2. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 兰州 730070
2. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
燕麦草是反刍动物的主要粗饲料来源之一，对瘤胃健康具有重要的调节作用[1]。燕麦草中除蛋白质、不饱和脂肪酸、矿物质和维生素等常规营养物质外，还含有能够促进肠道健康、维持理想的免疫平衡和氧化平衡及调节基因表达的特殊营养调控超微量成分[2]，燕麦草黄酮是其中含量相对较为丰富，且相关研究较多的一类活性物质，其能够通过Phase Ⅰ和Phase Ⅱ代谢途径参与胃肠道、肝脏及结肠微生物代谢，促进机体营养的消化、吸收和利用[3]，目前由于研究方法的限制，对饲用燕麦草中黄酮类成分的含量及作用研究较少。
高效液相色谱指纹图谱法是一种能够通过光谱或图谱形式，对复杂化合物中成分进行表征的方法，该方法一方面可以在有效成分不明确的条件下，根据特征峰的面积和比例确定活性物质的含量和质量，确保样品的相对稳定性；另一方面可以将图谱与生理作用相结合，从而更快、更准确地对有效成分进行筛选和研究。在高效液相色谱指纹图谱分析的基础上，结合相似度分析(SA)、聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)、判别分析(DA)和单标记多成分定量分析(QAMS)等现代分析技术，能够科学地进行质量评价[4]，很好地解决饲料活性成分结构复杂、主效因子不明确，且受产地来源、收获季节、使用部位、加工方式影响较大的问题[5]。目前，高效液相色谱指纹图谱法已成为中草药质量评价的重要标准[6]，综上所述，本试验拟采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定总黄酮含量并结合高效液相色谱建立燕麦草黄酮类营养活性物质特征图谱，结合聚类分析、主成分分析及灰色关联分析，对18种不同来源的燕麦草(S1~S18)进行质量评价，同时探究以黄酮含量为指标的分级方法与常规成分分级方法的内在联系，为燕麦草饲料的开发利用和奶牛饲粮配方的优化提供新思路。
1 材料与方法 1.1 试验材料18种不同来源的燕麦草采自首农集团旗下牧场，除S4、S9和S14外，均属于国产燕麦草品种，均在2020年8月份于各牧场采集，具体来源见表 1；芦丁(rutin)标准品(纯度≥99%)、芹菜素(apigenin)标准品(纯度≥99%)、苜蓿素(tricin)标准品(纯度≥99%)、山奈酚(kaempferol)标准品(纯度≥99%)购自上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇购自河北净森宝贝化工产品销售有限公司；NaNO2、Al(NO3)3和NaOH购自上海麦克林生化科技有限公司，均为分析纯；实验室用水为蒸馏水。
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表 1 18种不同来源燕麦草样品 Table 1 Eighteen kinds of oat grass samples from different sources |
干物质(DM)含量：根据GB 10648—1999，将新鲜燕麦草于65 ℃烘干，粉碎，取2 g样品105 ℃烘干4 h，称重，测定DM含量。
粗蛋白质(CP)含量：根据GB/T 6432—1994，利用KDY-9830全自动凯氏定氮仪和KXL-1010型控温消煮炉测定CP含量。
酸性洗涤纤维(ADF)和中性洗涤纤维(NDF)含量：根据范氏(Van Soest)[7]的洗涤纤维分析法，利用ANKOM A2000i全自动纤维分析仪测定ADF和NDF含量。
粗脂肪(EE)含量：根据GB/T 6433—2006，采用CFA-2型分布式脂肪测定仪测定EE含量。
有机物(OM)含量：根据GB/T 6438—2007，采用马弗炉于550 ℃下进行灼烧测定OM含量。
饲喂相对价值(RFV)：RFV由美国饲草和草原理事会下属的干草市场特别工作组提出[8]，是目前美国唯一广泛使用的粗饲料质量评定指数。RFV的基础是可消化的干物质(DDM)的随意干物质采食量(DMI)，其关系式如下:
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DMI与DDM的预测模型如下:
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根据中国畜牧业协会发布的燕麦干草分级标准T/CAAA 002—2018进行分级，其中澳大利亚品种(S4、S9、S14)根据碳水化合物和地域标准属于B型燕麦干草，其他品种属于A型燕麦干草。
