解淀粉芽孢杆菌隶属于芽孢杆菌属，其作为益生菌使用已有60余年，具有优良的抑菌、产酶能力，且使用安全没有毒副作用，在畜牧业应用中具有提高动物生产性能、改善肠道菌群、增强免疫力等重要作用，作为饲用微生物制剂具有广阔的应用前景[1]。解淀粉芽孢杆菌可分泌多种抑菌物质，如表面活性素、伊枯草菌素等抗菌脂肽类物质，抗菌脂肽类物质具有显著的广谱抑菌活性，对细菌、真菌、病毒、支原体等都具有很好的抑制作用[2]。由解淀粉芽孢杆菌合成的活性较强的蛋白酶、淀粉酶、水解酶、脂肪酶等消化酶，能够降解木聚糖、果胶等植物性碳水化合物，从而提高饲料的利用率，促进畜禽生长[2]。除了良好的抑菌性，解淀粉芽孢杆菌还具有提高动物生产性能、增强免疫力、降低养殖污染[3]等功能。
研究表明，每2 d灌服1 mL浓度为1×109 CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌fsznc-06冻干菌剂可提高金堂黑山羊育肥羊的生长性能、屠宰性能、血清生化和免疫指标以及肌肉发育基因的相对表达量[4]；每2 d灌服1 mL浓度为1×109 CFU/mL的液体益生菌解淀粉芽孢杆菌fsznc-06能促进断奶金堂黑山羊瘤胃和小肠的发育，并通过增加有益细菌的丰富度来调节微生物群落，减少瘤胃和盲肠中致病菌的数量，促进营养代谢和提高健康状况[5]。饲粮中添加1×108 CFU/kg的解淀粉芽孢杆菌BaSC06，可通过提高育肥猪肠道消化酶活性、钠/葡萄糖协同转运蛋白1(SGLT1)和小肽转运蛋白1(PepT1)的表达，显著改善育肥猪的生长性能、肠道消化吸收功能和黏膜结构、抗氧化能力、免疫功能和肠道微生物群组成[6]。饲喂肉鸡4×106 CFU/g解淀粉芽孢杆菌TL，可减少回肠组织中的炎症反应，改善肉鸡免疫功能和减少肠道损伤，从而减少由免疫刺激引起的病原体负担和能量消耗，提高肉鸡对养分的吸收和利用，改善生长性能，实现高生产率[7]。解淀粉芽孢杆菌把饲养环境中的有机污染物当作碳源，能够有效降解饲养环境中的污染物质，抑制畜舍环境中某些有害微生物的生长，改善畜禽的饲养环境，从而降低养殖污染[8]。综上所述，解淀粉芽孢杆菌在畜禽生产中表现出了较好的应用效果，具有增强畜禽免疫能力、提高饲料利用率、改善肠道微生态环境、降低养殖污染等多种优良特性。目前，解淀粉芽孢杆菌在奶牛生产上的研究还未见报道，本研究拟通过研究解淀粉芽孢杆菌对奶牛泌乳性能、乳成分、免疫能力、抗氧化能力的影响，为解淀粉芽孢杆菌在奶牛养殖业上的应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用解淀粉芽孢杆菌粉剂由某公司提供，该菌剂含解淀粉芽孢杆菌活菌数为1×1011 CFU/g。
1.2 试验设计试验选用30头胎次(2.5±0.3)、初始体重[(559.2±37.4) kg]、产奶量[(35.16±1.50) kg/d]、泌乳天数[(99±2) d]相近的中国荷斯坦奶牛，采用随机分组试验设计分成3组，每组10头。3组奶牛在晨饲前分别口腔投喂0(对照组)、5×109、5×1010 CFU/d的解淀粉芽孢杆菌，于2019年5月21日至2019年8月1日进行为期52 d的饲养试验，其中预试期10 d，正试期42 d。试验期间采用全混合日粮(TMR)饲喂，每天3次，分别在07:00、13:00和19:00饲喂，散栏饲养，自由采食，饮水充足。试验期间使用阿菲金自动挤奶设备(90°并排平行畜栏结构，阿菲金公司，以色列)对试验牛每天早、中、晚挤奶3次并记录每天的产奶量。
1.3 试验饲粮动物饲养试验在奶牛营养学北京市重点实验室延庆基地进行。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
在整个试验阶段，每周采集1次TMR，-20 ℃保存。在试验结束后，将所有TMR样品混合均匀，取样测定干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维(NDF)、粗灰分(Ash)、钙(Ca)和磷(P)含量。使用WPL-125BE型电热恒温干燥箱(吴江台德烘箱电炉制造有限公司)将样品烘至恒重，测定DM含量(方法编号：930.15，AOAC)[9]。使用SER 148/6型脂肪测定仪(香港嘉盛科技有限公司)测定EE含量(方法编号：945.16，AOAC)[9]。使用KDY-9830型凯氏定氮仪(深圳市科拓电子有限公司)测定CP含量(方法编号：945.16，AOAC)[9]。使用2000i型全自动纤维测定仪(安康科技有限公司，美国)测定ADF和NDF含量。使用SX2-2.5-12A型马弗炉(上海柏欣仪器设备厂)测定Ash含量(方法编号：942.05，AOAC)[9]。使用UV752N型分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)，采用比色法测定P含量。使用PinAAcle500型原子吸收光谱分析仪(珀金埃尔默有限公司，美国)测定Ca含量。
1.4.2 奶样的采集与分析在正试期最后1 d采集每组试验牛早、中、晚的奶样，将早、中、晚奶样按4∶3∶3的比例混合，保存于加入2-溴-2-硝基-1, 3-丙二醇防腐剂的DHI奶样采集瓶。样品及时送至北京奶牛中心，使用乳成分分析仪(MilkoScan 605, Foss Electric, 丹麦)进行检测，检测指标包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、乳体细胞数(SCC)以及乳中尿素氮含量。
