家禽肠道既是消化和吸收养分的重要器官，也是维持机体内环境稳态的先天性免疫屏障[1]。维持正常的肠道屏障功能对提高家禽生产性能具有重要意义。研究表明，蒙脱石等霉菌毒素吸附剂(mycotoxin adsorbent, MA)能够有效吸附霉菌毒素、致病菌及细菌毒素等，降低病原体对家禽肠道造成的损害，维护肠道健康[2-3]。植物精油(essential oil, EO)和有机酸(organic acid, OA)具有良好的防霉、抗菌、抑炎等功能，能够改善家禽肠道健康[4-5]。饲粮受多种低水平[霉菌毒素含量在我国《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)限定范围内]霉菌毒素污染和有害菌诱发的肠道疾病是蛋鸡养殖中较普遍存在的问题。基于MA、EO和OA的功效，推测MA-OA复合物和MA-EO复合物也许能有效缓解霉菌毒素、致病菌等对蛋鸡肠道造成的损伤，维护肠道屏障功能。本课题组同期研究表明，饲粮中添加0.65 g/kg MA-OA复合物或0.70 g/kg MA-EO复合物有提高蛋鸡产蛋率的趋势，且显著提高了蛋重[6]，推测可能与二者改善蛋鸡肠道健康有关。因此，本试验旨在研究在被多种低水平霉菌毒素污染的饲粮中添加MA-OA复合物或MA-EO复合物对蛋鸡肠道屏障功能的影响，以期为二者在蛋鸡生产中的应用以及通过营养调控方式改善家禽肠道健康提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料MA-OA复合物主要成分：MA(蒙脱石)含量为80%，OA(主要为甲酸、丙酸和丁酸)含量>10%；MA-EO复合物主要成分：MA(蒙脱石)含量为75%，EO(主要为丁香酚和肉桂醛)含量>4%。
1.2 试验设计与饲养管理将270只健康的29周龄罗曼蛋鸡随机分为3组，每组6个重复，每个重复15只鸡。Ⅰ组(对照组)饲喂基础饲粮，Ⅱ组、Ⅲ组分别饲喂在基础饲粮中添加0.65 g/kg MA-OA复合物、0.70 g/kg MA-EO复合物的试验饲粮。预试期1周，正试期10周。参考《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)设计蛋鸡基础饲粮，其组成及营养水平参见文献[6]。蛋鸡采用半开放式3层阶梯式笼养，每日饲喂2次，自由饮水，鸡舍光照时间为16 h。试验期鸡舍平均温度、相对湿度分别为(26±3) ℃、(77±6)%。采集试验第1天、第18天、第35天、第53天、第70天的饲粮样品，经检测，饲粮中常见霉菌毒素的含量均未超过我国《饲料卫生标准》(GB 1307—2017)的限定标准。基础饲粮中霉菌毒素含量实测值参见文献[6]。
1.3 样品采集试验结束后，各重复随机抽取1只蛋鸡，参照文献[7-8]的方法采集回肠内容物、肠黏膜和小肠肠段样品。回肠内容物和肠黏膜样品于-80 ℃保存，小肠肠段样品浸入4%甲醛溶液中。
1.4 检测指标与方法 1.4.1 回肠微生物相对数量提取蛋鸡回肠内容物细菌DNA后，将所有DNA样品的浓度稀释至100 ng/μL。使用实时荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]进行PCR扩增，反应体系、反应程序和引物序列参照文献[9]。以总细菌为参比基因，采用2-ΔΔCt法计算目的细菌的相对数量[10]。
1.4.2 回肠黏膜基因表达使用Trizol试剂提取蛋鸡回肠黏膜总RNA，用反转录试剂盒制备cDNA，然后以其为模板使用实时荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，以上试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。用Primer Premier 5.0设计闭锁蛋白(occludin)、闭合蛋白-1(claudin-1)、闭合蛋白-5(claudin-5)、闭锁小带蛋白-1(zonula occluden-1，ZO-1)、黏蛋白-2(mucin-2，MUC-2)、黏蛋白-5ac(mucin-5ac，MUC-5ac)、Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的引物，由上海生工生物有限公司合成。PCR反应体系、反应程序和引物序列参照文献[11]。以β-肌动蛋白(β-actin)为参比基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达水平。
