维生素是动物维持生理机能所必需的一类低分子有机化合物，控制着动物机体内的新陈代谢^[1]。确定添加剂预混料产品中不同维生素的含量是产品质量控制和精准饲喂的重要基础。饲料中维生素的国家标准检测方法一般为高效液相色谱法^[2-4]，但该方法操作复杂、耗时长、仪器设备投入大，对检测人员的技能经验要求高，难以满足饲料厂和养殖场在精细生产、精准饲喂下的高通量筛查需求。近红外光谱(near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS)法因具有操作简单、快速、无损等特点，已被成熟应用于饲料的高通量检测^[5-7]，并部分形成了国家标准方法^[8-9]。在研发构建饲料中维生素含量测定的NIRS法中，定标参考值选取制约着NIRS定量分析模型的快速构建和应用。因维生素检测投入大和周期长，且维生素组分众多，目前见诸报道的NIRS定量分析模型有维生素A^[10]、维生素E^[11-12]等11种维生素^[13-14]。为满足饲料厂和养殖场的迫切需求，结合维生素预混料产品中维生素含量源于混合配制的原理，相关研究院所和企业^[15]以理论值(或称配方值)为定标参考值构建了12种维生素NIRS定量分析模型。该方法快速推进了不同维生素NIRS定量分析模型的构建和应用，也为混合组分指标NIRS定量分析模型的快速构建拓展了新方向。深入研究比较以检测值为定标参考值和以理论值为定标参考值2类NIRS定量分析模型的预测精准度差异，有助于为该方法标准化奠定更坚实的理论基础。

本试验基于同一维生素预混料定标集，分别以检测值、理论值为定标参考值，构建维生素E的NIRS定量分析模型，并采用同一独立验证集进行检验，比较了2类NIRS定量分析模型的预测精准度差异，并进一步分析了维生素预混料存放时间对理论值类NIRS定量分析模型预测精准度的影响。

1 材料与方法 1.1 样品制备

共制备225个维生素预混料样品，以稻壳粉为稀释剂，配伍含维生素E等14种维生素成分的维生素预混料样品，包括维生素A、维生素D₃、维生素E、维生素K₃、维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆、维生素B₁₂、叶酸(维生素B₉)、D-生物素(维生素B₇)、烟酰胺(维生素B₃)、D-泛酸(维生素B₅)、维生素C磷酸酯和肌醇，并符合猪、禽和水产动物等的营养需求，覆盖添加比例1%~10%。

制备后的所有样品均真空密封包装，存贮于4 ℃恒温冷藏箱中。试验开始前，取出样品，放至室温20~25 ℃。每个样品取500 g，通过四分法分成2份，一份用于维生素E含量测定，另一份用于NIRS扫描。

1.2 样本集划分

样本集-1(Set-1)：为比较检测值和理论值对NIRS定量分析模型精准度的影响，选取全部制备样品为Set-1的样本。兼顾维生素E含量梯度，随机选取160个样品为定标集-1(Cal-1)样本，剩余65个样品为独立验证集-1(Val-1)样本。基于Cal-1，分别以检测值和理论值为定标参考值，构建维生素E的NIRS定量分析模型A(Model-A)和B(Model-B)，并应用Val-1对2个模型进行独立验证。

样本集-2(Set-2)：为进一步分析维生素预混料存放时间对理论值类NIRS定量分析模型预测精准度的影响，在全部制备样品中随机选取100个代表性样品为Set-2的样本，分别在室温20~25 ℃下放置0、7和14 d时获取样本的NIRS。兼顾维生素E含量梯度，随机选取80个样品为定标集-2(Cal-2)样本，剩余20个样品为独立验证集-2(Val-2)样本。基于Cal-2的0 d的NIRS，构建维生素E的NIRS定量分析模型C(Model-C)；基于Cal-2的0、7和14 d的NIRS，构建维生素E的NIRS定量分析模型D(Model-D)；并应用Val-2对2个模型进行独立验证。

1.3 定标参考值获取

按照国家标准《饲料中维生素E的测定高效液相色谱法》(GB/T 17812—2008)^[3]中规定的方法测定，获得样品中维生素E检测值。

按照原料维生素E制剂有效含量和在维生素预混料中的添加比例计算，获得样品中维生素E理论值。

1.4 NIRS扫描

利用配备镀金积分球的傅里叶变换近红外光谱仪(Bruker Matrix-Ⅰ型，德国)采集样品的NIRS，配备高能量空气冷却预准直近红外光源及硫化铅检测器。光谱扫描参数设置为：光谱扫描范围10 000~4 000 cm^-1，分辨率16 cm^-1[16]，扫描64次取平均值，旋转式样品池。样品重复装样扫描2次，取2次扫描的平均光谱作为样品原始光谱。

1.5 NIRS定量分析模型的构建和筛选

模型构建：利用全谱范围10 000~4 000 cm^-1，选择偏最小二乘回归(partial least squares regression，PLSR)方法，基于不同定标集样本及其参考值，构建不同NIRS定量分析模型，包括Model-A、Model-B、Model-C和Model-D。采用留一交叉验证法，根据最小交互验证标准误差(root mean square error of cross validation，RMSECV)原则，确定最佳主因子数。

