2. 城步羴牧牧业有限公司, 邵阳 422500
2. Chengbu Shanmu Animal Husbandry Co., Ltd., Shaoyang 422500, China
近年来，随着生活水平的提高和对食品安全问题的重视，人们越来越关注抗生素在畜禽产品中的残留问题。当前，世界各地已基本达成禁止在饲粮中添加促生长类抗生素的共识，我国已发布相关法令，自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。为了畜牧业的可持续发展，保障食品安全和动物健康，开发利用绿色、安全、高效的饲用抗生素替代品已经成为当下畜牧研究的热点与重要方向。血根碱(C20H14NO4)是一种从博落回等植物中提取出来的苯菲啶异喹啉类生物碱，提纯固体呈红黄色粉末状，相对分子质量为332，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种生物学活性[1]。目前，血根碱在畜牧生产中的应用研究已有一定进展，国内外相关研究表明，饲粮中添加血根碱具有调节动物肠道功能、增强机体免疫和抗氧化能力、提高畜禽生产性能及改善畜产品质量等功效[2-6]。但是关于血根碱的应用研究大多数都是在单胃动物上进行，在反刍动物上的相关研究还鲜有报道，饲粮中添加血根碱能否提高奶山羊的生产性能、改善机体抗氧化和免疫功能还不清楚。因此，本研究拟在奶山羊饲粮中添加血根碱，探讨其对奶山羊生产性能、抗氧化和免疫功能的影响，为血根碱在奶山羊上的应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点试验于2020年5月25日至2020年8月20日在湖南省邵阳市城步县某奶山羊牧场进行。
1.2 试验材料血根碱制剂为博落回提取物，其活性成分为苯菲啶异喹啉类生物碱(血根碱含量≥0.15%)，由湖南某生物资源有限公司提供。
1.3 试验设计选择24头胎次[(2.4±0.3)胎]、泌乳日龄[(192±5)日龄]、产奶量[(1.55±0.12) kg]、体重[(54.96±3.48) kg]相近的西农萨能奶山羊，随机分成2组，每组12头。对照组饲喂全混合日粮，血根碱组饲喂全混合日粮+400 mg/kg血根碱。血根碱添加量参考Wang等[7]和Estrada-Angulo等[8]的试验结果。试验期52 d，其中预试期10 d，正试期42 d。
1.4 试验饲粮试验饲粮参照NRC(2007)奶山羊标准进行设计，其组成及营养水平见表 1。试验采用全混合日粮饲喂方式。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
试验羊采用小栏饲养，每组12头，随机分为4栏饲喂，每栏3头。每天分别于08:00及16:30饲喂，保证每栏有5%剩料。每天分别于07:00及18:00挤奶。自由饮水和自由采食，消毒、免疫等按羊场常规程序进行。
1.6 样品采集及指标测定 1.6.1 生产性能测定正试期开始后，每天记录每头试验羊的产奶量，用于测定平均日产奶量。
正试期以栏为单位每天记录试验羊的平均喂料量和剩料量，用于测定干物质采食量。饲料转化率计算公式如下：
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正试期每周采用四分法收集1次对照组和血根碱组饲粮样和剩料样各500 g，称重后在65 ℃鼓风烘箱中烘48 h，测定初水分含量，测定后粉碎，过40目筛用于测定常规养分含量。参照GB/T 6435—2014的方法测定干物质(DM)含量，参照GB/T 6432—2018的方法测定粗蛋白质(CP)含量，参照GB/T 6433—2006的方法测定粗脂肪(EE)含量，参照GB /T 6438—2007的方法测定粗灰分(Ash)含量，参照GB/T 6436—2018的方法测定钙(Ca)含量，参照GB/T 6437—2018的方法测定总磷(TP)含量，参照GB/T 6434—2006的方法测定中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量。
1.6.3 血样采集与测定正试期第21和42天晨饲前，使用一次性真空采血管进行颈静脉采血，每头羊采集血样10 mL，其中5 mL注入普通真空采血管，离心(633×g，15 min)后，用移液枪取上清液并分装到至1.5 mL离心管，-20 ℃冰箱保存，用于测定血清抗氧化和免疫指标。剩余5 mL注入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管4 ℃保存，2 h内测定血细胞参数。