1.4.3 肠道形态从甲醛固定液中取出肠段样品，经修块、乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋和苏木精-伊红(HE)染色后，用中性树胶封片，最后在倒置荧光显微镜(Olympus IX51，Olympus，日本)下观察，测量绒毛高度、隐窝深度，并计算二者比值。
1.4.4 回肠刷状缘酶活性参照文献[8]的方法制备10%的肠黏膜组织匀浆，离心后吸取上清液，测定碱性磷酸酶、蔗糖酶、麦芽糖酶和乳糖酶活性，所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.5 数据统计与分析试验数据用SAS 9.2软件进行单因素方差分析，差异显著者用Duncan氏法作多重比较。试验结果用平均值和均值标准误(SEM)表示，P < 0.05表示差异显著，0.05≤P < 0.10表示有提高或降低的趋势。
2 结果 2.1 MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡回肠微生物相对数量的影响由表 1可知，各组间回肠双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和肠球菌的相对数量均无显著差异(P>0.05)。与Ⅰ组相比，Ⅱ组、Ⅲ组产气荚膜梭菌的相对数量分别显著降低了55%、84%(P < 0.05)，Ⅲ组沙门氏菌的相对数量显著降低了64%(P < 0.05)。Ⅲ组产气荚膜梭菌的相对数量较Ⅱ组显著降低了64%(P < 0.05)。
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表 1 MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡回肠微生物相对数量的影响 Table 1 Effects of MA-OA complex and MA-EO complex on relative amounts of ileal microflora in laying hens |
由表 2可知，各组间回肠黏膜claudin-1、ZO-1、MUC-2、MUC-5ac、TLR2、TLR4和TNF-α mRNA相对表达水平均无显著差异(P>0.05)。与Ⅰ组相比，Ⅱ组回肠黏膜claudin-5 mRNA相对表达水平显著上调了83%(P < 0.05)，MyD88和IL-1β mRNA相对表达水平分别显著下调了48%、52%(P < 0.05)；Ⅲ组MyD88、NF-κB p65和IL-1β mRNA相对表达水平分别显著下调了25%、40%、37%(P < 0.05)。Ⅲ组occludin mRNA相对表达水平较Ⅱ组显著上调了59%(P < 0.05)。
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表 2 MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡回肠黏膜基因表达的影响 Table 2 Effects of MA-OA complex and MA-EO complex on gene expression in ileal mucosa of laying hens |
由表 3可知，各组间空肠和回肠绒毛高度无显著差异(P>0.05)。与Ⅰ组相比，Ⅲ组空肠绒毛高度/隐窝深度值显著提高了34.17%(P < 0.05)，Ⅱ组、Ⅲ组回肠绒毛高度/隐窝深度值分别显著提高了34.06%、41.25%(P < 0.05)，同时回肠隐窝深度有降低的趋势(P=0.088)。与Ⅱ组相比，Ⅲ组空肠隐窝深度显著降低了35.72%(P < 0.05)，空肠绒毛高度/隐窝深度值显著提高了26.67%(P < 0.05)。