模型筛选：基于偏最小二乘回归模型的RMSECV指标，比较一阶导数(first derivative，1D)、二阶导数(second derivative，2D)、多元散射校正(multiple scattering correction，MSC)、变量标准化(standard normal variate，SNV)以及1D与MSC或SNV的组合(1D+MSC、1D+SNV)等光谱预处理方法。基于最优的光谱预处理方法，构建NIRS定量分析模型，用于验证和交互评价。

1.6 预测效果评价 1.6.1 不同定标参考值的比较评价

NIRS定量分析模型的预测效果评价方法是将模型对样本中维生素E含量的模型预测值与检测值相比，随后验证线性模型(公式1)的特性^[17]。公式1如下：

(1)

式中：a为回归截距；b为回归系数；X为预测值；Y为检测值。

用模型预测值与检测值成对数据的一系列结果进行参数检验，确定a与0的差异及b与1的差异是否显著。假定样本检测值Y_i(i=1, 2，…，n)服从正态分布，相互独立且有相同方差，同时进行2个参数假设(H₀：a=0且b=1，H₁：H₀不真)检验，即F-检验。F值计算公式如下：

(2)

(3)

(4)

式中：n为预测样本个数；X_i为NIRS定量分析模型对第i个样本预测值；Y_i为第i个样本检测值；为截距的估计值；为回归系数的估计值。

若假设H₀为真时，F~F_α(2，n-2)，其中α为置信水平，说明在一定置信水平上，a与0及b与1无显著差异，则认为NIRS定量分析模型的预测结果完全可靠，具有较高精确度。

分析Model-A和Model-B 2个模型在不同置信水平(α=0.05和0.01)下的F-检验，比较2个模型的预测效果。在2个F-检验中，使用同一独立验证集Val-1样本。

1.6.2 不同存放时间的比较评价

根据同一独立验证集Val-2的绝对误差统计值，包括箱型图的中位值、上四分位值和下四分位值，评价维生素预混料存放时间对理论值类NIRS定量分析模型预测精准度的影响。绝对差值为NIRS定量分析模型的预测值减去理论值。

1.7 数据统计分析

所有数据均采用Matlab 2008软件(The Math Works公司，美国)配合PLS_toolbox 6.7软件(Eigenvector Research公司，美国)进行处理和统计分析。

2 结果与分析 2.1 化学成分统计分析

表 1为不同样本集中维生素E含量的统计分析。维生素E含量在2.48×10⁴~25.54×10⁴ IU/kg(1 IU=1 mg)之间，变异系数为47%，分布较为广泛，与市场主流维生素预混料的含量一致。Set-1的Cal-1和Val-1中维生素E检测值的平均值、中位值、最大值、最小值和变异系数数值相近，说明具有相似的样本分布。Set-2的Cal-2和Val-2中也具有相似的样本分布。Cal-1中160个样本的检测值和理论值差异较小，这与稻壳粉及其他维生素组分中的维生素E含量极低相关。

2.2 维生素预混料NIRS特征分析

图 1为225个维生素预混料样品的NIRS平均光谱和二阶导数光谱。因维生素主要由碳、氢、氧、氮等元素构成，维生素预混料在NIRS谱区存在多处明显吸收峰，为进行定量分析提供了良好的信息基础。其中，4 380~4 100 cm^-1区域的吸收峰主要由碳-氢(C-H)键伸缩振动和C-H键变形振动的合频吸收引起，5 900~5 800 cm^-1区域的吸收峰与C-H键的第一倍频吸收相关^[18-19]。但在粒度等因素影响下，10 000~5 200 cm^-1波段的光谱变异明显增大，光谱散射严重。

维生素E作为一种脂溶性维生素，是一种苯并二氢吡喃的衍生物，由1个β-色满环和1个脂肪侧链组成，存在8种异构体^[20]，但预混料中使用的商品维生素E主要为人工合成的DL-α-生育酚乙酸酯，不存在同分异构体。商品维生素E一般为油剂加入适当吸附剂之后的粉剂，在NIRS谱区8 788~7 973 cm^-1、7 443~6 629 cm^-1和6 061~5 246 cm^-1具有特征吸收峰^[21]。尽管维生素预混料的载体稀释剂影响维生素E在NIRS的特征吸收峰，但相关研究表明此影响可通过化学计量学手段降低，甚至消除^[22]。

2.3 不同NIRS定量分析模型的构建和筛选

在构建NIRS定量分析模型中，本文比较了多种光谱预处理技术的效果，具体如表 2所示。因为原始光谱存在散射(图 1)，所以，相较于无预处理方法，MSC方法可大幅提高4个模型的质量，决定系数(R²)提高1%~3%，RMSECV降低23%~47%。相较于无预处理方法，SNV方法也可提高4个模型的质量，但仅对Model-B的提高幅度高于MSC方法。相较于无预处理方法，1D和2D方法降低了部分模型质量，R²下降1%，RMSECV增加3%~18%。尽管导数处理具有消除光谱散射影响的能力，但也会引入噪声，影响模型质量改善，需要平衡使用。如果将1D方法结合SNV方法和MSC方法，则也可提高模型质量，但提高幅度仍不高于MSC方法。以RMSECV最小为评价标准，Model-A、Model-B、Model-C和Model-D的最优光谱预处理方法分别为MSC、SNV、MSC和MSC，R²分别为0.992、0.991、0.989和0.991，RMSECV分别为4.50×10³、4.94×10³、5.47×10³和5.49×10³ IU/kg，相对分析误差(ratio performance deviation，RPD)分别为11.2、10.6、9.6和10.3。RPD反映模型对预测组分总体的定标效果或预测效果，其值越大越好。如果RPD≥3，说明模型定标效果良好，可用于实际检测。

