随着我国经济实力的提升和人们现代消费观念的更新，以及人口结构老龄化问题的加剧，导致我国饲养宠物的家庭不断增长，促进了宠物行业的高速发展，预计2022年宠物食品市场规模将突破千亿[1]。犬是各种宠物食品行业发展的基础品种[2]，犬粮的生产不仅是为了满足犬类基础的生长发育需要，也要为犬类提供富含营养并促进健康的成分。近年来，我国宠物食品企业从原料选择、研发生产到品质控制发展迅速，越来越接近国际化标准[3]。但是在犬饲养过程中，经常会由于饲养管理不当、饲粮营养供给过多或不足引起犬的营养性代谢疾病发生。因此，在日常生活中必须根据其处于不同生理阶段的营养需要，进行科学喂养，提升犬的免疫力，避免发生营养性代谢疾病，保证其健康生长。
左旋肌肽(L-carnosine)是由β-丙氨酸和L-组氨酸组成，是广泛存在于多种脊椎动物骨骼肌和大脑中的内源性二肽[4]。左旋肌肽可以有效清除自由基，提高机体抗氧化能力；可以与体内的活性物质反应，保护蛋白质不被糖基化，同时左旋肌肽可以与已经发生糖基化的蛋白质产物作用，阻止糖基化蛋白质的进一步交联[5]，改善脑组织的能量代谢[6]，治疗或预防蛋白质稳态受损导致的疾病[7]；还具有抑制谷氨酸诱导细胞凋亡的能力[8]，有效保证肝脏和肾脏的生理功能[9]，还有改善大鼠代谢综合征的作用[10]。基于肌肽的良好应用前景，世界各国的科研机构对肌肽的研究投入也在逐年增长，我国目前对于左旋肌肽提取工艺的研究已较成熟，但对于左旋肌肽的成分分析、在动物机体内的生化代谢机理仍需进一步研究[11]。目前关于左旋肌肽的研究大多数局限于医学疾病领域研究，在宠物饲粮方面的实际应用亦较为罕见。因此，本试验旨在通过犬粮中添加左旋肌肽，研究其对中华田园犬生长性能、血清生化指标及抗氧化能力、消化代谢等的影响，从而为进一步了解左旋肌肽的生理功能及药理作用提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验选用24只3月龄、相同饲喂水平的健康中华田园犬(购于杨柳青宠物贸易市场)，其中8只雄性，16只雌性，体重为(3.68±1.03) kg。按照性别和体重将24只中华田园犬随机分为4组，每组6只犬(雄犬2只，雌犬4只)，每组6个重复，每个重复1只。对照组(C组)饲喂基础饲粮，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组饲喂在基础饲粮中分别添加300、600和900 mg/kg左旋肌肽的试验饲粮。预试期7 d，各组犬均统一饲喂基础饲粮(全价饲粮)，使其适应本试验所配制的饲粮。正试期28 d，
1.2 试验饲粮按照美国饲料管理协会(AAFCO)以及GB/T 31216—2014中幼犬营养需要标准，科学配制基础饲粮，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
中华田园犬饲养于天津农学院西校区实验动物中心。试验开始之前，先对圈舍内栅栏、地面及喂食饮水器具进行清洗消毒，采用甲醛-高锰酸钾熏蒸法对整个圈舍进行48 h封闭消毒处理。每天08:30、13:20、18:00定时饲喂，自由饮水；每天打扫舍内卫生，清理笼内粪便，每隔2 d用高压水枪冲洗整个圈舍，保持舍内干净卫生，所有的中华田园犬均进行正常免疫程序。
1.4 测定指标和方法 1.4.1 生长性能测定对中华田园犬采食不限量。每天记录各组的采食量，并计算平均日采食量。计算公式如下：
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在正试期第0(试验当天)、7、14、21、28天为每只中华田园犬称量体重并计算中华田园犬的平均日增重。计算公式如下：
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料重比计算公式如下：
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由5位测评人员对中华田园犬进行感观评定，参照犬只等级评定及犬属性等级判断标准制定出中华田园犬感官评分标准，见表 2。
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表 2 中华田园犬感观评价标准 Table 2 Sensory evaluation criteria of Canis lupus familiaris[12] |
