锌是肉仔鸡生长发育所必需的微量元素,参与体内200多种酶和辅酶的组成,同时参与体内碳水化合物和蛋白质等营养物质的代谢,对提高动物免疫机能、生产性能和繁殖性能具有重要作用[1]。饲料中的锌主要通过有机锌或以硫酸锌为主的无机锌来添加。一般认为,硫酸锌溶水性高,在饲料贮存或在肠道消化过程中易与其他营养素产生拮抗,在畜禽肠道中吸收少、排泄多,生物学利用率不高[2];而有机锌通过锌与有机分子形成络合物后进入肠道,其性质稳定,不与其他营养素发生化学反应,并可能经过不同的吸收通道[3],因此表现出相对较高的生物学利用率[4]。研究表明,低水平的有机锌在对肉鸡[5-6]和生长猪[7]生产性能及血液指标的提升作用方面均优于高水平硫酸锌,但有机锌生产工艺复杂、使用成本过高[8],限制了其的应用。因此,寻求一种生物学利用率高、成本低的新型锌源对绿色畜牧生产具有重要的意义。
碱式氯化锌(basic zinc chloride,BZC)是一种新型的无机锌源,通过金属的高纯形式与水、盐酸反应制成[9]。BZC的晶体结构是由可溶性金属离子、多个羟基和氯离子之间的共价键形成的[10],在水中溶解度低,在酸性溶液中溶解度高,与饲料中与其他成分的反应较小[11]。本试验旨在探究不同锌源及添加水平对肉仔鸡生长性能的影响,并以生长性能、血液指标和胰脏金属硫蛋白(metallothionein,MT)mRNA表达量为指标,评定其相对生物学利用率,为开发新型饲料锌源添加剂提供理论基础和实践参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所用3种锌源分别为一水合硫酸锌(zinc sulfate monohydrate,ZSM)、BZC和蛋白锌(protein zinc,PRZ)。其中ZSM为化学纯,锌含量为34%;BZC是由市场购得产自广州某公司的碱式盐,锌含量为58%;PRZ是由市场购得产自某国外企业的蛋白锌盐,锌含量为12%。
1.2 试验设计本试验采用双因素(3×3+1)完全随机试验设计,选取720只1日龄健康雄性爱拔益加(AA)肉仔鸡,随机分为10个组,每组6个重复,每个重复12只鸡。对照组饲喂基础饲粮,3个ZSM组分别饲喂在基础饲粮基础上添加20、40和80 mg/kg ZSM的饲粮,3个BZC组分别饲喂在基础饲粮基础上添加20、40和80 mg/kg BZC的饲粮,3个PRZ组分别饲喂在基础饲粮基础上添加20、40和80 mg/kg PRZ的饲粮。各组不同锌源添加量均以锌计。试验在中国农业科学院昌平区南口试验基地进行;试验期42 d,分为1~14日龄、15~28日龄和29~42日龄3个阶段。
1.3 饲养管理试鸡饲养于不锈钢镀塑肉鸡笼内,采用3层笼养,自由采食和饮水。试验前对鸡舍及周围环境进行熏蒸消毒。鸡舍温度第1周为33~35 ℃,之后每周下降2 ℃,直至室温26 ℃;采用24 h光照,常规免疫。试验前3 d饲喂粉料,3 d后饲喂颗粒料。
1.4 基础饲粮基础饲粮参照NRC(1994)肉仔鸡营养需要配制,为玉米-豆粕型饲粮,其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
分别于14、28和42日龄08:00对每组每重复鸡进行空腹称重,记录各个重复的饲喂量和剩余量,计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.5.2 样品采集和制备分别于第14和28日龄,各重复选取1只体重接近平均体重的肉仔鸡(即每组6只),脱臼致死后采取血样(肝素钠抗凝),离心获取血浆以备分析血浆锌含量及其他生理生化和抗氧化指标。立即采集胰脏、脾脏、肾脏和左右2侧腿胫骨。其中,肾脏、胰脏于-20 ℃保存;剪取黄豆粒大小胰脏于冻存管中置于-196 ℃液氮中保存,以备测定胰脏锌相关蛋白mRNA表达量;留取部分脾脏和肾脏于-20 ℃冻存,以备后续进行肾脏和脾脏锌含量的测定。肉仔鸡双侧腿胫骨处理:去离子水冲洗后,煮沸,剥除干净外层附着物,再次冲洗,550 ℃下灰化至恒重,用于后续分析胫骨灰锌含量。
1.5.3 样品锌含量和血液指标饲粮、胫骨、胰脏、肾脏和脾脏锌含量采用浓硝酸和高氯酸进行湿消化前处理,使用Agilent 7900电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)仪测定;血浆锌含量采用锌离子测定试剂盒(PAPS显色剂法,南京建成生物工程研究所),使用全自动生化分析仪测定;血浆5′-核苷酸酶(5′-NT)活性采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(梅里亚公司,法国),采用全自动生化分析仪测定;血浆谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、碱性磷酸酶(ALP)活性以及白蛋白(ALB)、丙二醛(MDA)含量采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定;血浆铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性,采用超氧化物歧化酶(SOD)分型测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定。测定操作方法严格按照试剂盒说明书进行。
