2. 河北农业大学动物科技学院, 保定 071000;
3. 衡水志豪畜牧科技有限公司, 衡水 053401;
4. 河北省肉羊产业研究院, 衡水 053401
2. College of Animal Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, China;
3. Hengshui Zhihao Animal Husbandry Technology Co., Ltd., Hengshui 053401, China;
4. Hebei Institute of Meat Sheep Industry, Hebei Hengshui 053401, China
运输应激是由运输过程中环境变化、禁食禁水、心理压力等复杂多因素应激原的综合作用所引起的机体抵抗性、防御性、适应性反应[1]。在运输应激的刺激下，羊的代谢机能、血液生化指标发生改变，免疫功能下降，甚至造成死亡。目前我国运输动物的方式主要以公路运输为主，大部分动物以及动物产品进入流通环节，公路运输占整个流通量的97%以上[2]。运输导致的动物发病率及死淘率分别高达73.2%、14.2%，由于运输过程中养殖户经验不足，准备不充分，羊的运输应激导致的死亡率可高达35%[3-4]，给养殖业带来了巨大经济损失，因此，及时采取有效的缓解措施至关重要。
抗应激添加剂可以有效缓解应激反应，应用抗应激添加剂是目前缓解运输应激的主要方法[5]。常用的抗应激添加剂种类包括维生素类、益生菌类、氨基酸类、抗生素类、矿物质元素类和中草药类等。维生素C作为高效抗氧化剂，不仅可以防止氧化自由基对组织的破坏，还可以减少运输应激引起的犊牛腹泻现象[6]。研究表明，维生素C和维生素E可调控与运输应激有关的皮质激素，降低免疫球蛋白的损失，提高机体抗运输应激能力[7]。电解多维可以调解机体电解质平衡，促进机体的新陈代谢，增强机体对疾病的抵抗力，因而具有明显应激的调节作用。Gupta等[8]研究表明，联合使用维生素和电解质相比单独使用维生素可更有效地缓解山羊运输应激。植物乳酸杆菌是动物肠道中最早定植的健康菌群之一，能促进有益菌的增殖、减少病原菌的数量，具有促进生长、改善肠道健康、增强免疫力的效果[9-10]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid, γ-GABA)属于功能性氨基酸，在哺乳动物大脑中模仿内源性神经递质工作并被确认为是哺乳动物神经中枢的一种抑制性递质，具有镇静的作用[11]。在应激过程中，γ-GABA可以抑制呼吸中枢，降低由应激引起的机体代谢增强、血压升高、产热增加等耗能生理状态[12]。研究报道，γ-GABA可提高虾[13]、鸡[14]、鸭[15]的生长性能，明显降低血清应激激素含量，并提高机体免疫力。运输应激后动物机体往往免疫力下降，易受细菌感染导致消化道疾病[16-17]，临床上，关于抗运输应激作用的研究主要集中在猪[18]、牛[19-20]、驴[21]，在羊上鲜有报道，且关于电解多维、乳酸菌、γ-GABA及新霉素的抗运输应激效果研究较少。因此，本试验通过在羔羊道路运输前后应用电解多维，运输后应用乳酸菌、γ-氨基丁酸和新霉素，研究运输前后不同处理和时间对湖羊羔羊生长性能及血清应激指标、免疫球蛋白、炎症因子含量的影响，为生产中缓解羊运输应激添加剂的选择和应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点本试验于2021年6月1日—2021年6月30日，在河北省张家口兰海畜牧养殖有限公司进行。
1.2 试验材料电解多维粉购自于湖南某药业公司，主要成分及含量见表 1。植物乳酸菌液(乳酸菌数量1×1010 CFU/mL)由河北农业大学生命科学学院实验室提供。γ-GABA粉(纯度99%)购自于济南某生物技术公司。新霉素粉购自于成都某药业公司。
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表 1 电解多维粉主要成分及含量 Table 1 Electrolytic multidimensional powder main components and content |