1.2.2 燕麦草总黄酮含量测定参考桂利利等[9]总黄酮含量测定方法，精密称取芦丁对照品10 mg，置100 mL容量瓶中加60%乙醇超声溶解，摇匀，即得0.1 mg/mL的芦丁标准品溶液；精密吸取标准品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL于25 mL容量瓶中，根据NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[10]，使用Thermo Multiskan FC酶标仪在510 nm处测定吸光值，绘制标准曲线。
取燕麦草提取液1.0 mL至于25 mL容量瓶中，添加10 mL 30%乙醇，再加入1 mL 5% NaNO2溶液，振荡，放置6 min，加入1.0 mL 10% Al(NO3)3溶液，微微振荡，放置6 min，加入10 mL 4% NaOH溶液，最后以30%乙醇定容至刻度线，精密吸取200 μL于96孔板测定吸光值。
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精密称取苜蓿素、山奈酚、芹菜素、芦丁标准品各2.5 mg分别溶于25 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解后制成0.1%浓度的标准品溶液，分别精密吸取0.5 mL于5 mL离心管中，充分混合后取2 mL过滤，得到混合标准品溶液[12]。
1.2.3.2 指纹图谱及特质图谱的构建采用安捷伦1260型液相色谱仪，配有自动进样器、柱温控制器、DAD检测器、四元泵和在线脱气器，用于高效液相色谱分析。色谱条件在Chen等[13]的基础上进行了优化，选取色谱柱为Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相选择乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱(0~15 min，15%~20% B；15~20 min，20%~20% B；20~55 min，20%~35% B；55~60 min，35%~85% B；60~90 min，85% B)；流速1.0 mL/min；检测波长350 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。将指纹图谱从安捷伦系统中以AIA格式导出，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行相似度评价，采用中位数计算法、多点校正和全谱峰匹配，得到18种燕麦草指纹图谱叠加图，选取时间窗为0.5条件下，以S1为参照峰生成燕麦草特征指纹图谱。
1.3 数据分析采用Excel 2016软件对测定数据进行整理统计，计算平均值、标准差及变异系数。SPSS 21.0对数据进行单因素方差分析，采用t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著；IBM SPSS Statistics 21.0软件进行聚类分析和主成分分析；采用SPSSAU软件进行灰色关联分析。
2 结果与分析 2.1 不同来源燕麦草中常规养分的测定与评价如表 2所示，18种不同来源燕麦草DM、CP、EE、ADF、NDF、OM含量均呈现极显著差异性(P＜0.01)，其中S1、S6、S7和S16燕麦草CP含量大于12%；S2、S6、S7和S16燕麦草ADF含量小于33%；S4、S6、S9、S14、S11和S16燕麦草NDF含量小于55%。根据T/CAAA 002—2018燕麦干草质量分级标准，将S6、S7和S16这3种燕麦草评为特级燕麦草，S1、S4为一级燕麦草，其他品种分别为二级或三级。
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表 2 燕麦草中常规养分测定与评价(干物质基础) Table 2 Determination and evaluation of conventional nutrients in oat grass (DM basis) |
如表 3所示，18种不同来源燕麦草总黄酮含量存在极显著差异(P＜0.01)，其中S7燕麦草总黄酮含量最高，为(0.151±0.184) mg/g，S14燕麦草次之；S15燕麦草总黄酮含量最低，仅为(5.503±0.397) mg/g。
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表 3 不同来源燕麦草中总黄酮含量(干物质基础) Table 3 Total flavonoid content in oat grass from different sources (DM basis) |
如图 1和图 2所示，18种不同来源的燕麦草所得指纹图谱叠加图，共标记7个峰，通过与标准品的比对，指认峰4为芦丁、峰5为芹菜素、峰6为苜蓿素、峰7为山奈酚。
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图 1 不同来源燕麦草的高效液相色谱图 Fig. 1 HPLC diagrams of oat grass from different sources |
