菠萝是四大热带水果之一。中国是菠萝种植大国，广东省徐闻县更是全国最大的菠萝种植基地，每年产量占全国产量的33.3%，被誉为“菠萝之乡”[1]。在菠萝加工处理过程中，会产生1/2以上的菠萝渣(pineapple residue)。加工产生的菠萝渣主要为果皮、花冠等，研究表明，其营养成分与菠萝果肉接近，富含粗蛋白质(CP)、粗灰分(Ash)、可溶性糖(WSC)、粗脂肪(EE)、维生素C和粗纤维(CF)等，是良好的饲料资源[2]。但由于具有高水分和高含糖量等特点，菠萝渣作为饲料不易保存且不利于动物消化利用，而青贮饲料技术可以很好地解决这一问题。Gowda等[3]通过对菠萝渣青贮并将其混合饲粮饲喂绵羊发现，菠萝渣青贮后保存时间得以延长，营养价值优于玉米青贮饲料，能改善泌乳性能，对动物机体无不利影响。Mello等[4]研究表明，菠萝渣青贮饲料是牛饲粮中的良好饲料。Cutrim等[5]通过研究菠萝副产品青贮饲料代替象草对羔羊的影响发现，菠萝副产品青贮饲料代替象草等饲料没有改变绵羊的能量消耗和生长性能，且能有效降低生产成本。
EM菌(effective microorganisms)是一种复合微生物制剂，含有80多种微生物，目前已被广泛运用于包括畜牧业在内的多个行业[6-7]。许多研究也已证实，EM菌对一些饲料青贮品质起优化作用。薛春胜等[8]通过以陇东紫花苜蓿为原料，分析不同添加剂对其青贮发酵品质的影响发现，甲酸、蔗糖、EM菌和纤维素酶都可以提高陇东紫花苜蓿青贮的发酵品质、营养价值，延长有氧稳定性。谢晓华等[9]研究表明，以大麦为原料，添加植物乳杆菌和EM菌可以改善大麦发酵品质，降低发酵产物pH和氨氮浓度。
综上所述，本研究将EM菌作为菠萝渣青贮添加剂，研究其对菠萝渣青贮品质的影响，同时，结合体外产气试验，测定相关指标，以期找到最适EM菌添加剂量，综合评价EM菌青贮菠萝渣的营养价值，为其资源开发提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 试验材料菠萝渣：由徐闻县某食品加工公司提供，营养水平见表 1。EM菌：由河南省某贸易有限公司提供，主要成分为双歧杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、丁酸梭菌、光合细菌和解磷钾菌等(≥100亿个/mL)。瘤胃液：由体重(25.75±0.78) kg的3只雷州山羊提供。
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表 1 菠萝渣营养水平(干物质基础) Table 1 Nutrient levels of pineapple residue (DM basis) |
青贮试验：试验设对照组及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，EM菌添加剂量分别为0、24、48和96 mL/kg，每组3个重复；将各组EM菌与菠萝渣混合均匀后装入青贮袋，每袋4 kg，真空密封后于青贮桶内(26.0±0.5) ℃青贮30 d。
体外产气试验：以青贮试验后的青贮菠萝渣为发酵底料，每个发酵瓶内装入1.25 g样品和70 mL人工瘤胃液，恒温培养箱(39.0±0.5) ℃分别培养6、12、24、48 h。每个时间点设置5个重复和2个空白对照。
1.3 人工瘤胃液的制备缓冲液：参照Menke等[10]方法配制；人工瘤胃液：缓冲液与瘤胃液按照1 ∶ 9的比例均匀混合制得[11]。
1.4 指标测定与方法参照AOAC(1995)[12]方法测定常规营养成分；采用范氏(Van Soest)洗涤纤维法测定中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量；采用S220-K型酸度计测定pH；采用氧化镁蒸馏法测定氨态氮(NH3-N)含量；采用蒽酮比色法测定WSC含量；采用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐含量；采用高效液相色谱仪测定青贮样品乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量；采用针筒法测定产气量(GP)；采用Agilent 6890气相色谱仪测定体外产气试验样品挥发性脂肪酸(VFA)浓度。
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式中：DMI为干物质(DM)的随意采食量占动物体重(BW)的百分比(%)；DDM为可消化DM占DM的百分比(%)；RFV为相对饲用价值。