1.5.4 胰脏锌相关蛋白mRNA表达量胰脏锌相关蛋白mRNA表达量采用SYBR Green实时荧光定量(qRT-PCR)法测定。按照SuperScript ⅢTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒(购自Invitrogen公司)合成cDNA模板,根据鸡MT、锌转运蛋白-2(zinc transporter-2,ZnT-2)、锌转运蛋白-5(zinc transporter-5,ZnT-5)、金属调节转录因子1(metal regulatory transcription factor 1,MTF1)、二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transport 1,DMT1)和管家基因——磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)序列,分别设计合成其扩增引物,引物序列见表 2。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
试验数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析,采用two-way ANOVA程序进行双因素方差分析,统计模型包括锌源、锌水平及互作效应。方差分析差异显著者(P < 0.05),以Duncan氏法进行多重比较检验,结果以平均值和均值标准误(SEM)表示,以P < 0.05为差异显著,0.05 < P < 0.10表示有差异显著趋势。
采用线性回归方法,以各个阶段锌真实摄入量(采食量×实际锌含量)为自变量,相关评测指标为因变量拟合相关直线,以ZSM(100.00%)为标准,用斜率比法计算BZC和PRZ的相对生物学利用率。
2 结果与分析 2.1 不同锌源及添加水平对肉仔鸡生长性能的影响不同锌源及添加水平对肉仔鸡生长性能的影响见表 3。由表可知,1~14日龄,与对照组相比,饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌显著提高肉仔鸡ADG和14日龄体重(P < 0.05),显著降低F/G(P < 0.05)。在不同添加水平之间,40 mg/kg添加组ADG(27.59 g/d)显著高于20 mg/kg添加组(26.69 g/d)和对照组(25.39 g/d)(P < 0.05),F/G也显著低于其他添加组(P < 0.05)。在不同锌源之间,BZC组ADG(27.72 g/d)显著高于ZSM组(26.93 g/d)和PRZ组(27.04 g/d)(P < 0.05),F/G(1.19)显著低于ZSM组(1.23)(P < 0.05)。各组之间,以40 mg/kg BZC组ADG最高(28.11 g/d)、F/G最低(1.13)。15~28日龄,随着饲粮锌添加水平的提高,肉仔鸡ADG有提高的趋势(P=0.096)。与对照组相比,饲粮添加不同锌源对ADG和F/G无显著影响(P > 0.05);在不同锌源之间,BZC组ADFI(112.01 g/d)显著高于PRZ组(106.65 g/d)(P < 0.05)。29~42日龄,随着饲粮锌添加水平的提高,肉仔鸡ADG有提高的趋势(P=0.081),F/G有降低的趋势(P=0.070)。1~42日龄,与对照组相比,饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌对肉仔鸡生长性能无显著影响(P > 0.05)。此外,各试验组试鸡的死淘率较低,但各组间均无显著差异(数据未列出)(P > 0.05)。
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表 3 不同锌源及添加水平对肉仔鸡生长性能的影响 Table 3 Effects of different zinc sources and supplemental levels on growth performance of broilers |
以上结果表明,饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌对本试验条件下肉仔鸡生长前期(1~14日龄)ADG和F/G有显著影响,且以添加40 mg/kg BZC效果最佳。