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峰4为芦丁；峰5为芹菜素；峰6为苜蓿素；峰7为山奈酚。 Peak 4 is rutin; peak 5 is apigenin; peak 6 is alfalfa; peak 7 is kaempferol. 图 2 18种不同来源燕麦草的对照图谱 Fig. 2 Control maps of 18 kinds of oat grass from different sources |
在高效液相色谱系统中，标记7个共有峰保留时间和峰面积见表 4和表 5，可知共有峰保留时间相对标准偏差(RSD)值均在5%以内，表明色谱峰稳定性较好。
对比不同来源燕麦草中共有峰峰面积可以看出，未知成分(峰2)在燕麦草黄酮中占主要成分，其次为未知成分(峰1)；以特征图谱为参照计算不同燕麦草中特征峰相似度(表 6)，可知18种燕麦草相似度在0.941~0.999，且大于0.900，表明不同来源燕麦草中黄酮类活性物质种类和含量存在相似性。
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表 4 18种不同来源燕麦草共有峰保留时间 Table 4 Common peak retention time of 18 kinds of oat grass from different sources |
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表 5 18种不同来源燕麦草共有峰峰面积 Table 5 Total peak area of 18 kinds of oat grass from different sources |
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表 6 18种不同来源燕麦草相似度分析 Table 6 Similarity analysis of 18 kinds of oat grass from different sources |
结果如图 3所示，当分类距离为10时，燕麦草被分为3类，其中第1类为S15、S17、S5、S3、S16，第2类为S1、S11、S8、S18、S6、S10、S2、S4、S9、S14，第3类为S12、S13、S7，其主要成分(峰2)的峰面积较大值即黄酮相对含量较多。
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图 3 燕麦草样品聚类分析树状图 Fig. 3 Cluster analysis tree diagram of oat grass samples |
对共有峰峰面积进行主成分分析，结果见图 4，燕麦草中7个共有峰仅识别1个主成分贡献值大于1，在主成分2处出现明显拐点，因此可采用主成分1对燕麦草质量进行评价，进一步分析表明，主成分1主要来自峰2和峰1。
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图 4 主成分碎石图 Fig. 4 Principal component lithotripsy diagram |
分别计算18种不同来源燕麦草在主成分上的得分见表 7，得分越高说明该燕麦草在代表性主成分中综合质量较好，主成分综合排序的结果与聚类分析的结果相类似，进一步验证了燕麦草的质量。
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表 7 18种不同来源燕麦草主成分得分 Table 7 Principal component scores of 18 kinds of oat grass from different sources |
综合常规分级与黄酮营养活性物质评价结果，采用SPSSAU软件中灰色关联度分析，探究2种评价方法的内在关联性，将相对饲喂价值作为母序列，DM、CP、EE、ADF、NDF，Ash和黄酮含量作为特征序列，对其关联系数结果进行加权处理，最终得出关联度值。从表 8可以看出，针对本次7个评价项，黄酮含量的综合评价最高(关联度为0.804)，其次是DM含量(关联度为0.765)。
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表 8 灰色关联度 Table 8 Grey correlation degree |