粪便采集分别在正试期的第24~28天的上午投食完后进行。对采集完新鲜粪便进行拍照保存(图 1)，再根据WALTHAMTM犬粪便评分体系(The WALTHAMTM Faeces Scoring System[13])的标准对中华田园犬的粪便进行质量评定。
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C：对照组control group; Ⅰ: Ⅰ组group Ⅰ; Ⅱ: Ⅱ组group Ⅱ; Ⅲ: Ⅲ组group Ⅲ。 图 1 不同添加量左旋肌肽组中华田园犬粪便形态图 Fig. 1 Morphology of feces of Canis lupus familiaris in different additive amount of L-carnosine groups |
在正试期第24~27天上午喂食后，收集每组中华田园犬2 h内的新鲜粪便，而后立即放入-20 ℃冰箱内保存，将这4 d收集的粪便每组混匀后放入65 ℃烘箱烘干，用粉碎机将烘干后的样品粉碎，测定干物质(GB/T 6435—2014)、粗蛋白质(GB/T 6432—2018)、粗脂肪(GB/T 6433—2006)、粗灰分(GB/T 6438—2007)、钙(GB/T 6436—2018)、磷(GB/T 6437—2018)含量，再采用内源指示剂法(盐酸不溶灰分作指示剂)测定养分表观消化率。计算公式如下：
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式中：a为饲粮中某元素含量(%)；b为粪中相应元素含量(%)；c为饲粮中盐酸不溶灰分含量(%)；d为粪中盐酸不溶灰分含量(%)。
1.4.5 D-木糖吸收试验在正试期第28天，中华田园犬空腹12 h后按照每千克体重灌服10% D-木糖溶液5 mL，1 h后前肢静脉采血3 mL，37 ℃恒温放置15 min后，4 000×g离心10 min，分离全血取上清液，测定各组血清中D-木糖含量。
1.4.6 血清生化指标测定在正试期第28天，对中华田园犬前肢静脉采血，采血前禁食12 h。采用前肢静脉采血法，采血5 mL，37 ℃恒温放置15 min，离心10 min(4 000×g)分离血清，然后将血清放在-80 ℃的冰箱里保存，备用。使用全自动血液生化分析仪测定血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性及肌酐(CRE)、尿素(Urea)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)含量。
1.4.7 血清免疫球蛋白含量测定取前述采集的血清，采用英科新创(厦门)科技股份有限公司提供的试剂盒测定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M (IgM)、免疫球蛋白G (IgG)含量，严格按照说明书进行操作。
1.4.8 血清抗氧化能力指标测定取前述采集的血清，采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定血清中总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，严格按照说明书进行操作。
1.5 数据处理与分析数据采用“平均值±标准误”表示，经Excel 2010整理后，使用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，同时采用Duncan氏法进行多重比较，P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 左旋肌肽对中华田园犬生长性能和感官评定的影响 2.1.1 左旋肌肽对中华田园犬生长性能的影响由表 3可知，平均日增重和平均日采食量都与左旋肌肽添加量成反比，C组的平均日增重及平均日采食量均显著高于Ⅱ组、Ⅲ组(P < 0.05)。
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表 3 左旋肌肽对中华田园犬生长性能影响 Table 3 Effects of L-carnosine on growth performance of Canis lupus familiaris |