2.2 不同锌源及添加水平对肉仔鸡血液指标的影响不同锌源及添加水平对肉仔鸡血液指标的影响见表 4和表 5。由表 4可知,14日龄,饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌显著影响肉仔鸡血浆锌含量(P < 0.05);其中,80 mg/kg添加组血浆锌含量显著高于其他添加组(P < 0.05),PRZ组显著高于ZSM组和BZC组(P < 0.05)。饲粮添加不同锌源显著影响肉仔鸡血浆ALP、T-SOD和CuZn-SOD活性(P < 0.05);其中,BZC组血浆ALP活性显著高于ZSM组(P < 0.05),PRZ组血浆T-SOD和CuZn-SOD活性显著高于ZSM组和BZC组(P < 0.05)。由表 5可知,28日龄,饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌及其互作效应对肉仔鸡血液指标均未产生显著影响(P > 0.05)。
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表 4 不同锌源及添加水平对14日龄肉仔鸡血液指标的影响 Table 4 Effects of different zinc sources and supplemental levels on blood indices of broilers at 14 days of age |
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表 5 不同锌源及添加水平对28日龄肉仔鸡血液指标的影响 Table 5 Effects of different zinc sources and supplemental levels on blood indices of broilers at 28 days of age |
不同锌源及添加水平对肉仔鸡组织锌含量的影响见表 6(PRZ组未测定)。由表可知,饲粮添加不同水平锌显著影响14和28日龄肉仔鸡胫骨锌含量(P < 0.05),且随着锌水平的提高,胫骨锌含量逐渐提高;其中,80 mg/kg添加组胫骨锌含量显著高于对照组(P < 0.05)。饲粮添加不同锌源对肉仔鸡胫骨锌含量无显著影响(P > 0.05),饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌及其互作效应对肉仔鸡胰脏和肾脏锌含量均无显著影响(P > 0.05)。
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表 6 不同锌源及添加水平对肉仔鸡组织锌含量的影响 Table 6 Effects of different zinc sources and supplemental levels on zinc content in various tissues of broilers |
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表 7 不同锌源及添加水平对14日龄肉仔鸡胰脏锌相关蛋白mRNA表达量的影响 Table 7 Effects of different zinc sources and supplemental levels on zinc related protein mRNA expression in pancreas of broilers at 14 days of age |
不同锌源及添加水平对肉仔鸡胰脏锌相关蛋白mRNA表达量的影响见表 8和表 9。由表可知,与对照组相比,饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌显著提高14日龄肉仔鸡胰脏MT mRNA表达量(P < 0.05),且PRZ组14日龄胰脏MT mRNA表达量显著高于ZSM组和BZC组(P < 0.05),PRZ组28日龄胰脏MT mRNA表达量显著高于ZSM组(P < 0.05)。饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌及其互作效应对肉仔鸡胰脏DMT1、MTF1、ZnT-2和ZnT-5 mRNA表达量均无显著影响(P > 0.05)。
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表 8 不同锌源及添加水平对28日龄肉仔鸡胰脏锌相关蛋白mRNA表达量的影响 Table 8 Effects of different zinc sources and supplemental levels on zinc related protein mRNA expression in pancreas of broilers at 28 days of age |