采用试剂盒法测定血清总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)含量。ELISA试剂盒购自江苏雨桐生物科技有限公司。
使用全自动五分类血细胞分析仪(光电MEK-7222K，日本)测定血液白细胞(white blood cell，WBC)、中性粒细胞(neutrophil，NEUT)、淋巴细胞(lymphocyte，LYMPH)、单核细胞(monocytes，MONO)、嗜酸性细胞(oxyphil cell，EO)、嗜碱性细胞(basophil，BASA)、红细胞(red blood cell，RBC)数量。
1.7 数据处理与分析试验数据使用Excel 2010进行初步整理后，利用SAS 9.4软件进行统计学分析，统计结果用最小二乘法均值和均值标准误(SEM)表示。生产性能数据进行正态分布检验后，使用独立样本t检验分析。
血液指标数据使用PROC MIXED模型进行数据统计分析，不同的采样日期(第21天和第42天)测定结果视为重复，以试验羊为随机因素，试验处理、采样日期、试验处理与采样日期互作为固定因素。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。
统计分析模型：Yijk＝μ+Ti+Dj+Ti×Dj+Gk+εijk。
式中：Yijk为因变量；μ为总体均值；Ti为处理(i=1，2)，固定效应；Dj为采样日期(j＝21，42)，固定效应；Ti×Dj为处理和采样日期的交互作用，固定效应；Gk(k=1, 2, 3, …, 24)为试验奶山羊，随机效应；εijk为变量i、j、k的随机误差。
2 结果 2.1 血根碱对奶山羊生产性能的影响由表 2可知，与对照组相比，血根碱组的产奶量显著提高了8.3%(P < 0.05)。2组之间干物质采食量和饲料转化率无显著差异(P>0.05)。
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表 2 血根碱对奶山羊生产性能的影响 Table 2 Effects of sanguinarine on performance of dairy goats |
由表 3可知，血根碱组的血清MDA含量极显著低于对照组(P < 0.01)，血清GSH-Px活性和T-AOC极显著高于对照组(P < 0.01)。2组之间血清SOD活性无显著差异(P>0.05)。
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表 3 血根碱对奶山羊血清抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of sanguinarine on serum antioxidant indexes of dairy goats |
由表 4可知，血根碱组的血液WBC数量显著高于对照组(P < 0.05)，血液NEUT数量极显著高于对照组(P < 0.01)。2组之间血液LYM、MONO、EO、BASO和RBC数量无显著差异(P>0.05)。
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表 4 血根碱对奶山羊血细胞参数的影响 Table 4 Effects of sanguinarine on blood cell parameters of dairy goats |
由表 5可知，血根碱组的血清IL-2和IgG含量显著高于对照组(P < 0.05)，血清IL-4和IgA含量极显著高于对照组(P < 0.01)。2组之间血清TNF-α、IL-6、IL-8和IgM含量无显著差异(P>0.05)。
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表 5 血根碱对奶山羊血清免疫指标的影响 Table 5 Effects of sanguinarine on serum immune indexes of dairy goats |