饲料品质评价方法有感官评价、化学评价2个方面，前者是从饲料的水分、颜色、气味、饲料质地和结构方面对饲料进行观察、闻味以及手摸等方法进行简单评价，通过感官评价粗略地了解饲料的品质[14]；后者主要是通过仪器分析饲料的营养成分，包括CP、粗纤维、Ash、水分等指标，在根据分级标准进行等级。目前常用的燕麦草化学质量评价有2种：1)RFV法：RFV能够综合反映粗饲料的NDF和ADF的含量，用于预测牧草的摄入量和能量，其值越高表明饲料的营养价值越高，一般相对饲用价值指标大于100，表示该种粗饲料的营养价值整体上良好。2)根据GBT/CAAA 002—2018方法进行燕麦干草的质量分级。本试验对比2种方法的一致性，相对饲喂价值大于100的燕麦草有S4、S6、S7、S9、S12、S13、S14和S16，在以燕麦干草营养成分分级中，分别划分为特级、一级、二级和三级，看出2种方法存在一定差异性。分析原因为常规营养成分分级中以NDF、ADF、CP含量3个指标对应等级中较低等级为准，既燕麦草的等级仅由其中1个指标决定，存在不确定性。查阅文献可知，目前RFV是家畜粗饲料品质评价的重要指标之一，是一种综合衡量NDF和ADF含量对牧草品质的影响的方法。
指纹图谱是指采用一定的分析手段，通过色谱图或光谱图标示某些复杂物质，从而进行成分鉴定及质量控制的一种可量化手段。Lu等[15]收集了来自13个地区的78个枸杞样本，采用高相液相色谱法证明了产地、品种对样品中活性成分总黄酮、总多酚及总多糖的含量对枸杞质量有显著影响，陈振兴等[16]、牛晓方等[17]研究也有相似的结果，因此将营养活性物质评价方法引入传统饲料营养评价体系，为动物精准营养与饲粮配方的优化提供新思路[18]。因此，本研究中，首先采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定总黄酮含量，结果表明18种燕麦草总黄酮含量存在极显著差异，其中含量较高的为S7燕麦草(10.151 mg/g)、澳大利亚燕麦草1(9.288 mg/g)和澳大利亚燕麦草2(9.491 mg/g)，含量较低的为S15(5.503 mg/g)、S17(6.964 mg/g)和S3(6.566 mg/g)，由于相关研究较少，分析原因可能由于产地位置及土壤环境对燕麦草中黄酮成分含量影响较大，且从表观观察，进口燕麦干草含有更多的叶片，而研究表明，植物叶片中的黄酮含量高于茎中黄酮含量[19]，导致我国国产燕麦草总黄酮含量整体略低于进口燕麦草。
黄晓莉等[20]在对金钱草种质资源进行综合评价研究中，研究了17个品种金钱草中10个农艺性状相关指标、5个生理指标和6个化学成分指标，根据《中国药典》中所规定的夏佛塔苷含量的标准进行分类，结果表明活性成分含量较高的品种，其在某几个农艺性状和生理指标表现较好。这与本试验结果相似，依据燕麦草特征指纹图谱共表征出7个共有成分，结合相似度分析、聚类分析及主成分分析等现代分析技术，能够将18种不同来源燕麦草分为3类，具体结果见表 9，其中指纹图谱分类为第3类和第2类的燕麦草黄酮含量较高，所对应常规营养分级多为特级、一级燕麦草，但不存在绝对对应关系，分析原因可能由于黄酮类化合物在植物体内通常与糖结合成苷类，被燕麦草中以纤维素为主的细胞壁包围，而根据饲喂价值进行分级主要以植物ADF和NDF含量为指标，且与ADF(纤维素、木质素、硅酸盐等)含量成正比，因此燕麦草黄酮的含量与饲喂价值呈现一定相关性。
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表 9 18种不同来源燕麦草分级对比 Table 9 Comparison of classification of 18 kinds of oat grass from different sources |
灰色关联分析法广泛应用于农作物的鉴定、筛选、育种等方面，具有所需样本小、方法简便、信息量大等优点[21]。本试验结合灰色关联度法分析对18种不同来源燕麦草的等级与常规成分、黄酮含量进行关联分析，量化处理，根据灰色关联度揭示比较性状数列和参考数列的重要程度，结果表明，在根据相对饲喂价值评判的等级中，其影响重要程度依次为黄酮含量>DM含量>CP含量>ADF含量>Ash含量含量>NDF含量>EE含量，此结果与王建芳等[22]研究结果一致，杨玉宁等[23]通过对木通科木通属21份种质果实果皮的主要表型性状、产量性状及内在品质进行比较，发现果形指数和黄酮含量呈正相关，采用加权关联度分析得出，B3种质的果皮排在首位，其黄酮含量的影响居于首位，与试验存在相似结果，证明了以黄酮含量作为饲料质量评价指标的可行性。
4 结论本研究对18种燕麦草中燕麦黄酮进行提取，并通过高效液相法对其特征峰进行表征和质量评价，结果表明18种不同来源燕麦草总黄酮含量存在极显著差异，其中S7燕麦草黄酮含量最高，为10.151 mg/g，S15燕麦草总黄酮含量最低，仅为5.503 mg/g；结合指纹图谱技术建立燕麦草的特征指纹图谱，并结合现代分析技术将18种燕麦草分为3类，其中第1类为S15、S17、S5、S3、S16，第2类为S1、S11、S8、S18、S6、S10、S2、S4、S9、S14，第3类为S12、S13、S7，此分类方法与常规营养成分分级存在一定一致性，且灰色关联分析表明，黄酮类营养活性物质含量与饲喂价值关联性最高。综上所述，将燕麦草中黄酮含量作为评价指标能够更全面地反映燕麦草品质，为燕麦草饲料的开发利用及奶牛精准营养配方优化提供参考。
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