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表 3 MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡肠道形态的影响 Table 3 Effects of MA-OA complex and MA-EO complex on intestinal morphology of laying hens |
由表 4可知，各组间回肠麦芽糖酶和乳糖酶活性均无显著差异(P>0.05)。与Ⅰ组相比，Ⅲ组回肠碱性磷酸酶活性显著提高了84.29%(P < 0.05)，Ⅱ组、Ⅲ组回肠蔗糖酶活性分别显著提高了86.10%、86.73%(P < 0.05)。Ⅲ组回肠麦芽糖酶活性较Ⅱ组有提高的趋势(P=0.073)。
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表 4 MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡回肠刷状缘酶活性的影响 Table 4 Effects of MA-OA complex and MA-EO complex on brush border enzyme activities in ileum of laying hens |
本试验发现，饲粮中添加MA-OA复合物或MA-EO复合物均降低了蛋鸡回肠产气荚膜梭菌、沙门氏菌相对数量。研究表明，蒙脱石、OA或EO能够降低蛋鸡肠道有害菌数量，调节肠道菌群结构[9, 12-13]，本试验结果与前人的报道基本相符。本试验中蛋鸡的饲粮被多种霉菌毒素污染，霉菌毒素间存在互作效应，几种低剂量霉菌毒素协同作用后的毒性增加，且毒素在动物体内不断蓄积，会产生潜在危害[14-16]。同时，研究证实，低剂量霉菌毒素对家禽生产性能、机体免疫与抗氧化性能及肠道屏障功能等会产生负面影响[17-18]。资料表明，脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等霉菌毒素会影响动物肠道微生物的组成，降低微生物多样性[15, 19]。本试验所用饲粮含有多种低剂量的霉菌毒素，其可能潜在影响蛋鸡肠道菌群结构，推测MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡肠道菌群结构的调节作用也许与其减轻低剂量霉菌毒素造成的肠道菌群紊乱有关。肠道微生物会同宿主争夺肠腔内养分而降低饲料利用率，最终影响动物的生产性能。本课题组同期研究显示MA-OA复合物和MA-EO复合物一定程度上改善了蛋鸡产蛋性能[6]，推测蛋鸡肠道有害菌数量的降低可能是MA-OA复合物和MA-EO复合物改善蛋鸡产蛋性能的一个重要原因。
3.2 MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡回肠黏膜基因表达的影响TLR4识别并特异性结合配体后，可通过MyD88依赖性通路激活NF-κB，使其移位进入细胞核并诱导促炎因子释放，而促炎因子的过量表达会引发炎症[20]。研究表明，霉菌毒素、致病菌能够激活TLR4信号通路，诱导促炎因子过量表达，引起家禽肠道炎症[16-17, 21]。本试验中，Ⅲ组蛋鸡回肠黏膜NF-κB p65 mRNA相对表达水平较Ⅰ组显著下调，Ⅱ组、Ⅲ组回肠黏膜MyD88、IL-1β mRNA相对表达水平较Ⅰ组显著下调，且TLR4 mRNA相对表达水平也有一定下调，初步表明MA-OA复合物和MA-EO复合物可能影响TLR4/NF-κB信号通路，有利于抑制促炎因子表达，降低炎症反应，本试验结果与Chen等[8]、Liu等[22]和Yang等[23]的研究结果相似。MA-OA复合物和MA-EO复合物是否能够调节TLR4/NF-κB信号通路还需分析通路中关键蛋白活性和炎症因子蛋白表达的变化。
本试验中，Ⅱ组回肠claudin-5 mRNA相对表达水平较Ⅰ组显著上调，提示MA-OA复合物可能促进了肠道紧密连接蛋白的表达，有利于维护肠道物理屏障，这可能是由于MA-OA复合物能够降低霉菌毒素、致病菌等病原体对肠上皮细胞造成的损伤；此外，其含有的蒙脱石可在肠道内延展，形成连续的保护膜而保护肠道黏膜。研究表明，蒙脱石可以显著提高蛋鸡空肠occludin、claudin-1和claudin-5 mRNA相对表达水平[3, 8]；OA能够调节家禽肠道紧密连接蛋白的基因表达[24-25]。本试验结果与以上报道基本相符。