1.5 统计分析采用SPSS 20.0软件中one-way ANOVA程序进行方差分析，Duncan氏法进行多重比较，结果用“平均值±标准差”表示，P < 0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。
2 结果与分析 2.1 青贮试验 2.1.1 添加EM菌对青贮菠萝渣感官评定与营养水平的影响由表 2可知，与对照组相比，Ⅰ组和Ⅱ组质地得分显著增加(P < 0.05)。对照组气味得分与Ⅰ组差异不显著(P>0.05)，但显著高于Ⅱ组和Ⅲ组(P < 0.05)；Ⅰ组气味得分与Ⅱ组差异不显著(P>0.05)，但显著高于Ⅲ组(P < 0.05)；整体来看，随着EM菌添加剂量的提高，颜色得分呈先上升再下降的趋势(P=0.053)。
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表 2 EM菌对青贮菠萝渣感官评定的影响 Table 2 Effects of EM on sensory evaluation of silage pineapple residue |
由表 3可知，对照组与Ⅱ组的DM含量差异不显著(P>0.05)，但显著高于Ⅰ组和Ⅲ组(P < 0.05)；Ⅲ组DM含量显著高于Ⅰ组(P < 0.05)。对照组、Ⅰ组和Ⅲ组间的CP含量差异不显著(P>0.05)，但显著低于Ⅱ组(P < 0.05)。随着EM菌添加剂量的提高，Ash含量呈上升趋势(P=0.077)。各组间NDF、ADF、Ca和P含量差异不显著(P>0.05)。
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表 3 EM菌对青贮菠萝渣营养水平的影响(干物质基础) Table 3 Effects of EM on nutrient levels of silage pineapple residue (DM basis) |
由表 4可知，各EM菌添加组氨态氮/总氮(NH3-N/TN)比值显著低于对照组(P < 0.05)，Ⅱ组和Ⅲ组间差异不显著(P>0.05)，但显著低于Ⅰ组(P < 0.05)。Ⅱ组WSC含量显著高于其他组(P < 0.05)，对照组和Ⅰ组间差异不显著(P> 0.05)，但显著高于Ⅲ组(P < 0.05)。Ⅰ组亚硝酸盐含量最低，Ⅲ组亚硝酸盐含量分别与对照组和Ⅱ组差异不显著(P>0.05)；对照组亚硝酸盐含量显著低于Ⅱ组(P < 0.05)。各组间pH和RFV差异不显著(P>0.05)，但RFV均大于100。
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表 4 EM菌对青贮菠萝渣相关指标的影响 Table 4 Effects of EM on related indexes of silage pineapple residue |
由表 5可知，各组间的LA、AA、PA含量和乳酸/总酸值差异均不显著(P>0.05)。
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表 5 EM菌对青贮菠萝渣有机酸含量的影响 Table 5 Effects of EM on organic acid contents of silage pineapple residue |
由表 6可知，发酵48 h时，Ⅲ组GP显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P < 0.05)，与对照组差异不显著(P>0.05)。
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表 6 EM菌青贮菠萝渣对体外发酵GP的影响 Table 6 Effects of silage pineapple residue with EM on GP in vitro fermentation |
由表 7可知，整个发酵期间，各组间DM降解率差异不显著(P>0.05)。
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表 7 EM菌青贮菠萝渣对体外发酵干物质降解率的影响 Table 7 Effects of silage pineapple residue with EM on DMD in vitro fermentation |