感官评价可以直接观察中华田园犬的健康情况以及它们的精神状态，根据5位测评人员的评分平均值得到中华田园犬的感官评分图(图 2)。得到的总评分在25.5~35.0分，随着饲粮中左旋肌肽添加量的增加，各项评分值也逐渐升高，Ⅲ组的各项评分值均高于其他组，在皮肤状态、鼻子湿润程度和灵活度方面尤为突出。
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图 2 左旋肌肽对中华田园犬感官评分的影响 Fig. 2 Effects of L-carnosine on sensory scores of Canis lupus familiaris |
The WALTHAMTM粪便评分系统将粪便性状划分为9个级别。其中1级表示粪便最为干、硬，5级表示粪便最稀。理想的粪便是1.5~2.5级(含2.5级)，较差的粪便是小于1.5级或大于3.5级(不含3.5级)，将2.5级视为最佳粪便评分。由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组以及C组的粪便评级图(图 3)和评分表(表 4)可知，各组评分在1.5~3.5级，均处于健康水平，Ⅰ、Ⅲ组中华田园犬粪便评分值显著高于C组(P < 0.05)，其中Ⅱ组评分值与最佳粪便评分最为接近。
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图 3 左旋肌肽对中华田园犬粪便评分的影响 Fig. 3 Effects of L-carnosine on fecal score of Canis lupus familiaris |
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表 4 左旋肌肽对中华田园犬粪便评分的影响 Table 4 Effects of L-carnosine on fecal scores of Canis lupus familiaris |
由表 5可知，各组粗脂肪表观消化率随着左旋肌肽添加量的增加而升高，Ⅲ组的粗脂肪表观消化率显著高于C组(P < 0.05)；Ⅱ、Ⅲ组对粗蛋白质和粗纤维表观消化率显著高于C组(P < 0.05)；钙、磷表观消化率在各组间均无显著差异(P>0.05)。
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表 5 左旋肌肽对中华田园犬养分表观消化率的影响 Table 5 Effects of L-carnosine on nutrient apparent digestibilities of Canis lupus familiaris |
由表 6可知，随着饲粮中左旋肌肽添加量的增加，中华田园犬血清中D-木糖的含量呈上升趋势，但各组血清中D-木糖含量差异均不显著(P>0.05)。
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表 6 左旋肌肽对中华田园犬血清中D-木糖含量的影响 Table 6 Effects of L-carnosine on serum D-xylose content of Canis lupus familiaris |
由表 7可知，不同左旋肌肽添加量对各组血清TP、TG含量影响不显著(P>0.05)。C组血清CHO、CRE含量显著高于其他组(P < 0.05)。C组与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清ALT活性无显著差异(P>0.05)；Ⅰ组血清AST活性显著高于其他组(P < 0.05)；Ⅱ组血清ALB含量显著高于其他组(P < 0.05)；Ⅲ组血清CRE含量相比其他组显著降低(P < 0.05)，但血清中Urea含量显著高于C组(P < 0.05)。
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表 7 左旋肌肽对中华田园犬血清生化指标的影响 Table 7 Effects of L-carnosine on serum biochemical indices of Canis lupus familiaris |