1.4.3 血样的采集与处理在正试期最后1 d于晨饲后3 h采集每组试验牛的血液，使用事先标记好的含有分离胶的促凝一次性采血管，通过尾静脉采集试验牛的血样10 mL。血样室温静置32 min后3 000×g离心15 min后获取血清，血清置于2 mL离心管中并做好标记，-80 ℃冷冻保存，用于血清中生化、抗氧化和免疫指标的检测。
1.4.4 血清生化指标的测定按照酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(南京建成生物科技有限公司)的说明书，使用酶标仪(Multiskan FC，赛默飞世尔仪器有限公司)对血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、尿素氮(UN)的含量及谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的活性进行测定。
1.4.5 血清免疫指标的测定按照ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)的说明书进行，使用酶标仪对血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)的含量进行测定。
1.4.6 血清抗氧化指标的测定按照ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)的说明书，使用酶标仪对血清总抗氧化能力(T-AOC)以及过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量进行测定。
1.5 数据统计与分析使用Excel 2007对试验数据进行初步处理，采用SPSS 19.0统计软件进行方差分析，组间采用Duncan氏法进行多重比较，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著，试验结果表示为平均值和均值标准误(SEM)。
2 结果与分析 2.1 解淀粉芽孢杆菌对奶牛泌乳性能及乳成分的影响由表 2可知，与对照组相比，补饲解淀粉芽孢杆菌对产奶量、4%乳脂校正乳产量和乳脂率的影响不显著(P＞0.05)；补饲解淀粉芽孢杆菌对乳糖率的影响不显著(P＞0.05)，但随着饲喂剂量的增加乳糖率有上升的趋势，补饲5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌相对于对照组乳糖率上升了2%；补饲5×109和5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌均可以显著提高乳蛋白率(P＜0.05)；补饲解淀粉芽孢杆菌对乳中尿素氮含量、SCC无显著影响(P＞0.05)。
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表 2 解淀粉芽孢杆菌对奶牛泌乳性能及乳成分的影响 Table 2 Effects of Bacillus amyloliquefaciens on lactation performance and milk composition of dairy cows |
由表 3可知，与对照组相比，补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌可以显著提高奶牛血清中TP、UA的含量以及ALT的活性(P＜0.05)；补饲5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌可以显著降低血清中UN的含量(P＜0.05)；补饲解淀粉芽孢杆菌对血清中ALB的含量和AST的活性无显著影响(P＞0.05)。
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表 3 解淀粉芽孢杆菌对奶牛血清生化指标的影响 Table 3 Effects of Bacillus amyloliquefaciens on serum biochemical indexes of dairy cows |
由表 4中可知，与对照组相比，补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌可以显著提高奶牛血清中IgA、IgM的含量(P＜0.05)，其中IgA含量提高50%，IgM含量提高34%；补饲5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌对奶牛血清中IgA、IgG、IgM的含量均无显著影响(P＞0.05)。上述结果说明，补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌可以通过调节奶牛机体免疫球蛋白分泌来影响奶牛的免疫能力。
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表 4 解淀粉芽孢杆菌对奶牛血清中免疫球蛋白含量的影响 Table 4 Effects of Bacillus amyloliquefaciens on serum immunoglobulin contents of dairy cows |