由表 8可知，体外发酵6 h时，对照组、Ⅱ组和Ⅲ组间的CP降解率差异不显著(P>0.05)，但显著高于Ⅰ组(P < 0.05)。发酵12 h时，对照组、Ⅰ组和Ⅱ组间的CP降解率差异不显著(P>0.05)，但显著低于Ⅲ组(P < 0.05)。发酵24 h时，对照组CP降解率显著低于其他组(P < 0.05)，Ⅱ组CP降解率分别与Ⅰ组和Ⅲ组差异不显著(P>0.05)，但Ⅲ组CP降解率显著高于Ⅰ组(P < 0.05)。发酵48 h时，对照组与Ⅰ组间CP降解率差异不显著(P>0.05)，但均显著低于Ⅱ组和Ⅲ组(P < 0.05)，Ⅱ组CP降解率显著高于Ⅲ组(P < 0.05)。
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表 8 EM菌青贮菠萝渣对体外发酵粗蛋白质降解率的影响 Table 8 Effects of silage pineapple residue with EM on CPD in vitro fermentation |
由表 9可知，体外发酵6 h时，与对照组相比，Ⅰ组和Ⅲ组NDF降解率显著降低(P < 0.05)，Ⅲ组NDF降解率显著低于Ⅱ组(P < 0.05)；体外发酵24 h时，随着EM菌添加剂量的提高，NDF降解率呈先下降后上升再下降的趋势(P=0.073)；体外发酵48 h时，各组间差异不显著(P>0.05)，但NDF降解率均超过80%。
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表 9 EM菌青贮菠萝渣对体外发酵中性洗涤纤维降解率的影响 Table 9 Effects of silage pineapple residue with EM on NDFD in vitro fermentation |
由表 10可知，体外发酵6 h时，与对组相比，Ⅱ组pH显著降低(P < 0.05)，Ⅲ组pH显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P> 0.05)。体外发酵12 h时，与对照组相比，Ⅰ组和Ⅱ组pH显著降低(P < 0.05)，Ⅲ组pH显著上升(P < 0.05)；体外发酵24和48 h时，各组间pH差异不显著(P>0.05)。
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表 10 EM菌青贮菠萝渣对体外发酵pH的影响 Table 10 Effects of silage pineapple residue with EM on pH in vitro fermentation |
由表 11可知，体外发酵6 h时，Ⅱ组NH3-N含量显著低于其他组(P < 0.05)；发酵12和24 h时，各组间NH3-N含量差异不显著(P>0.05)；48 h时，Ⅲ组NH3-N含量显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。
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表 11 EM菌青贮菠萝渣对体外发酵NH3-N含量的影响 Table 11 Effects of silage pineapple residue with EM on NH3-N contents in vitro fermentation |
由表 12可知，体外发酵6 h时，EM菌添加组间BA含量差异不显著(P>0.05)，但显著低于对照组(P < 0.05)。体外发酵24 h时，Ⅱ组AA含量显著高于Ⅰ和Ⅲ组(P < 0.05)，但与对照组差异不显著(P>0.05)，对照组AA含量显著高于Ⅰ组(P < 0.05)，与Ⅲ组差异不显著(P>0.05)；随着EM菌添加剂量的提高，PA含量呈先下降再上升再下降的趋势(P=0.090)。其他组间差异不显著(P>0.05)。
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表 12 EM菌青贮菠萝渣对体外VFA含量的影响 Table 12 Effect of silage pineapple residue with EM on VFA contents in vitro fermentation |
饲料中的硝酸盐容易在贮存和加工过程中转变为亚硝酸盐，这类外源性亚硝酸盐是动物机体内亚硝酸盐的主要来源。摄入过多的亚硝酸盐容易导致动物中毒，产生畸变，降低饲料的营养价值。另外亚硝酸盐含量过高，影响饲料适口性，降低了采食量，对动物生长性能造成影响[16-17]。我国对饲料中亚硝酸盐含量也有具体要求，饲料原料和配合饲料中亚硝酸盐含量需低于15 mg/kg[18]，本研究结果，各组的亚硝酸盐含量变化范围在4.33~7.67 mg/kg，属正常范围内，符合国家行业标准。