由表 8可知，C组与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清中免疫球蛋白M含量无显著差异(P>0.05)；Ⅱ组血清免疫球蛋白A、免疫球蛋白G含量显著高于C组和Ⅰ组(P < 0.05)。
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表 8 左旋肌肽对中华田园犬血清免疫球蛋白含量的影响 Table 8 Effects of L-carnosine on serum immunoglobulin content of Canis lupus familiaris |
由表 9可知，随着饲粮中左旋肌肽添加量的增加，血清中T-AOC及GSH-Px、SOD活性显著提高，其中Ⅱ、Ⅲ组显著高于C组(P < 0.05)。随着饲粮中左旋肌肽添加量的增加，血清中MDA的含量不断下降，当左旋肌肽添加量为900 mg/kg时，MDA含量才显著低于C组(P < 0.05)。
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表 9 不同浓度左旋肌肽对中华田园犬血清抗氧化能力的影响 Table 9 Effects of L-carnosine on serum antioxidant ability of Canis lupus familiaris |
本试验通过平均日增重、平均日采食量和料重比来反映左旋肌肽对中华田园犬生长性能的影响。本研究表明，随着饲粮中左旋肌肽添加量的增加，中华田园犬的平均日采食量和平均日增重均显著降低，但都保持在正常范围内。高添加量左旋肌肽对生长的抑制作用可能是因为其添加后能激发机体功能亢进，进而抑制增重，另外是否有其他原因还有待进一步研究。
感官评定能较直观地评估中华田园犬的健康状况，通过对中华田园犬的毛发顺滑程度、掉毛程度、皮肤状态等方面的评估，可以直接判断中华田园犬生病与否，精神状态是否欠佳。受到各种外界因素的影响，动物机体内会不断地产生自由基，从而导致皮肤衰老，左旋肌肽能够清除自由基及一些氧化产物，起到抗皮肤衰老作用[5]。中华田园犬的最佳健康状况为各项满分即总分为40分的情况，本研究发现感官评分与左旋肌肽添加量呈正相关，表明左旋肌肽可以有效增强中华田园犬的精神状态，还能使皮肤变得光滑有弹性，说明在犬粮里添加左旋肌肽在一定程度上改善了中华田园犬的感官性状。
3.2 左旋肌肽对中华田园犬肠道消化吸收功能的影响犬的粪便根据食物的种类、食物的供给量及消化功能状态的不同而有所不同。观察犬的粪便可以判断很多疾病，尤其是对于消化道疾病及消化道功能状态判定意义重大。粪便评定是反映小肠消化吸收效率最直观的方法，通过分析中华田园犬粪便中的形态，可以了解中华田园犬的营养状态。健康犬的粪便被称为黄金栗子便，其外形圆润、富有光泽、捡起来时不会粘在地板上，有一定的润泽度[14]。根据WALTHAMTM粪便评分系统，将2.5级视为最佳的粪便评分。本研究通过采集犬不同时段的粪便，参照WALTHAMTM粪便评分系统的粪便评分图，从粪便的形状、颜色及成型度等方面进行对比，各组得到的评分都在1.5~3.0级，且试验得到的粪便一般都为黄色或者褐色，属于健康正常犬的粪便颜色。Ⅱ组的平均得分最接近于最佳的粪便评分2.5级，表明犬粮中添加600 mg/kg的左旋肌肽可增强中华田园犬小肠消化吸收功能。
D-木糖通常不会在血液中出现，口服后可在小肠被吸收，所以口服D-木糖后，在一定时间内血和尿中D-木糖含量基本上可以反映小肠吸收功能状况[15]。本试验结果表明，随着左旋肌肽添加量的增加，中华田园犬血清中D-木糖的含量呈上升趋势，可能的原因是左旋肌肽能对肠道起到保护作用，而且可能随着添加量的增加会有更好的效果。同时本试验结果还表明，在饲粮中添加一定水平的左旋肌肽能提高中华田园犬对粗蛋白质、粗脂肪及粗纤维表观消化率，这些都说明添加左旋肌肽对中华田园犬的小肠消化吸收功能有所提高。
本试验通过对犬粪便评分、表观消化率及血清D-木糖含量进行测定，综合反映了左旋肌肽对中华田园犬肠道消化吸收功能的影响，研究表明饲粮中添加600~900 mg/kg左旋肌肽可增强中华田园犬小肠消化吸收功能。