由表 5可知，与对照组相比，补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌显著提高了奶牛血清中IFN-γ的含量(P＜0.05)，对血清中其他炎性因子含量的影响不显著(P＞0.05)；补饲5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌显著降低了奶牛血清中TNF-α的含量(P＜0.05)，对血清中其他炎性因子含量的影响不显著(P＞0.05)。上述结果说明解淀粉芽孢杆菌通过影响奶牛机体炎性因子的分泌，增强奶牛的免疫能力。
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表 5 解淀粉芽孢杆菌对奶牛血清中炎性因子含量的影响 Table 5 Effects of Bacillus amyloliquefaciens on serum inflammatory factor contents of dairy cows |
由表 6可知，与对照组相比，补饲5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌可以提高奶牛血清中T-AOC，但效果不显著(P＜0.05)；补饲5×109、5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌对奶牛血清中MDA含量的影响不显著(P＞0.05)，但MDA含量呈现下降趋势；补饲5×109、5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌均可显著提高奶牛血清中GSH-Px的活性(P＜0.05)；补饲5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌使奶牛血清中CAT的活性显著升高(P＜0.05)，而补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌则使奶牛血清中CAT的活性显著降低(P＜0.05)。
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表 6 解淀粉芽孢杆菌对奶牛血清抗氧化指标的影响 Table 6 Effects of Bacillus amyloliquefaciens on serum antioxidant indexes of dairy cows |
研究表明，在饲粮中单独添加3种益生菌(酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌)和添加混合益生菌均可显著提高奶山羊的乳蛋白率、乳脂率和乳糖率，有效改善奶山羊的乳品质[10]。本研究中，补饲解淀粉芽孢杆菌虽然对奶牛的产奶量无显著影响，但补饲5×109和5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌均可以显著提高乳蛋白率，并有提高乳脂率、4%乳脂校正乳产量的趋势。乳脂富含多种酶、生长因子及免疫物质，具有很高的营养价值，乳脂率是判断乳品质的重要指标之一[11]。乳脂含有多种必需脂肪酸和脂溶性维生素，由甘油三酯(大于95%)和少量其他脂类合成，甘油三酯主要由脂肪酸合成[12]。脂肪酸的来源主要有2种：一种是瘤胃微生物分解脂类物质产生的脂肪酸，另一种是瘤胃微生物酵解碳水化合物产生的挥发性脂肪酸[13]。刘程等[14]研究发现，复合益生菌能够影响泌乳中期奶牛瘤胃菌群结构，提高瘤胃微生物蛋白浓度，改善瘤胃发酵，进而提高瘤胃中挥发性脂肪酸的生成。在本试验中，补饲5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌可以显著提高牛乳的乳脂率，可能是因为解淀粉芽孢杆菌通过改善瘤胃微生物的丰富度，影响了挥发性脂肪酸的生成。Ma等[15]研究表明，血清蛋白和免疫球蛋白是牛乳中乳蛋白形成的2种主要物质，免疫球蛋白包括IgG、IgM和IgA 3种成分。在本试验中，补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌提高了奶牛血清中IgA、IgG、IgM的含量，其中IgA的含量提高了50%，IgM的含量提高了34%，补饲5×109和5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌均可以显著提高乳蛋白率，可能是解淀粉芽孢杆菌显著提高了血清中IgG、IgM和IgA的含量，从而影响了乳蛋白的合成。乳糖的主要前体物质是葡萄糖，在反刍动物中，葡萄糖的主要来源是丙酸的肝脏糖异生，丙酸是通过瘤胃发酵产生的，是反刍动物肝脏糖异生的主要底物[16]。在本试验中，补饲解淀粉芽孢杆菌对乳糖率的影响不显著，可能是因为解淀粉芽孢杆菌对瘤胃内丙酸含量无显著影响，进而没有影响糖异生生成葡萄糖。