选用健康、平均体重为(20.71±0.70) kg的4月龄湖羊公羔50只，随机分为5组，分别为1组(对照组)、2组(电解多维组)、3组(乳酸菌组)、4组(γ-GABA组)、5组(新霉素组)。运输当天记为0 d，运输当天所有试验羊于09：00—17:00进行8 h公路运输，1组羔羊运输前后饲喂基础饲粮；2组羔羊在运输前2 d至运输后7 d于基础饲粮中添加电解多维粉[375 mg/(只·d)]；3组和4组羔羊在运输当天至运输后7 d于基础饲粮中分别添加乳酸菌液[4 mL/(只·d)]和γ-GABA粉[(200 mg/(只·d)]；5组羔羊在运输当天至运输后7 d于基础饲粮中添加新霉素粉[200 mg/(只·d)]。电解多维粉、γ-GABA粉和新霉素粉均在饲喂前拌于基础饲粮中饲喂，乳酸菌液在饲喂前均匀喷洒于基础饲粮表面进行饲喂。基础饲粮由羊场提供，其组成及营养水平见表 2。
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表 2 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
试验羊均无运输经历，在装车前对所有羊进行检查，以排除有损伤、肿胀或者任何形式明显疾病的羊，运输前6 h禁饲不禁水。运输车为车厢长13 m、宽2.55 m、高4 m的3层半挂车，运输前对其进行彻底打扫、消毒，试验羊均放置卡车第2层，运输途中禁食禁水，运输道路选择外环公路和坑洼公路，时速30~70 km/h，运输密度2.7 m2/只，运输当天平均温度为22 ℃，平均相对湿度为21%。运输到达羊场后1 h内不饲喂，不饮水。
1.5 饲养管理所有试验羊在试验前7 d转入圈舍，圈舍在试验羊转入前彻底清扫、消毒。试验开始前试验羊进行驱虫处理，每天巡视羊舍并对羊舍进行清扫。试验期间，每组试验羊每天07: 00和17: 00分别给料1.5 kg，第2天早上喂料前称取剩料量，每天每组均有剩料(10%以内)，自由饮水。
1.6 试验指标 1.6.1 生长性能指标分别于运输前1 d和运输后14 d对所有羊进行称重，统计初重和末重，计算平均日增重。试验期间每天记录每只试验羊的给料量和剩料量，计算平均日采食量。根据平均日采食量和平均日增重计算料重比。
1.6.2 血清应激指标试验羊运输后0、7和14 d采集颈静脉血，每只羊采5 mL血液，室温静置0.5 h后，3 500 r/min离心10 min，分离血清于-20 ℃保存备用。
采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法，按照试剂盒说明检测血清应激指标，包括促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(COR)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性及免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.7 数据统计分析利用SPSS 23.0统计软件对生长性能试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，血清应激指标试验数据进行双因素方差分析，用LSD法进行多重比较。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。数据均以平均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 运输应激干预对羔羊生长性能的影响由表 3可知，运输前各组间初重差异不显著(P>0.05)，各组间平均日采食量差异极显著(P < 0.01), 对照组平均日采食量极显著低于其余4组(P < 0.01)，乳酸菌组与电解多维组、γ-GABA组、新霉素组间平均日采食量差异不显著(P>0.05)，γ-GABA组平均日采食量显著低于电解多维组、新霉素组(P < 0.05)。各组间料重比差异极显著(P < 0.01)，各组料重比的关系为γ-氨基丁酸组＞对照组＞乳酸菌组＞新霉素组＞电解多维组。
