2. 甘肃农业大学动物医学院, 兰州 730070
2. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
单宁酸(tannic acid)也称鞣酸，是一种酚类化合物，在多种植物的根、茎、叶等中广泛存在，主要分为水解单宁和浓缩单宁[1]。关于反刍动物摄食过程中添加单宁酸的研究由来已久，因其味涩，易与蛋白质结合，降低动物采食和纤维素酶等的活性，导致养分消化率降低，影响动物生长，在动物营养界一直被认为有抗营养作用[2-3]，但近些年来有研究表明单宁酸对动物也具有营养作用，比如抗腹泻、抗氧化、抗菌和抗病毒等作用[4-7]，尤其对反刍动物的生长性能具有积极作用[8]，而2种作用的体现取决于它们的添加剂量。相关研究表明，饲粮中添加适量的单宁酸既能促进幼龄动物生长、提高免疫力、改善健康状态，同时可以提高饲粮中养分的表观消化率[9]；此外，还会增加蛋白质的利用效率，一般添加量不超过5%时能够有效保护饲粮中的蛋白质成分免受瘤胃微生物的降解[10-11]。但若单宁酸添加量过高则会降低适口性和采食量，抑制瘤胃微生物的生长，甚至引起中毒现象。目前研究单宁酸对于幼龄动物的影响基本集中在单胃动物上。Liu等[12]研究发现，饲粮中添加0.2%的栗木单宁可以缓解热应激对肉仔鸡生长性能的负面影响。Rezar等[13]研究发现，饲粮中添加0.2%的栗木单宁酸能显著增加肉仔鸡粪干物质含量，减少腹泻的发生。孙展英等[14]也报道，饲粮中添加0.1%的单宁酸可降低仔猪的腹泻率。而单宁酸对于幼龄反刍动物的研究尚不多见。另外，食品的营养品质是消费者最关心的问题，肉中脂肪酸的组成与含量是影响肉品质的重要指标，尤其是不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)的含量，富含不饱和脂肪酸的肉品对人体非常有益。但在反刍动物产品，如奶和肉中，饱和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)含量较高，单宁酸对肌肉脂肪酸组成是否存在影响鲜有报道。因此，本试验旨在探究在代乳粉中添加0.2%单宁酸对湖羊羔羊生长性能、养分表观消化率、器官生长发育以及肌肉脂肪酸组成的影响，为提高羔羊生长性能、改善肉品质提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计及动物采用对照试验设计。从甘肃金昌中天羊业有限公司选取健康、生长发育正常的7日龄湖羊公羔(双羔)30只，随机分为2个组(对照组和单宁酸组)，每组15只，每只为1个重复，保证羔羊7日龄体重[对照组：(4.09±0.66) kg；单宁酸组：(3.89±0.62) kg]组间无显著差异(P>0.05)。试验期共21 d，在羔羊28日龄时结束饲养试验，并从每组随机选择8只羔羊进行屠宰。
1.2 饲养管理初生羔羊随母羊哺乳，在4日龄时所有羔羊与母羊分离，开始使用奶瓶人工训饲代乳粉。羔羊在7日龄时随机分入对照组和单宁酸组，所有羔羊采用单笼饲养。试验期间，对照组羔羊饲喂专用代乳粉(北京精准动物营养研究中心，营养水平见表 1)，单宁酸组羔羊则饲喂在对照组代乳粉基础上添加0.2%单宁酸(纯度为98%)的代乳粉。代乳粉饲喂量为羔羊体重的2%，饲喂时用温水冲泡，水与代乳粉的比例为5 ∶ 1，每天饲喂4次(06:00、12:00、18:00和24:00)。试验期间羔羊自由饮水。
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表 1 代乳粉营养水平(干物质基础) Table 1 Nutrient levels of milk replacer (DM basis) |
在试验第7、14、21、28天晨饲前进行称重，根据各生长日龄始末体重值计算平均日增重。每天详细记录羔羊代乳品采食量和剩余量，计算平均日采食量。每日观察羔羊粪便，记录腹泻发生情况，计算腹泻率。
1.3.2 养分表观消化率计算试验第14、21、28天晨饲前收集羔羊的粪样，记录粪总重后，一份按10%取样后放入65 ℃烘箱中烘48 h，室温下回潮24 h称重记录重量，装入自封袋带回试验室；另取100 g鲜粪加入10%硫酸进行固氮。将收集的粪样粉碎过40目筛，测定养分含量。
代乳粉与粪样中干物质(dry matter，DM)含量参照GB/T 6435—2014中方法测定，粗脂肪(ether extract，EE)含量参照GB/T 6433—2006中方法测定，粗蛋白质(crude protein，CP)含量参照GB/T 6432—2018中方法测定，钙(calcium，Ca)含量参照GB/T 6436—2018中方法测定，磷(phosphorous，P)含量参照GB/T 6437—2018中方法测定。