3.2 解淀粉芽孢杆菌对奶牛血清生化指标的影响血清生化指标在直接反映奶牛生理状态、器官功能和营养代谢状况方面起重要作用[17]。血清中TP含量能够反映动物的营养状况和机体的免疫情况[18]。Cecchinato等[19]研究表明，奶牛血清中TP的含量较高时，能够改善奶牛的健康状况和提高奶牛的免疫功能。本研究表明，补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌显著提高了奶牛血清中TP的含量，从而提高奶牛的免疫功能，促进奶牛健康生长。血清中UN的含量可反映机体对蛋白质的吸收、合成以及分解状况，是衡量蛋白质分解代谢和氨基酸平衡以及诊断疾病的重要指标[20]。Zhang等[21]研究表明，奶牛血清中UN的含量较低时，表明机体蛋白质代谢良好。在本研究中，补饲5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌显著降低了奶牛血清中UN的含量，表明解淀粉芽孢杆菌有助于提高奶牛的蛋白质代谢。血清UA含量是反映奶牛氮代谢情况的重要指标，血清ALT活性是评价肝脏损害的重要标志。赵淑敏等[22]研究表明，奶牛血清中UA的含量和ALT的活性降低，有利于氮的沉积及氮利用效率的提高，可减轻肝脏损伤，进而减轻奶牛肝脏的代谢压力。本研究中，补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌显著提高了奶牛血清中UA的含量和ALT的活性，表明解淀粉芽孢杆菌不利于氮的沉积，降低了氮的利用效率，不利于改善肝脏损伤。
3.3 解淀粉芽孢杆菌对奶牛免疫能力的影响益生菌芽孢杆菌能刺激机体的免疫系统，诱导机体发生免疫反应，提高机体抗体水平，从而提高机体的免疫能力[23]。免疫球蛋白是具有抗体活性的球蛋白，起着免疫调节的作用，主要包括IgA、IgG和IgM[24]。动物机体内免疫球蛋白含量的提高可以增强机体的免疫功能[25]。Wang等[26]研究发现，在饲粮中添加一定水平的益生菌丁酸梭菌和粪肠球菌均能显著提高仔猪血清IgA、IgG和IgM含量，从而提高仔猪的免疫力。肖宏德等[27]研究表明，在仔猪饲粮中添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌制成的益生菌制剂，可显著提高仔猪血液中IgG、IgA、IgM含量和特异性抗体水平，提高仔猪非特异性和特异性抗病能力，改善机体的免疫能力。在本试验中，补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌提高了奶牛血清中IgA、IgG、IgM的含量，说明解淀粉芽孢杆菌可以通过调节机体免疫球蛋白的分泌来增强奶牛的免疫能力。
TNF-α是一种强有力的促炎细胞因子，在自身免疫性疾病中发挥免疫抑制作用[28]。IL-1β是调节免疫反应和炎症的关键介质，具有促炎功能，炎症小体信号通路活化促使IL-1β过度分泌并导致炎症疾病的发生[29]。TNF-α、IL-1β均会对机体免疫应答造成负面影响[30]。研究表明，1×109 CFU/kg的枯草芽孢杆菌能够显著降低TNF-α、IL-1β的表达量，抑制嗜水气单胞菌引起的炎症反应，提高机体的免疫能力[31]。解淀粉芽孢杆菌TL106能够减轻大肠杆菌感染引起的炎症反应，降低促炎因子TNF-α、IL-1β的含量，通过减轻炎症反应来改善机体的免疫能力[32]。本研究结果表明，补饲5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌显著降低了奶牛血清中促炎因子IL-1β和TNF-α的含量，提高了奶牛的免疫能力。IL-2由活化的T细胞产生，参与淋巴细胞的稳定过程，IL-2可促进T细胞增殖和发育，提高机体的免疫耐受能力[33]。IFN-γ是T淋巴细胞亚群CD4+T、CD8+T和NK细胞分泌的细胞因子，通过对巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的活化作用来调节机体的免疫功能[34]。研究表明，饲粮中添加1×109 CFU/g枯草芽孢杆菌可显著提高断奶仔猪血清中IL-2和IFN-γ的含量，进而提高仔猪的免疫功能[35]。本研究结果表明，补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌能显著提高奶牛血清中IL-2和IFN-γ的含量，进而提高奶牛的免疫能力。
3.4 解淀粉芽孢杆菌对奶牛抗氧化能力的影响机体的抗氧化酶系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、CAT和GSH-Px，这些抗氧化酶能够提高机体的抗氧化能力，保护机体免受氧化应激[36]。研究表明，益生菌表现出一定的抗氧化活性，并减轻氧化应激造成的损害，改善机体抗氧化系统的能力[37]。Dowarah等[38]在仔猪基础饲粮中添加乳酸菌后显著提高了血清中CAT和SOD的活性，提高了机体的抗氧化能力。Jia等[39]在羔羊基础饲粮中添加地衣芽孢杆菌后显著升高了血清中SOD和GSH-Px的活性，提高了羔羊的抗氧化能力。付晓政等[40]在奶牛饲粮中添加复合益生菌后显著提高了血清中CAT和GSH-Px的活性，提高了奶牛的抗氧化能力。王阳[41]在仔猪饲粮中添加解淀粉芽孢杆菌后显著提高了血清中T-AOC、GSH-Px和SOD的活性，改善了机体的抗氧化功能。在本试验中，补饲解淀粉芽孢杆菌提高了奶牛血清中GSH-Px和CAT的活性，并且提高了奶牛血清的T-AOC，说明饲喂解淀粉芽孢杆菌能够提高奶牛的抗氧化能力。
4 结论奶牛补饲5×109 CFU/d解淀粉芽孢杆菌可以显著提高牛乳中乳蛋白率，并可提高机体的免疫能力；奶牛补饲5×1010 CFU/d解淀粉芽孢杆菌可以显著提高4%乳脂校正乳产量以及牛乳中乳脂率、乳蛋白率，并可增强机体的抗氧化能力。
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