血根碱作为一种绿色、安全、高效的饲用抗生素替代品，可以在动物体内分解代谢为无潜在危害的二氢血根碱(C21H17NO5)，并且在机体内不会被重新氧化成血根碱[10-11]，没有耐药性和残留的风险，可在畜禽饲粮中长期添加。近年来，国内外已有较多研究表明，血根碱可以改善畜禽的生产性能。Abudabos等[5]研究发现，血根碱可以改善沙门氏菌感染的肉鸡的生长性能和肠道健康。Liu等[6]研究发现，饲粮中添加血根碱可改善1~28日龄黄羽肉鸡的肠道形态和微生物群落结构，从而提高其生长性能。Chen等[4]研究发现，血根碱可以作为抗生素的潜在替代品，对断奶仔猪的生长性能、免疫状况、抗氧化能力和肠道健康都有一定的促进作用。产奶量的变化可以有效反映奶畜的生产性能和健康状况。在本试验中，与对照组相比，饲粮中添加血根碱能够显著提高奶山羊的产奶量，改善生产性能。其可能的原因是，血根碱具有抗炎和抗菌作用，能够改善肠道形态和微生物群落结构[4-5, 12]，提高生产性能；或者是血根碱可以增强机体的抗氧化和免疫功能[2, 13-14]，保护肠道和乳腺的屏障功能，提高生产性能；也有可能是多种效果同时发挥作用，改善动物的生产性能。
3.2 血根碱对奶山羊抗氧化功能的影响奶畜在泌乳期乳腺组织的营养代谢非常旺盛，容易产生较多的自由基，而过量的自由基会打破机体内的氧化动态平衡，导致细胞内蛋白质、脂质等大分子物质过氧化，造成氧化损伤[15]。T-AOC是反映机体抗氧化系统综合能力的指标[16]；T-SOD和CSH-Px是机体清除自由基、对抗氧化应激、保护细胞膜结构和功能完整的特异性酶[17]；MDA是脂质过氧化代谢的终产物，能够间接地反映细胞损伤的程度[18]。Bavarsadi等[19]研究发现，在蛋鸡饲粮中添加血根碱可以降低血清MDA含量，提高机体抗氧化功能。张卫兵等[20]研究表明，在犊牛饲粮中添加血根碱具有改善犊牛机体抗氧化功能的效果。在本试验中，饲粮中添加血根碱能够极显著降低奶山羊血清MDA含量，极显著提高血清T-AOC和CSH-Px活性，改善机体抗氧化功能。可能的原因是血根碱通过抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶复合物的活性[21-22]，减少机体自由基的产生，从而发挥其抗氧化能力。
3.3 血根碱对奶山羊血细胞参数的影响动物机体发挥正常的免疫功能需要保证免疫细胞结构和功能的完整，WBC是包括MONO、粒细胞和LYMPH在内的发挥非特异性免疫功能的血细胞[23]；NEUT具有运动和吞噬功能，发挥非特异性防御和保护作用，可以吞噬并杀灭入侵体内的细菌、病毒等异物，它在血液中占WBC总数的50%左右，其增加或减少会直接影响WBC数量的变化[24]。在本试验中，2组奶山羊的血细胞参数均在正常范围内[25]；且与对照组相比，血根碱组的WBC数量显著增加，NEUT数量极显著增加，由此推测饲粮中添加血根碱能一定程度上提高奶山羊的非特异性免疫功能。可能的原因是血根碱具有较好的免疫增强作用，能够保护免疫细胞膜的结构和功能的完整，激活免疫细胞的相关功能[26]，同时结合本试验中血清抗氧化和免疫指标发现，血根碱可以提高奶山羊的抗氧化功能，增加血清IL-2、IL-4、IgG和IgA含量，改善免疫功能，保护机体健康，但是具体作用机制还不清楚，需要进一步探究。
3.4 血根碱对奶山羊免疫功能的影响白细胞介素是一种由多种细胞产生的与炎症通路和免疫调节相关的生物活性物质[27]。IL-2具有促进LYMPH生长、增殖和分化，调节机体免疫应答和抗病毒等多种生物活性；IL-4可以刺激活化B细胞和T细胞，调节体液免疫[28]。在本试验中，饲粮中添加血根碱可以显著提高奶山羊血清IL-2含量，极显著提高血清IL-4含量，改善奶山羊的免疫功能，保护机体健康。其原因可能是血根碱具有很强的抗炎活性，能够抑制核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的活化，发挥抗炎作用[19]。
免疫球蛋白是由B淋巴细胞增殖分化产生的免疫活性物质，主要包括IgA、IgM、IgG，能够抵御细菌、病毒等病原体入侵，是体液免疫的重要组成部分[29]。目前，大多数研究表明，饲粮中添加血根碱可以提高机体免疫球蛋白含量，改善免疫功能[30-32]；但也有相关研究表明，饲粮中添加血根碱会产生免疫抑制，降低机体免疫球蛋白含量[20]。可能的原因是血根碱产品的添加量与有效活性成分含量不同使试验结果产生差异，或者是试验动物的种类、生理阶段等不同导致试验结论不一致。这提示血根碱是能替代抗生素应用于生产实践的，但是要全面替代抗生素，在动物生产上大规模推广应用，还需要进行大量完整、系统地研究，确定不同动物种类与生理阶段的适宜添加方式与添加量。在本试验中，饲粮中添加血根碱可以显著提高血清IgG含量，极显著提高血清IgA含量，对血清IgM含量无显著影响。由此推测血根碱可以通过调节免疫球蛋白的分泌，增强奶山羊的体液免疫应答，提高免疫力，抵御外界病原体的入侵。
4 结论在本试验条件下，饲粮中添加血根碱可以提高奶山羊产奶量，改善机体的抗氧化和免疫功能。
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