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屠宰后，依次将羔羊皮长和宽、头重、蹄重、胴体重和各个内脏器官重量进行测定，计算器官指数。
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采集屠宰羊的背最长肌和肱二头肌，各采集3份，用自封袋包装编码标记，于-80 ℃贮存。
参照Folch等[15]方法对肌肉样品进行前处理：将样品在室温下解冻后分离肌肉和脂肪，置于研钵中用液氮研磨，然后称取1 g样品于15 mL离心管中，加入0.7 mL的10 mol/L氢氧化钾溶液和5.3 mL无水甲醇，并放置在55 ℃水浴锅中1.5 h，同时每20 min振摇试管5 s，水浴结束后在自来水下冷却到室温，再加入0.5 mL的12 mol/L硫酸溶液，继续55 ℃恒温水浴，每20 min振摇试管5 s，1.5 h后取出试管用自来水冷却至室温，接着加入3 mL正己烷到离心管，3 000 r/min离心5 min，将上清液过滤到样品瓶中，于-20 ℃保存待测。
采用安捷伦(Agilent)6890N型气相色谱仪测定肌肉中各脂肪酸含量。色谱柱为SP-2560毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)，进样量1.0 μL。色谱条件：进样口检测器温度分别为220和250 ℃，氮气流量1.2 mL/min，分流比100 ∶ 1；程序升温模式：初温140 ℃保持5 min，然后以2 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以6 ℃/min升至230 ℃，保持20 min。
1.4 数据处理与分析试验数据用Excel 2016进行初步整理，并使用统计软件SPSS 22.0对数据进行独立样本t检验，以P < 0.01表示差异极显著，P≤0.05表示差异显著，0.05<P≤0.10表示差异具有显著趋势。
2 结果 2.1 单宁酸对湖羊羔羊生长性能的影响由表 2可知，与对照组相比，在代乳粉中添加0.2%的单宁酸极显著提高了羔羊在14~28日龄的平均日采食量(P < 0.01)；虽然2组羔羊在7~14日龄的平均日增重无显著差异(P>0.05)，并且在21~28日龄体重出现负增长情况，但是在代乳粉中添加0.2%的单宁酸极显著提高了羔羊在14~21日龄的平均日增重(P < 0.01)，且显著提高了试验全期(7~28日龄)的平均日增重(P < 0.05)。此外，代乳粉中添加0.2%的单宁酸后羔羊腹泻率极显著低于对照组(P < 0.01)。
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表 2 单宁酸对湖羊羔羊生长性能的影响 Table 2 Effects of tannin acid on growth performance of Hu lambs |
由表 3可知，与对照组相比，在代乳粉中添加0.2%的单宁酸显著或极显著降低了7~14日龄的DM和EE采食量和排出量(P < 0.05或P < 0.01)，显著或极显著提高了14~28日龄的DM和EE采食量(P < 0.05或P < 0.01)，从而极显著提高了7~28日龄的DM和EE表观消化率(P < 0.01)。
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表 3 单宁酸对湖羊羔羊DM和EE表观消化率的影响 Table 3 Effects of tannic acid on apparent digestibility of DM and EE of Hu lambs |
由表 4可知，与对照组相比，在代乳粉中添加0.2%的单宁酸显著低了7~14日龄的CP、P采食量(P < 0.05)，显著提高了14~28日龄的CP采食量、14~21日龄的P采食量(P < 0.05)，极显著增加了21~28日龄的CP排出量(P < 0.05)，极显著降低了整个试验期的P排出量(P < 0.01)，从而使得7~28日龄的P表观消化率极显著升高(P < 0.01)，21~28日龄的CP表观消化率显著降低(P < 0.05)。与对照组相比，单宁酸组7~14日龄的Ca采食量有降低的趋势(P=0.058)，21~28日龄的Ca采食量与排出量均显著升高(P < 0.05)，但各阶段Ca表观消化率均无显著变化(P>0.05)。
