabdus Didymellaceae_NA	0.005^b	0.015^a	0.013^a	0.002	0.011
尾孢菌属 Cercospora	0.002^b	0.014^a	0.009^a	0.001	0.001
越南槐内生真菌 Rhexocercosporidium	0.002^b	0.011^a	0.008^a	0.001	< 0.001
黑酵母菌 Aureobasidium Polychaeton	0.003^c	0.007^b	0.011^a	0.001	0.006
黑酵母菌 Aureobasidium Polychaeton	0.004	0.007	0.006	0.001	0.071
毛壳菌属 Chaetomium	0.001^b	0.006^a	0.006^a	0.001	0.020
毕赤酵母属 Pichia Cryptotrichosporon Batcheloromyces	0.000	0.011	0.000	0.002	0.114
	0.002^b	0.005^a	0.005^a	0.001	0.018
	0.002^b	0.006^a	0.003^b	0.001	0.017
壳色单隔孢属 Diplodia	0.001^b	0.006^a	0.004^a	0.001	0.001
丛赤壳科 Nectriaceae_NA	0.001^b	0.006^a	0.002^b	0.001	< 0.001
黑孢霉属 Nigrospora	0.003	0.003	0.003	0.001	0.826
青霉菌属 Penicillium	0.001^b	0.003^a	0.003^a	0.000	0.005

3 讨论

直到1975年，Orpin^[12]在绵羊体内发现了带鞭毛的游动孢子，这种孢子具有活动阶段(孢子)和非活动阶段(营养体)，从而正式确认其为严格厌氧的真菌。之所以这么晚才发现真菌可能与研究者对瘤胃液的采集方法有关。一般采用纱布过滤收集瘤胃液作为研究对象，而这样主要获得了游动的孢子，而忽略了瘤胃内容物上附着的大量真菌菌体。此后也有研究表明，瘤胃上皮栖息的菌群对于保持瘤胃健康、提高挥发性脂肪酸的吸收也起着至关重要的作用^[18-19]。本试验则通过采集瘤胃内容物，进而从内容物上通过离心分离获得真菌菌体进行研究。

酿酒酵母在反刍动物中已经成功应用70多年。诸多报道表明，外源添加酵母能够提高饲粮NDF和ADF表观消化率^{[2, 20]}，但也有报道表明，外源添加酵母对饲粮的NDF和ADF等表观消化率没有显著改善^[23-24]。导致不一致结果的主要原因可能是因为不同试验的饲粮结构和动物品种不同。尽管都是反刍动物，奶牛和绵羊的生产目的不同，饲粮结构差异较大，因而瘤胃菌群结构组成大相庭径^[10]。此前对于外源添加活性干酵母提高饲粮纤维消化率的解释则主要集中在瘤胃纤维降解菌方面，如提高了瘤胃产琥珀酸纤维杆菌(Fibrobacter succinogenes)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)等的相对丰度^[25]，提高了瘤胃内纤维降解酶活性^{[10, 26]}，而外源添加活性干酵母对瘤胃真菌组成有何影响则少有涉及^[25]。

OTUs数量是衡量一个生境中菌群多样性的指标。ADY2组和ADY4组的OUTs数量较对照组提高了约1倍，说明饲粮添加活性干酵母促进了瘤胃内真菌的生长。ADY2组和ADY4组的Chao1和PD指数均高于对照组，说明饲粮添加活性干酵母提高了瘤胃内真菌菌群的丰富度。ADY2组的PD指数高于ADY4组，说明饲粮添加2 g/(d·头)活性干酵母提高瘤胃真菌丰富度的效果优于添加4 g/(d·头)。ADY2组和ADY4组的Simpson和Shannon指数均高于对照组，表明饲粮添加活性干酵母改善了瘤胃内真菌组成的均匀度。ADY2组Simpson和Shannon指数高于ADY4组，说明饲粮添加2 g/(d·头)活性干酵母提高瘤胃真菌均匀度的效果也优于添加4 g/(d·头)。饲粮添加活性干酵母影响瘤胃内真菌菌群组成存在显著的剂量效应。

Weighted和Unweighted Unifrac PCoA的结果显示，对照组、ADY2组和ADY4组之间的样品能清晰地分开，进一步说明饲粮添加活性干酵母改变了瘤胃生境中真菌群落组成，使ADY2组和ADY4组能清晰地区别于对照组。对照组的几个样本间的距离较远，而ADY2组和ADY4组内的几个点距离较近，进一步说明饲粮添加外源活性干酵母提高了瘤胃真菌菌群均匀度。此外，Weighted Unifrac PCoA的结果显示，ADY2组和ADY4组也能清晰地区分开，再一次说明饲粮添加活性干酵母影响瘤胃内真菌菌群组成存在显著的剂量效应。对照组、ADY2组和ADY4组之间的样品能清晰区分开的结果在UPGMA聚类图中也体现出来，ADY2组和ADY4组先在较近的距离上聚为一个小分支，再与对照组在较远的距离上进行聚类，说明饲粮添加活性干酵母后的瘤胃真菌组成的相似性更高。

前人的研究表明，滩羊瘤胃中的相对丰度最高的是子囊菌门和新丽鞭毛菌门^[13]，这与本研究中ADY2组的结果相似。但是本研究结果显示，对照组中相对丰度最高(63.6%)的是其他真菌门，而ADY2组的其他真菌门的相对丰度则显著降低至0.041。与此同时，ADY2组子囊菌门、新丽鞭毛菌门和担子菌门的相对丰度显著提高。由此产生的结果是饲粮的NDF和ADF表观消化率提高，说明其他真菌门降解纤维的能力低于子囊菌门、新丽鞭毛菌门和担子菌门。饲粮添加2 g/(d·头)活性干酵母显著提高了将新丽鞭菌属、根囊鞭菌属和念珠菌属的相对丰度，说明新丽鞭菌属、根囊鞭菌属和念珠菌属真菌在降解饲粮纤维成分方面起重要作用^[26]。但是，饲粮添加4 g/(d·头)活性干酵母后其新丽鞭菌属、根囊鞭菌属和念珠菌属的相对丰度则与对照组无显著差异，这再次表明外源饲粮添加活性干酵母对瘤胃内真菌菌群组成存在剂量效应，过高的添加剂量并不利于提高纤维消化率。在本试验条件下，饲粮添加2 g/(d·头)活性干酵母对于改善瘤胃真菌组成最为有利。

4 结论

① 饲粮添加活性干酵母提高了肉牛瘤胃子囊菌门、新丽鞭毛菌门和担子菌门的相对丰度，提高了新丽鞭菌属、根囊鞭菌属和念珠菌属的相对丰度，降低了未分类真菌属的相对丰度。

② 饲粮添加2 g/(d·头)活性干酵母足以改变肉牛瘤胃真菌菌群组成，从而提高饲粮纤维物质表观消化率。

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