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表 3 运输应激干预对羔羊生长性能的影响 Table 3 Effects of transport stress intervention on growth performance of lambs |
由表 4可知，处理极显著影响了羔羊血清中ACTH含量和LDH活性(P < 0.01)，添加电解多维、新霉素处理血清ACTH含量极显著低于对照处理(P < 0.01)，添加乳酸菌、γ-GABA处理血清ACTH含量显著低于对照处理(P < 0.05)。添加电解多维和γ-GABA处理血清LDH活性极显著低于对照处理(P < 0.01)，添加乳酸菌、新霉素处理血清LDH活性显著低于对照处理(P < 0.05)；处理有降低羔羊血清中COR含量(P=0.050)和CK活性(P=0.070)的趋势。
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表 4 运输应激干预对羔羊血清应激指标的影响 Table 4 Effects of transport stress intervention on stress parameters in serum of lambs |
时间显著影响了血清中ACTH含量(P < 0.05)，运输后7 d血清ACTH含量显著低于0(运输当天)和运输后14 d(P < 0.05)；时间极显著影响了血清COR含量、LDH活性(P < 0.01)，0 d血清COR含量极显著高于运输后7和14 d(P < 0.01)，0 d血清LDH活性极显著高于运输后14 d(P < 0.01)，显著高于运输后7 d(P < 0.05)。
处理和时间交互作用显著影响了血清中ACTH含量(P < 0.05)，而对血清COR含量及CK、LDH活性无显著影响(P＞0.05)。
2.3 运输应激干预对羔羊血清中免疫球蛋白含量的影响由表 5可知，处理极显著影响了血清IgA含量(P < 0.01)，对照处理血清IgA含量极显著低于其他4个处理(P < 0.01)，4个处理间血清IgA含量差异不显著(P>0.05)；处理对血清IgG、IgM含量影响不显著(P>0.05)。时间对血清IgA、IgG、IgM含量影响不显著(P>0.05)。处理和时间交互作用对血清中IgA、IgG、IgM含量无显著影响(P>0.05)。
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表 5 运输应激干预对羔羊血清中免疫球蛋白含量的影响 Table 5 Effects of transportation stress intervention on immunoglobulin content in serum of lambs |
由表 6可知，处理显著影响了血清IFN-γ含量(P < 0.05)，添加电解多维、乳酸菌处理血清IFN-γ含量显著低于对照处理(P < 0.05)；处理极显著影响了血清IL-6含量(P < 0.01)，添加电解多维、乳酸菌、新霉素处理血清IL-6含量极显著低于对照处理(P < 0.01)，添加γ-GABA与对照、电解多维、乳酸菌、新霉素处理间血清IL-6含量差异不显著(P>0.05)。
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表 6 运输应激干预对羔羊血清中相关炎症因子含量的影响 Table 6 Effects of transportation stress intervention on contents of associated inflammatory factors in serum of lambs |
时间极显著影响了羔羊血清中IL-6含量(P < 0.01)，对血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量无显著影响(P>0.05)，运输后7 d血清IL-6含量极显著高于14 d(P < 0.01)。
处理和时间交互作用极显著影响了血清中IL-6含量(P < 0.01)，对血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β含量无显著影响(P>0.05)。