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表 4 单宁酸对湖羊羔羊CP、Ca和P表观消化率的影响 Table 4 Effects of tannic acid on apparent digestibility of CP, Ca and P of Hu lambs |
由表 5可知，与对照组相比，代乳粉中添加0.2%的单宁酸使羔羊肺脏重量极显著升高(P < 0.01)，头重量有提高的趋势(P=0.060)，蹄指数极显著降低(P < 0.01)；另外，单宁酸组羔羊皮长显著高于对照组(P < 0.05)。
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表 5 单宁酸对湖羊羔羊器官生长发育的影响 Table 5 Effects of tannic acid on organ growth and development of Hu lambs |
由表 6可知，与对照组相比，在代乳粉中添加0.2%的单宁酸显著降低了羔羊背最长肌中硬脂酸(C18 ∶ 0)的含量(P < 0.05)，显著增加油酸(C18 ∶ 1n9c)(P < 0.05)和多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的含量(P=0.05)，极显著增加PUFA/SFA值(P < 0.01)，有降低辛酸(C6 ∶ 0)(P=0.068)以及提高肉豆蔻酸(C14 ∶ 0)(P=0.067)、UFA(P=0.060)和单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)含量(P=0.060)的趋势。由表 7可知，与对照组相比，在代乳粉中添加0.2%的单宁酸仅显著升高了羔羊肱二头肌中二十碳三烯酸(C20 ∶ 3n3)的含量(P < 0.05)，而对其他脂肪酸含量无显著影响(P>0.05)。
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表 6 单宁酸对湖羊羔羊背最长肌脂肪酸组成的影响 Table 6 Effects of tannic acid on fatty acid composition of longissimus dorsi of Hu lambs |
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表 7 单宁酸对湖羊羔羊肱二头肌脂肪酸组成的影响 Table 7 Effects of tannic acid on fatty acid composition of biceps brachii of Hu lambs |
羔羊的采食量和日增重都与生长性能具有密切的关系，也是对养分摄入、消化、吸收和沉积的最终体现[16-17]。单宁酸对动物生长性能的影响一直存在争议，其影响取决于多个因素，包括单宁酸纯度和化学成分、基础饲粮、动物种类和代谢状况等[18]。肖杰等[19]研究发现，饲喂0.1%的单宁对湖羊平均末重和平均日增重有促进作用，但作用效果不显著。李志威等[20]研究发现，饲喂百脉根单宁(单宁含量为1.45%)对湖羊的平均日增重没有显著影响，但添加单宁组的平均日增重高于对照组。薛树媛[21]的研究显示，在饲粮中添加2.0%的单宁酸可以显著提高绵羊的平均日增重，而添加1.0%和3.5%的单宁酸对其无显著影响。丁鑫[22]的研究显示，添加0.3%的栗木单宁(水解单宁含量为76%)显著提高了1~21 d和64~90 d这2个阶段的平均日增重。本试验中，在代乳粉中添加0.2%的单宁酸可以显著提高湖羊羔羊14~28日龄的平均日采食量和14~21日龄的平均日增重，可能与单宁酸有助于提高羔羊十二指肠和空肠的养分吸收能力[23]、降低肠蠕动、降低食糜通过小肠的速度、提高饲料消化率等有关[24]。2组湖羊羔羊21~28日龄的平均日增重均出现负增长，可能是因为该阶段羔羊胃肠道处于快速发育时期，瘤胃微生物区系的建立需要固体饲料的刺激和能量提供，而本试验中羔羊只饲喂代乳品，没有固体饲料的饲喂，所以导致羔羊生长受到限制[25]。对于腹泻率，在本试验中，与对照组相比，在代乳粉中添加0.2%的单宁酸显著降低了湖羊羔羊的腹泻率。在畜禽试验研究中发现，单宁酸能够有效抑菌和杀灭病毒，能有效抑制多种植物源和动物源病原体[14]。另外，产生细胞毒素是细菌引起腹泻的主要原因之一，单宁酸能阻断细菌与肠道结合的受体，在肠道内形成一个保护层，抑制细菌的感染，使得引起腹泻的毒素失去作用，减轻刺激肠蠕动，从而降低腹泻率[26]。单宁酸的抗菌特性对反刍动物的肠道寄生虫也有一定抑制作用[27-28]。Ren等[29]研究发现，单宁酸可以降低肠道通透性，减少因肿瘤坏死因子诱导的上皮屏障功能受损，进而减少腹泻的发生。羔羊腹泻的改善可能与单宁酸抗菌、抗炎等作用对肠道结构和功能的改善有关，促进养分消化，进而提高羔羊的生长性能。