饲粮中蛋白质含量决定了动物摄入蛋白质水平，适宜的蛋白质水平能改善动物的生产性能和动物产品品质等[19]。当动物机体的碳水化合物和脂肪不足以供能时，蛋白质也能分解释放能量。本研究结果表明，添加EM菌青贮菠萝渣，CP含量得到提高，与葛剑等[20]、马燕欣等[21]和韩建成等[22]研究结果一致。且本试验以Ⅱ组青贮菠萝渣的CP含量最高，为14.58%。
ADF和NDF能为反刍动物提供热能，NDF含量与饲料适口性息息相关，而ADF难以被消化，含量越高，饲料品质越差[23]。RFV综合反映了ADF和NDF情况，粗饲料的营养价值与RFV值呈正相关，若RFV值大于100则说明该饲料营养价值较高[24]。青贮饲料NH3-N/TN比值反映了饲料蛋白质和氨基酸分解的程度，数值越大则表明蛋白质被分解越多，青贮效果不佳；通常其比值应低于1/10。饲料青贮过程是乳酸菌将WSC转化为LA的过程[25]。本研究结果，青贮后，菠萝渣ADF含量降低，NH3-N/TN比值减小，RFV大于100，说明菠萝渣青贮以及添加EM菌青贮，品质都得到了改善，且以Ⅱ组青贮菠萝渣WSC含量最高，该添加剂量有可能是本试验条件下，改善菠萝渣青贮品质的最适剂量。作为饲料青贮过程中重要的VFA，LA和AA能抑制霉菌活性，AA还能抑制其他有害细菌的生长，防止饲料腐败变质；而PA在青贮过程中，具有抗真菌作用，能有效保存饲料营养成分[26]。本研究结果以Ⅲ组各有机酸含量最低，这可能是EM菌添加剂量过高，营养物质不足以支撑乳酸菌生长繁殖。
3.2 EM菌青贮菠萝渣饲用价值评价 3.2.1 EM菌青贮菠萝渣对体外发酵GP和营养物质降解率的影响体外产气试验中，GP是综合反映饲料可发酵程度和可利用性的重要指标之一[27]。本研究结果显示，体外发酵48 h，Ⅲ组GP高于其他组，这可能与其含有更少的NDF有关[28]。NDF主要成分包括纤维素、半纤维素、木质素和硅胶等；瘤胃内，NDF的降解主要依靠纤维分解菌[29]。本研究中，NDF降解主要发生在12~24 h，降解率在59.46%~77.51%，说明各组NDF能被瘤胃纤维分解菌分解；48 h时，发酵达到平衡。DM降解率能反映发酵过程中瘤胃微生物对饲料的利用程度[30]。本试验表明，随着发酵时间的延长，DM降解率升高，这表明瘤胃微生物对菠萝渣降解程度升高，整个发酵期以6~24 h DM降解速度快，达到后期，发酵处于平衡状态，降解速度减缓。
饲料CP在瘤胃中的降解率是反映瘤胃内微生物对其降解利用率的参考指标之一。严学兵[31]研究表明，饲料中CP含量与其在瘤胃中降解率呈正相关，这与本研究结果相同，发酵到达48 h，各组CP降解率均超过90%；与对照组相比，各添加组CP降解率更高，其中，以Ⅱ组和Ⅲ组CP降解率较高，分别为96.25%和95.24%。
3.2.2 EM菌青贮菠萝渣对体外发酵pH、NH3-N和VFA含量的影响瘤胃pH是评价瘤胃发酵状况的一项重要指标，一般在5.5~6.8变化[32]。本试验显示，发酵6 h时，各组pH变化范围在7.30~7.36；发酵48 h时，各组pH差异不显著，变化范围在6.38~6.51，发酵状况正常，这也说明青贮菠萝渣能维持体外瘤胃正常发酵。
通常蛋白质在瘤胃内被降解为NH3-N和其他物质，微生物利用降解的NH3-N合成菌体蛋白(MCP)，因此NH3-N含量反映了蛋白质的消化情况[33]。本试验发酵过程中，各组NH3-N含量变化范围在8.52~16.40 mg/dL，与Illius等[34]报道NH3-N在瘤胃内含量为6~30 mg/dL结果相同，属正常范围，这也说明青贮菠萝渣或添加EM菌青贮菠萝渣都有利于瘤胃微生物增殖。另外，发酵48 h后，Ⅱ组NH3-N含量低于其他组，而Ⅱ组CP降解率更高，这可能是由于48 mL/kg EM菌青贮菠萝渣在体外发酵过程中，更多的CP被微生物利用合成MCP。具体可进一步研究，检测MCP含量。
VFA占反刍动物吸收能量的70%~80%，是反刍动物重要能量来源；其中AA、PA和BA占VFA总量95%左右[35]。在反刍动物体内，AA用于合成乳脂，PA用于合成体脂和乳糖，AA与PA的比值可以反映能量利用的情况[36]。本研究中，发酵48 h后，各组AA/PA值均超过2，以Ⅰ组比值最大，为2.48。这说明添加EM菌能改善菠萝渣青贮品质，在瘤胃发酵中提供更多能量。
4 结论① 菠萝渣青贮和添加EM菌青贮后，品质都得到改善，都能在体外瘤胃中正常发酵，营养物质降解率得到提高。
② 通过青贮试验和体外产气试验，综合比较各组结果，在本试验条件下，青贮菠萝渣最适EM菌添加剂量为48 mL/kg。
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