3 讨论 3.1 运输应激干预对羔羊生长性能的影响羔羊在道路运输中禁食禁水，受到生理和心理双重应激压力，分解代谢加强，机体养分消耗加速，免疫机能下降，运输后常导致腹泻率升高，影响生长性能[22-23]。研究发现，运输后饲喂富含维生素和电解质的复合营养性添加剂，可以显著提高蛋鸡[24]和断乳仔猪[25]的生长性能，缓解运输应激。Gupta等[8]对山羊进行了8 h的运输，运输前后口服维生素C(180 mg/kg)+电解质(7 g/kg)有效缓解了运输应激。本试验中，电解多维组羔羊的平均日增重比对照组提高42.9%，说明运输前2 d至运输后7 d添加电解多维可有效缓解应激、提高生长性能，可能是因为电解质改善了运输应激引起的酸碱失衡状况[26]，维生素降低了自由基对动物机体的损伤，提高了羔羊健康水平。研究表明，复合益生菌(地衣芽孢杆菌、枯草杆菌和植物乳杆菌)和植物乳酸菌显著缓解了肉用鸡[27]、断乳仔猪[28]的应激反应并提高生长性能。本试验中，乳酸菌组羔羊的平均日增重比对照组提高了12.15%，说明乳酸菌可以缓解羔羊运输应激，可能是因为乳酸菌抑制了肠道有害菌生长，维持肠道菌群平衡，提高了营养物质的消化利用率[29]。γ-GABA可以促进机体分泌促食欲神经肽，抑制神经兴奋，有镇静作用可缓解运输应激[30]。王迪铭[31]发现，在饲粮中添加包被的γ-GABA(140 mg/d)可显著提高断奶湖羊平均日采食量和平均日增重。本试验中，在羔羊运输后7 d内补充γ-GABA对平均日采食量和平均日增重无显著影响，可能与γ-GABA未包被有关，至于包被γ-GABA后是否会缓解运输应激有待进一步研究。长途运输后，由于羔羊肠道菌群失衡，致病菌增加，常引起腹泻，新霉素在兽医临床上主要用于畜禽细菌性肠炎治疗[32]。本试验中，添加新霉素组羔羊的平均日采食量显著高于对照组，平均日增重比对照组提高21.87%，料重比显著低于对照组，说明羔羊运输后7 d内进行新霉素治疗可以有效缓解应激，提高生长性能。
3.2 运输应激干预对羔羊血清应激指标的影响动物在应激条件下，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能增强使ACTH分泌增加，提高血清COR含量，因此，常用血清ACTH和COR含量判断动物应激情况。COR含量过高会使机体应激反应增强，机体免疫力降低[33]。本研究中，运输前后添加电解多维，运输后7 d内添加乳酸菌、γ-GABA和新霉素极显著降低了羔羊血清中ACTH含量，说明电解多维、乳酸菌、γ-GABA及新霉素可以缓解运输应激。各处理中，添加电解多维和新霉素血清ACTH含量最低，说明运输前后使用电解多维或运输后立即进行新霉素治疗缓解运输应激的效果优于乳酸菌和γ-GABA。各组血清COR含量变化与ACTH含量变化一致，均呈降低趋势，说明添加电解多维或应用新霉素治疗均有效缓解了运输应激。梁伟超等[21]使用主要成分为电解多维的营养汤缓解驴运输应激中发现，血清中COR、ACTH含量在运输后3~9 d恢复至运输前，未使用营养汤的驴则需要15 d。本试验中，相比于运输当天，羔羊血清中COR含量在运输后7和14 d极显著降低，说明羔羊在运输后7 d内应激较大，14 d内仍未得到恢复。在运输当天至运输后14 d，添加电解多维、乳酸菌、新霉素血清ACTH含量呈下降趋势，但对照和γ-GABA处理在运输后14 d血清ACTH含量相比于7 d未见降低，说明未包被的γ-GABA未能缓解羔羊运输应激，这与添加γ-GABA未提高羔羊生长性能的结果相一致。
CK和LDH存在于肌细胞中，正常情况下由于细胞膜的屏障作用仅有少量细胞内酶释放入血，当细胞受损细胞膜通透性升高时，细胞内酶涌入血液，使血清内酶活性明显升高。CK是肌细胞特异酶，是肌细胞膜系统受损的标志，LDH参与机体能量代谢的糖酵解过程，应激程度越大，LDH活性越高[34]。维生素C可以降低细胞膜的通透性，减少CK、LDH入血几率，从而缓解运输应激[35]。本研究中，添加电解多维、乳酸菌、γ-GABA或进行新霉素治疗均可缓解运输应激，从各处理血清LDH和CK活性看，运输前后添加电解多维效果最好。运输当天至运输后14 d，羔羊血清中LDH活性呈下降趋势，说明运输途中羔羊代谢增强，大量的氧优先供应大脑及心脏等维持生命体征的重要器官，机体组织由于缺氧产生脂质过氧化反应使细胞膜受到损伤，细胞内LDH进入血液致使运输后当天血清LDH活性最高，随着时间延长，动物机体逐渐从应激中恢复过来，LDH活性随之降低[36]。本试验中，各处理羔羊血清CK活性在运输后14 d内呈下降趋势，14 d活性最低，但各时间点无显著差异，说明8 h的道路应激造成的肌细胞损伤在运输后14 d内不能得到有效缓解。