3.3 左旋肌肽对中华田园犬血清生化指标的影响TP含量主要反映肝脏合成功能和肾脏病变造成蛋白质丢失的情况，通过TP含量检测可间接了解机体的营养状况。本研究表明，左旋肌肽对血清TP含量无显著影响，表明饲粮中添加左旋肌肽可以有效保证肝脏和肾脏的生理功能。CHO和TG含量是反映机体脂肪沉积状况的重要指标，有研究向小鼠的饮用水中添加左旋肌肽降低了血浆中CHO和TG含量，表明左旋肌肽可以显著抑制脂肪酸合成酶活性[16]。本试验测得血清CHO含量在正常范围(3.9~7.8 mmol/L)，添加左旋肌肽显著降低了血清中CHO的含量，对TG含量也有降低作用，但效果不明显，表明左旋肌肽的添加可以有效帮助脂肪代谢，降低血清中总胆固醇的含量[9]。
ALT与AST都是肝脏细胞里的酵素，在肝细胞受损时才被释放入血液，因此血清中ALT活性的高低可间接反映机体的肝功能状况[17]。用血清AST、ALT活性与AST/ALT联合检测诊断急性肝炎的灵敏度和特异度均较高[18]。有研究表明，左旋肌肽能够通过抗氧化和抑制致炎细胞因子的产生，保护肝脏不受损伤。王晓艳[9]的研究表明，左旋肌肽对血清ALT和AST活性影响均不显著，与本试验中左旋肌肽对血清ALT活性影响不显著的结果一致，表明左旋肌肽的添加对肝脏功能无损伤作用。本试验中测得血清ALT、AST活性均在正常范围内(犬血清ALT活性正常范围为4.0~66.0 U/L，AST活性正常范围为0~50.0 U/L)。不过本试验中添加300 mg/kg的左旋肌肽显著提高了血清AST活性，原因可能是添加左旋肌肽剂量的不同以及动物种类差异导致。
CRE是肾功能检查的特异性指标。Urea含量变化也能够在一定程度上判断机体肾功能的好坏。犬血清CRE含量正常范围为44.0~120.0 μmol/L，Urea含量范围为15.0~57.7 mg/dL。本试验中各组血清CRE、Urea含量均在正常范围内，但Ⅲ组血清CRE含量相比其他组显著降低，说明添加左旋肌肽能够在一定程度上改善肾功能。有研究表明，氧化应激损伤导致肾脏血流动力学异常改变，从而导致血清Urea含量升高，从而可以解释本试验中Ⅲ组血清Urea含量显著高于C组的结果。
3.4 左旋肌肽对中华田园犬血清免疫球蛋白含量的影响通过上述讨论，表明饲粮中添加左旋肌肽可以明显提高中华田园犬感官评价、粪便评分以及肝脏和肾脏的生理功能，并且显著提高了机体的抗氧化能力，这些方面也能间接提高机体的免疫能力。免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M是机体内重要的非特异免疫因子，本试验中添加左旋肌肽显著提高血清中免疫球蛋白A和免疫球蛋白G的含量，可能是由于肌肽可以保护细胞免受自由基和活性氧所致的损伤，从而提高机体自身的免疫力[19]。
3.5 左旋肌肽对中华田园犬抗氧化能力的影响T-AOC是一个全面反映皮肤组织抗氧化能力的良好指标[20]。GSH-Px是机体中重要的抗氧化酶，SOD能特异的清除超氧阴离子，与GSH-Px协同作用减少活性氧的产生，增强机体的抗氧化能力[21]。MDA是生物体内过氧化脂质的代谢产物，其含量的高低可反映组织细胞受自由基损伤的程度[20]。左旋肌肽能与MDA产生羰基反应，起到保护细胞的作用[17]。在女子足球运动员连续摄入L-肌肽28 d试验[22]中，肌肽有降低谷胱甘肽(GSH)含量、GSH-Px、SOD活性，增强机体抗氧化作用，这与本试验中随着饲粮中左旋肌肽添加量的增加，Ⅱ组和Ⅲ组血清中GSH-Px、SOD活性及T-AOC升高的结果一致。邱玉朗等[23]的研究表明，肌肽显著提高肉鸡血清的T-AOC，还提高了肉鸡血清中GSH-Px活性，降低了MDA含量，且机体抗氧化能力与肌肽添加量呈正相关。本试验结果表明，饲粮中添加600及900 mg/kg左旋肌肽降低了中华田园犬血清中MDA含量，表明添加左旋肌肽可有效清除自由基，从而显著提高了中华田园犬的抗氧化能力。
4 结论① 饲粮中添加600~900 mg/kg的左旋肌肽可使料重比得到一定改善，感官评分逐渐升高，表明添加左旋肌肽对于中华田园犬的健康状态有一定积极作用。
② 饲粮中添加600 mg/kg的左旋肌肽可显著提高中华田园犬的粪便评分，并对提高小肠吸收功能有显著效果。
③ 饲粮中添加600~900 mg/kg的左旋肌肽可以提高中华田园犬的抗氧化能力及血清中部分免疫球蛋白含量。
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