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表 9 基于肉仔鸡1~14日龄生长性能、14日龄血液指标和胰脏MT mRNA表达量评价BZC相对生物学利用率 Table 9 Relative bioavailability evaluation of BZC based on growth performance from 1 to 14 days of age, and blood indices and MT mRNA expression level at 14 days of age in broilers |
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表 10 基于肉仔鸡组织锌含量评价BZC相对生物学利用率 Table 10 Relative bioavailability evaluation of BZC based on zinc content in broiler tissues |
根据以上试验结果,以ZSM生物学利用率为参照标准(100.00%),分别选择肉仔鸡生长前期(1~14日龄)ADG和F/G、14日龄血浆锌含量和ALP、T-SOD、CuZn-SOD活性以及胰脏MT mRNA表达量为评价指标,对BZC相对生物学利用率进行评价,结果见表 9。由表可知,以ADG、F/G和MT mRNA表达量为评价指标,BZC的相对生物学利用率分别为110.82%、113.55%和107.87%;以血浆锌含量和ALP、T-SOD、CuZn-SOD活性为评价指标,BZC的相对生物学利用率分别为97.55%、113.26%、98.90%和111.58%;以ADG、F/G和MT mRNA表达量为评价指标,RPZ的相对生物学利用率分别为102.90%、113.38%和130.56%;以血浆锌含量和ALP、T-SOD、CuZn-SOD活性为评价指标,PRZ的相对生物学利用率分别136.68%、109.64%、113.86%和96.56%。
以ZSM生物学利用率为参照标准(100.00%),分别选择选择肉仔鸡14和28日龄胫骨、胰脏和肾脏锌含量为评价指标,对BZC相对生物学利用率进行评价,结果见表 10。由表可知,以14日龄肉仔鸡胫骨、胰脏和肾脏锌含量为评价指标,BZC的相对生物学利用率分别为119.93%、113.30%和95.81%;以28日龄肉仔鸡胫骨、胰脏和肾脏锌含量为评价指标,BZC的相对生物学利用率分别为109.27%、94.95%和95.61%。由此可见,以胫骨锌含量为评价指标,BZC的相对生物学利用率高于ZSM;而以肾脏锌含量为评价指标,BZC的相对生物学利用率低于ZSM。
3 讨论 3.1 不同锌源及添加水平对肉仔鸡生长性能的影响BZC对猪鸡生长性能的影响有较多的报道,早期Batal等[12]报道在肉仔鸡饲粮中添加BZC,肉仔鸡ADG、ADFI和饲料转化率随着锌添加水平的提高呈二次曲线提高,雏鸡(8~22日龄)ADG随着锌添加水平的提高呈线性提高。Olukosi等[13-14]在2次肉鸡试验中研究表明,BZC能提高肉鸡的生长性能,其中1次试验发现其还可以改善肉鸡胴体品质。近期,M’Sadeq等[15]和Van Kuijk等[7]的报道显示,与饲喂硫酸锌相比,饲喂BZC对肉鸡的生长性能有积极的影响。用BZC代替硫酸锌在猪上的试验也证明,饲粮添加BZC替代硫酸锌可以改善育肥猪的生长性能[11]。Cemin等[16]研究发现,锌添加量为50 mg/kg时,育肥猪ADG最高,但锌添加量为125 mg/kg时,F/G有所提高。本试验中,饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌对肉仔鸡生长前期(1~14日龄)ADG和F/G有显著促进作用,且以添加40 mg/kg BZC效果最佳。由此可见,BZC作为一种新型无机锌源,在提高猪鸡生长性能方面较传统硫酸锌更有优势,其部分原因是认为其晶体结构由可溶性金属离子、多个羟基和氯离子之间的共价键形成[17],在水中溶解度低,在酸性溶液中溶解度高,饲粮中其他营养成分对其活性的影响较小[11],而有关其促生长的分子机理还有待进一步研究。