3.3 运输应激干预对羔羊血清免疫球蛋白含量的影响动物在应激时，免疫细胞受抗原刺激产生能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，其中IgA、IgG、IgM是评定体液免疫功能最常用的指标[37]。研究表明，热应激可降低山羊血清IgA、IgG和IgM含量[38-39]。植物乳杆菌能提高断奶仔猪血清IgA、IgG和IgM含量[28]。黄宝银等[40]研究发现，包被γ-GABA可以提高肉牛血清IgA、IgG和IgM含量。本试验中，各处理血清IgA含量极显著高于对照处理。IgA在肠道黏膜免疫应答中发挥重要作用，说明各处理均具有阻断病原微生物穿透肠道黏膜从而发挥免疫调节的作用[41]，添加电解多维处理血清IgA含量最高，说明电解多维保护消化道黏膜作用最好，这与该处理生长性能最高的结果相一致。研究报道，山羊大多在运输后第1~2周发病[42]。Stanger等[43]发现，经72 h长途运输的成年婆罗门牛落地后6 d免疫细胞才恢复正常，但体质明显下降，易感染其他疾病。赵广高等[44]、王显慧[45]研究表明，维生素C、维生素E能加强胸腺淋巴细胞功能，增加血清中IgA含量。本试验中，运输后7 d电解多维组血清IgA含量显著高于其他4组，显著提高羔羊免疫力，这可能是因为维生素C可以抑制COR分泌，防止机体脂质化反应，增强IgA的合成[46]。
3.4 运输应激干预对羔羊血清炎症因子含量的影响细胞因子不仅是由免疫细胞产生的具有免疫调节功能的蛋白质，也是神经内分泌系统与免疫系统之间传递信息的重要介质，细胞因子分为Th1、Th2 2种类型，TNF-α、IFN-γ等属于Th1型细胞因子，参与调节机体的细胞免疫，而IL-6属于Th2型细胞因子，在体液免疫中发挥着重要的作用。研究发现，各种不同的应激因素能诱导IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子的分泌[47]，血清中TNF-α、IFN-γ含量上调会导致炎症反应。王晓娜等[35]发现，使用富含维生素的抗应激添加剂可降低运输后肉牛血清中IFN-γ含量。本研究中，相比于对照处理，添加电解多维和乳酸菌处理羔羊血清中IFN-γ、IL-6含量均降低，新霉素处理血清IL-6含量降低，说明添加电解多维、乳酸菌或进行新霉素治疗可以提高羔羊免疫力，有利于缓解运输应激。本研究中，添加电解多维和新霉素处理血清TNF-α含量呈降低趋势，降低了运输应激导致的炎症反应。各组羔羊血清中IL-1β含量在运输后7 d呈降低趋势，说明羔羊在运输后7 d应激缓解，炎症反应减弱。在运输后14 d血清IFN-γ含量显著低于运输当天，IL-6含量极显著低于运输后7 d，说明羔羊运输后7 d内炎症反应最大。有研究发现，分别对体重35和50 kg的仔猪进行2和4 h运输后，体重35 kg的仔猪血清中IL-6含量变化不显著，而IL-1β含量极显著下降；体重50 kg的仔猪进行4 h运输后，血清IL-6含量极显著下降，而血清TNF-α和IL-1β含量没有显著变化[48-49]。王晓娜等[35]对出栏育肥牛进行5 h运输后血清中TNF-α含量显著降低。本研究中，羔羊运输前后不同处理对血清TNF-α和IL-1β含量无显著影响，运输后不同时间点血清TNF-α和IL-1β含量也无显著差异。血清TNF-α和IL-1β含量的变化可能与品种、年龄和应激强度等有关，究其原因还有待于进一步研究。
4 结论羔羊在运输后7 d内应激最强烈，不同的运输应激干预处理和时间影响了羔羊的生长性能、血清应激指标、免疫指标和炎症因子含量，其中羔羊运输前2 d至运输后7 d在基础饲粮中添加电解多维0.375 g/(d·只)抗运输应激效果最佳。
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