3.2 单宁酸对湖羊羔羊养分表观消化率的影响单宁能与蛋白质结合，保护蛋白质不受瘤胃降解的影响，这种保护作用对蛋白质比对DM或其他营养物质更有效[30]。在本研究中，代乳粉中添加0.2%的单宁酸能提高DM、EE和P的表观消化率，降低21~28日龄的CP表观消化率。Zhao等[31]在湖羊的试验中也发现单宁酸增加了DM消化率，与本研究结果一致。但也有研究已表明，添加单宁酸会降低反刍动物DM消化率[32]。潘发明等[33]研究显示，在饲粮中添加不同水平的单宁酸对羯绵羊的Ca消化率无显著影响，这与本试验结果相一致，本试验结果显示在代乳粉中添加0.2%的单宁酸对湖羊羔羊的Ca表观消化率无显著影响，但另有研究显示五倍子单宁酸有增加断奶仔猪的Ca表观消化率的趋势[34]。上述研究结果不一致可能归因于单宁酸的来源不同，导致单宁酸与碳水化合物结合的能力差异很大。本试验中湖羊羔羊CP表观消化率降低的结果与许多已有研究报道相似，Zhao等[31]研究显示，饲粮中添加0.1%的单宁酸降低了湖羊的CP消化率。王敬尧等[11]在绵羊体外发酵试验中发现，添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的单宁酸能显著降低CP降解率。同样，饲粮中添加白坚木单宁提取物降低了肉牛的CP表观消化率[30]。Min等[35]也认为，单宁酸会增加过瘤胃蛋白质量，降低瘤胃消化所需蛋白质。有研究认为CP表观消化率的降低可能是因为在瘤胃中单宁与蛋白质形成难以消化的复合物，抑制瘤胃微生物对蛋白质的降解，从而降低蛋白质的消化率[1]。另外，在本试验中，由于羔羊在试验期间饲喂液态代乳粉，对胃肠道缺乏有效物理刺激，导致胃肠道发育滞缓，尤其是瘤胃和皱胃功能发育不完善，导致流入十二指肠的可消化蛋白质数量减少[23]。
3.3 单宁酸对湖羊羔羊器官生长发育的影响动物器官重量及指数是衡量动物机体发育情况的重要指标之一，机体功能可以由器官重量近似反映，动物营养状况和生理状态可以通过器官指数获得，对理论研究和生产实践有重要意义[36]。本试验中，虽然添单宁酸组的肺脏重量显著高于对照组，但是其指数(即占宰前活重的比例)2组间差异不显著，其他器官重量与指数均无显著差异，说明在代乳粉中添加0.2%的单宁酸对湖羊羔羊器官生长发育无不良影响。
3.4 单宁酸对湖羊羔羊肌肉脂肪酸组成的影响本研究中，在湖羊羔羊背最长肌与肱二头肌中共检测出32种脂肪酸，各脂肪酸含量基本一致，其中含量较高的脂肪酸是C18 ∶ 1n9c、棕榈酸(C16 ∶ 0)和C18 ∶ 0，这与陈雪君等[37]的研究结果一致。进一步比较发现，背最长肌与肱二头肌中C18 ∶ 1n9c含量最高，其次是C16 ∶ 0，C18 ∶ 0含量较低。研究认为肉的风味受脂肪酸种类和含量的影响[38]，羊肉膻味与C18 ∶ 0的含量有关，特别是当皮下脂肪中C18 ∶ 0含量高时会造成羊肉膻味的加重[39]，羊肉风味与UFA中的C18 ∶ 1n9c和亚麻酸(C18 ∶ 3n)关系密切[40]。添加单宁酸后，C18 ∶ 1n9c在羔羊背最长肌和肱二头肌中的含量分别为48.465%和46.293%，其中背最长肌中C18 ∶ 1n9c的含量显著高于对照组，而背最长肌中C18 ∶ 0的含量显著低于对照组。由C18 ∶ 0含量降低与C18 ∶ 1n9c含量升高可知单宁酸能够降低羊肉膻味，具有影响羊肉风味的潜力。另外，有关报道认为，饮食中的脂肪酸影响人体血脂和血胆固醇，SFA含量增加会引起血脂升高，进而有引起冠状动脉硬化的潜在危险，而PUFA有降低血胆固醇的作用[41-42]。PUFA/SFA值通常用来衡量肉品质，羊肉的PUFA/SFA值一般为0.10~0.26[43]。本试验中，单宁酸组湖羊羔羊背最长肌中PUFA含量和PUFA/SFA值与对照组相比显著增加，PUFA/SFA值为0.192，处于0.10~0.26。Vasta等[44]指出，在精料或牧草中添加单宁能使羔羊肉中PUFA含量升高、SFA含量降低，与本试验结果一致。但从人类营养学角度看，湖羊羔羊背最长肌中PUFA/SFA值还达不到营养学建议值(≥0.4)。由于单宁酸对羔羊肌肉脂肪酸组成影响的相关研究较少，关于单宁酸羔羊肌肉脂肪酸组成的影响还需进一步验证。
4 结论在湖羊羔羊代乳粉中添加0.2%的单宁酸可以提高采食量和增重，降低腹泻率，对器官生长发育无不良影响，并影响背最长肌中UFA含量。虽然0.2%的单宁酸对湖羊羔羊21~28日龄CP表观消化率有负面影响，但可以促进其他养分的消化。
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