3.2 不同锌源及添加水平对肉仔鸡血液指标和组织锌含量的影响锌通过饲粮被动物采食,经过血液运往全身从而发挥其生理作用,动物机体对锌的吸收利用可以直接或者间接的通过血液锌含量反映出来。本试验中,与对照组相比,饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌显著影响肉仔鸡14日龄血浆锌含量,其中,80 mg/kg添加组血浆锌含量显著高于其他添加组,PRZ组显著高于ZSM和BZC组;但对28日龄血浆锌含量没有显著影响。肉仔鸡前期生长速度快,对锌需求量较高;随着日龄的增长,对锌的需求量下降,低水平锌就能满足其需要量,而过高的锌并不会促进生长,甚至超过一定剂量会出现锌中毒。李杰等[5]研究表明,血液锌含量随饲粮锌添加水平的提高而提高,当锌添加水平为50 mg/kg时,继续提高添加水平对血液锌含量没有显著影响。Wang等[6]研究表明,饲粮中添加低水平有机甘氨酸锌和高水平无机氧化锌对断奶仔猪血清锌含量均具有促进作用。牛现琇[18]在30~60 kg育肥猪的试验中发现,低水平有机蛋氨酸锌组血清锌含量显著高于高水平硫酸锌组。添加有机锌提高血液锌含量的原因可能是由于有机锌与无机锌的吸收机制不同导致吸收率不同,离子锌不能穿过消化道细胞膜,只有与有机分子结合成络合物才能通过[19],从而更接近吸收机制的有机锌即使添加水平低也能对肉仔鸡血浆锌含量产生较大影响。
锌作为动物机体组织结构参与体内300多种酶的构成,ALP为其中一种,通常被用做评价矿物质在动物体内的吸收情况。ALP能将核酸去磷酸化,其活性与含量能侧面反映血液锌含量的高低。本试验结果发现,饲粮添加不同锌源能显著提高14日龄肉仔鸡血浆ALP活性,且BZC组显著高于ZSM组;此外,与ZSM组和BZC组相比,PRZ组14日龄肉仔鸡血浆CuZn-SOD活性显著提高。徐振华[20]和王中成[21]的报道与本试验结果相同,饲粮添加各种形式的锌(有机和无机)均能提高动物机体血清CuZn-SOD活性,且有机锌的添加要优于无机锌。Van等[7]报道,无机锌BZC等羟基氯化物可能通过维持维生素E来维持其机体抗氧化能力。
组织中微量元素的含量可以反映锌源的生物学利用率。动物机体组织中的锌含量会因饲粮中锌的缺乏或过量以及动物机体对锌的吸收情况而发生相应改变。肉仔鸡中锌主要沉积在腿胫骨之中,只有少数锌沉积在肌肉和脑等组织中。本试验结果发现,饲粮添加不同水平锌显著影响肉仔鸡14和28日龄胫骨锌含量,且随着锌水平的提高,胫骨锌含量逐渐提高。
3.3 不同锌源及添加水平对肉仔鸡胰脏锌相关蛋白mRNA表达量的影响MT对锌离子具有高度亲和力,参与锌离子贮存、运输以及代谢,在动物机体锌稳衡的调节机制中发挥着极其重要的作用[22]。MT的表达受锌离子的转入及机体对锌的吸收影响。本试验结果发现,饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌显著影响14日龄肉仔鸡胰脏MT mRNA表达量,廖秀冬[23]和曹家银等[24]的试验结果与本试验一致,即随着饲粮锌添加水平的提高,肉鸡胰脏MT mRNA表达量呈线性提高。此外,本试验结果还发现,PRZ组14日龄胰脏MT mRNA表达量显著高于ZSM组和BZC组,PRZ组28日龄胰脏MT mRNA表达量显著高于ZSM组。Huang等[25]在研究锌源和锌水平对肉仔鸡胰脏MT mRNA表达量的影响时发现,加锌组胰脏MT mRNA表达量均显著高于空白对照组,并随着锌水平提高线性提高,不同锌源组的胰脏MT mRNA表达量也存在显著差异。
3.4 BZC相对生物学利用率评价本试验结果发现,以ZSM为参照(100.00%),以肉仔鸡1~14日龄ADG为评价指标,BZC的相对生物学利用率较高,平均值为110.82%。这与国内外相关报道类似,Batal等[12]研究发现,在肉仔鸡中,BZC较硫酸锌的相对生物学利用率高;Cao等[26]研究表明,当锌水平高于雏鸡的需求量时,BZC的相对生物学利用率估计值为107%;Huang等[27]以石斑鱼为研究对象,基于增重率(WGR)、血清过氧化氢酶(CAT)、T-SOD和CuZn-SOD活性以及整体锌含量和椎骨锌含量分析,以硫酸锌(100%)为参考,BZC的相对生物学利用率分别为169%、208%、214%、149%、124%和152%,BZC相对于硫酸锌的相对生物学利用率平均值为169.33%。由此可见,对所试验的动物来说,BZC的相对生物学利用率高于硫酸锌。
4 结论① 在玉米-豆粕型饲粮条件下,饲粮添加不同锌源和添加不同水平锌对肉仔鸡生长前期(1~14日龄)ADG和F/G有显著影响,且以添加40 mg/kg BZC(总锌含量为68.2~72.2 mg/kg)效果最佳。
② 在玉米-豆粕型饲粮条件下,锌通过影响锌相关酶活性和锌相关蛋白mRNA的表达来控制锌的沉积与代谢,饲粮添加BZC显著提高血浆ALP活性和胫骨中锌的沉积,而饲粮添加PRZ显著提高血浆T-SOD和CuZn-SOD活性以及胰脏MT mRNA表达量。
③ 以ZSM生物学利用率为参照标准(100.00%),采用不同评价指标,BZC的相对生物学利用率为94.95%~119.93%,PRZ的相对生物学利用率为96.59%~130.68%,BZC与PRZ效果相当。
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