3.3 MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡肠道形态的影响绒毛高度、隐窝深度及二者比值是评估肠道结构完整性的重要指标。本试验中，Ⅱ组、Ⅲ组小肠绒毛高度/隐窝深度值较Ⅰ组显著提高，回肠隐窝深度较Ⅰ组有降低的趋势，说明添加MA-OA复合物或MA-EO复合物有利于维护蛋鸡肠道结构的完整性，本试验结果与曾子悠等[5]、Wang等[12]和Yarmohammadi Barbarestani等[25]的报道基本相符。MA-OA复合物和MA-EO复合物改善肠道形态的机制可能与其能够抑制肠道致病菌有关。致病菌及其产生的细菌毒素能够打破肠道菌群平衡，诱发肠道炎症，进而损害肠黏膜结构，同时也不利于肠绒毛再生。本试验中肠道形态的结果与肠道微生物相对数量、肠黏膜基因表达的结果基本可以相互佐证。此外，研究表明，低剂量霉菌毒素如黄曲霉毒素B1能够诱导家禽肠道损伤，破坏肠黏膜形态结构[17-18]。本试验所用蛋鸡饲粮被多种霉菌毒素污染，推测MA-OA复合物、MA-EO复合物可能缓解了饲粮中低剂量霉菌毒素对蛋鸡肠道结构造成的损害。
3.4 MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡回肠刷状缘酶活性的影响小肠刷状缘碱性磷酸酶和二糖酶的活性是评价肠上皮细胞成熟程度及肠道功能的重要指标。本研究表明，饲粮中添加MA-OA复合物或MA-EO复合物均提高了蛋鸡回肠蔗糖酶活性，添加MA-EO复合物还提高了回肠碱性磷酸酶活性。研究表明，香芹酚、蒙脱石或EO和OA的复合物可以提高蛋鸡、肉鸡肠黏膜二糖酶活性[18, 26-27]。MA-OA复合物和MA-EO复合物提高肠道刷状缘酶活性的可能机制如下：2种添加剂均含有蒙脱石，其晶层间二价铜离子(Cu2+)、二价锌离子(Zn2+)、三价铁离子(Fe3+)等在动物肠道中被置换出来，可能发挥激活相关酶的作用[28]；此外，完整的肠黏膜结构可促进刷状缘酶的分泌，MA-OA复合物和MA-EO复合物也可能通过降低肠道致病菌数量、改善肠黏膜形态而提高刷状缘酶活性。本试验中蛋鸡回肠刷状缘酶的活性与回肠微生物相对数量、肠道形态的结果基本可以相互佐证。健康的肠道是家禽充分发挥生产性能的重要前提。综上可知，MA-OA复合物和MA-EO复合物均能够改善蛋鸡肠道健康，这可能是其在一定程度上提高蛋鸡生产性能[6]的主要原因之一。
3.5 MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡肠道黏膜屏障功能影响的比较本试验结果显示，与Ⅱ组相比，Ⅲ组蛋鸡回肠产气荚膜梭菌、沙门氏菌相对数量和空肠隐窝深度显著降低，回肠occludin mRNA相对表达水平和空肠绒毛高度/隐窝深度值显著提高，回肠黏膜麦芽糖酶活性有提高的趋势，从以上结果可以看出，MA-EO复合物在降低蛋鸡肠道有害菌数量、促进紧密连接蛋白表达以及改善肠道形态方面的作用优于MA-OA复合物，说明饲粮中添加MA-EO复合物对改善蛋鸡肠道健康的效果相对更好。研究表明，EO可以降解细菌细胞壁，破坏有害菌细胞质膜，直接杀灭细菌[29]；另外，EO还可以干扰细菌群体感应，抑制有害菌产生毒力因子[30]。据报道，OA主要通过电离出氢离子降低肠道pH及未解离的OA分子穿透细菌细胞膜发挥抑菌作用[4, 31]。据此分析，与OA相比，EO或许能够更有效、快速地控制肠道有害菌，降低其毒力。本课题组前期研究发现，本试验所用MA可以显著降低蛋鸡肠道沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌数量[9]，有效“绑定”脂多糖[8]，作者分析EO与MA联用能够发挥出更强的抑菌杀菌作用，进而减少有害菌对肠道造成的损伤，维护蛋鸡肠道屏障功能。
4 结论饲粮添加MA-OA复合物或MA-EO复合物均能够降低蛋鸡回肠有害菌数量，下调回肠黏膜促炎因子基因表达，提高回肠刷状缘酶活性，改善肠道黏膜形态。由此可见，MA-OA复合物和MA-EO复合物能够改善蛋鸡肠道屏障功能，可作为动物肠道健康调节剂。
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