2.4 定标参考值选取的比较分析(Model-A和Model-B)

表 3为基于不同定标参考值的NIRS定量分析模型比较结果。Model-A和Model-B 2个模型的F-检验评价结果显示：在置信水平α=0.05下，2个模型的F值均高于F_0.05(2, 60)=3.15，说明2个模型均具有较高精确度，可直接用于定量分析，也说明参考值选择检测值和理论值的差异不大，预测散点图如2所示；在置信水平α=0.01下，Model-A的F值5.48高于F_0.01(2, 60)=4.98，Model-B的F值3.77低于F_0.01(2, 60)=4.98，说明Model-A具有更高的精准度，也说明在此置信水平下，参考值应选择检测值。

2.5 不同存放时间的维生素预混料预测分析(Model-C和Model-D)

根据同一独立验证集Val-2的绝对误差的统计值，评价分析维生素预混料存放时间对理论值类NIRS定量分析模型预测精准度的影响，如图 3所示。Model-C的预测结果显示，同一样本随着存放时间由0 d增加至7、14 d，绝对误差的中位值由0.01×10⁴ IU/kg增加至0.18×10⁴、1.58×10⁴ IU/kg。预测值与理论值的绝对误差逐渐朝单一方向增大，即预测值逐渐高于理论值。Model-D的预测结果显示，同一样本随着存放时间由0 d增加至7、14 d，绝对误差的中位值在0.15×10⁴、-0.17×10⁴和0.35×10⁴ IU/kg变动。预测值与理论值的绝对误差未出现单一方向增大或减少，但其绝对值在逐渐增大，由0.15×10⁴ IU/kg增加至0.17×10⁴、0.35×10⁴ IU/kg。可见基于0 d扫描NIRS构建的NIRS定量分析模型不适于预测存放超过7 d以上的NIRS。

3 讨论

本研究基于同一维生素预混料的定标集，分别以检测值、理论值为定标参考值，构建维生素E的NIRS定量分析模型，R²分别为0.992和0.991，RMSECV分别为4.50×10³和4.94×10³ IU/kg，RPD分别为11.2和10.6。已有国内外文献报道^{[11, 14-15]}的RMSECV多在1.3×10³~11.2×10³ IU/kg。受载体稀释剂类型等因素影响，维生素预混料中维生素E含量NIRS定量分析模型的精准度会略有差异^[16]。本研究模型的RMSECV均在此区间，且具有较低误差。根据F-检验，在置信水平α=0.05下，选择以理论值为参考值构建维生素E的NIRS定量分析模型具有可行性。但在置信水平α=0.01下，以检测值为参考值的维生素E定量分析模型与以理论值为参考值的维生素E定量分析模型具有差异。由此可知，在一定的检测精准度要求下，选择以理论值为参考值构建维生素E的NIRS定量分析模型具有可行性。尤其考虑到构建时间和成本等因素，选择理论值作为参考值，可解决饲料厂和养殖场的迫切使用需求。本研究维生素预混料是以稻壳粉为载体，其中维生素E主要来源于外源添加，且配制过程中成分损失极小。这些因素降低了理论值与检测值的差异，也成为选择理论值为参考值的基础条件。但鉴于饲料种类复杂，如其他添加组分中存在较高含量的维生素E，则需要进一步验证该方法的适用性。同时，在基于理论值的NIRS定量分析模型中，维生素预混料存放7 d以上，绝对误差的中位值增大了0.17×10⁴ IU/kg。这与维生素预混料中众多商品维生素对热、氧、水分和光敏感性不一基本一致^[1]。尽管环境因素未显著降低组分含量，但致使NIRS光谱产生变化，影响NIRS定量分析模型的预测。区别于湿化学方法，NIRS方法是一种经验方法，分为定标和预测2个过程。为保障预测精准性，要求对定标和预测2个过程中的操作保持高度一致，以避免引入干扰。在构建以理论值为参考值的维生素E定量分析模型上，尤其需要考虑操作一致。本研究同时指出，NIRS获取时间是重要的影响因素，会对模型预测结果产生较大影响。

4 结论

① 以理论值为定标参考值构建了维生素E的NIRS定量分析模型，可解决定标参考值获取周期长和投入大等问题，满足饲料厂和养殖场在精细化生产和饲喂下的高通量筛查需求，有助于其他相似混制饲料成分指标的近红外定量分析模型构建。

② 样品存放时间也是影响维生素预混料NIRS定量分析模型精准度的重要因素。