2. 湖南今汉药业有限公司, 长沙 410014;
3. 湖南省畜牧兽医研究所, 长沙 410131
2. Geneham Pharmaceutical Co., Ltd., Changsha 410014, China;
3. Hunan Institute of Animal and Veterinary Science, Changsha 410131, China
饲料桑具有适应性强、易种植、产量高、营养丰富等特点，近年来随着人们对桑叶认识和研究的加深以及对新型饲料资源的开发研究，桑叶中丰富的营养和活性物质逐渐引起了畜牧业的关注，已展现出特殊的饲用价值，具有极大的开发潜力。但由于饲料桑枝叶含有纤维素、木质素及单宁、植物凝集素等抗营养因子，且具有一定的涩味，大剂量添加至动物饲粮中会导致适口性下降，畜禽采食量降低，限制了饲料桑在饲粮中的应用。饲料桑含有多种活性成分，包括桑叶黄酮、桑叶多酚、桑叶多糖、1-脱氧野尻霉素、槲皮素及其衍生物等生理活性物质，具有抗氧化、降血糖、降脂、抗病毒、抗炎症等药理学作用[1-2]，然而桑叶不同提取方法活性成分差别大。桑叶正己烷提取物中主要挥发性组分为十四烷(16.76%)、十二烷(13.20%)、邻苯二甲酸二异丁酯(10.26%)、癸烷(9.10%)、十六烷(8.71%)、亚麻醇(7.25%)、十八烷(5.88%)、二十烷(3.26%)、邻苯二甲酸二丁酯(2.59%)[3]。刘琳[4]从桑叶乙酸乙酯提取物中分离得到12种化合物，鉴定出7种化合物，分别是(6S, 9R)-6, 9-二羟基-3-氧代-α-紫罗兰醇、icarisideB1的苷元、东莨菪内酯、7-羟基香豆素、Moracin P、Moracin M、十六烷酸。桑叶乙醇提取物中含有多种有机物，主要包括酯类(82.85%)、烷烃类(6.31%)、芳烃类(1.62%)、醇类(0.21%)[5]。唐忠海[6]比较了低(300 mg/kg)、中(600 mg/kg)、高剂量(1 200 mg/kg)桑叶水提物对糖尿病小鼠的病理治疗效果，得出1 200 mg/kg桑叶水提物作用效果最好。桑叶粗提物即用桑叶水煮法提取桑叶中复合有效成分。不同提取方法的桑叶提取物中黄酮、多酚、多糖、1-脱氧野尻霉素、槲皮素等活性成分差异大，对机体的作用效果亦不同，筛选出较好的桑叶提取方法能够为下一步研究其具体成分、作用机理、桑叶生产质量控制打下基础，为筛选桑叶提取物作为药物、营养及饲料添加剂开发提供试验依据。因此，本研究探讨桑叶正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水溶物和粗提物对小鼠生长性能、血清生化指标及炎症细胞因子的作用，旨在初步筛选出对动物作用效果相对较好的提取方法，为桑叶提取物作为饲料添加剂研发提供前期试验基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物无特定病原体(SPF)级ICR雄性小鼠体重20~22 g、4周龄，生产许可证号为SCXK(湘)2018-0002，购于湖南莱克斯景达实验动物有限公司。试验小鼠饲养于湖南农业大学标准化动物房，控制环境温度在(24±1) ℃，湿度为(50±10)%，每3 d换1次垫料，自由清洁饮水、采食。按照国家《实验动物管理条例》执行饲养试验。
1.2 试验材料 1.2.1 桑叶的来源饲料桑1.0~1.2 m高时收割机械枝叶，机械切断后阴干。试验用桑叶为湖南中桑农业科技有限公司提供的饲料桑。
1.2.2 桑叶提取物的制备称取干燥粉碎的桑叶1 000 g于玻璃柱中，根据极性的不同用3倍体积的正己烷对桑叶进行提取，在正己烷中浸泡30 min后打开玻璃柱底部开关，使提取液缓慢滴入圆底烧瓶中，用旋转蒸发器浓缩，然后用真空干燥箱干燥成固体，用研钵粉碎后装入自封袋，贴上标签(以下简称提取物A)，放入冰箱保存备用。然后再用乙酸乙酯、乙醇(85%)和热水(60~70 ℃)根据极性不同依次对桑叶进行提取。将得到的乙酸乙酯桑叶提取液、乙醇(85%)桑叶提取液和热水(60~70 ℃)桑叶水溶液分别用旋转蒸发器浓缩，然后用真空干燥箱干燥成固体，用研钵粉碎后装入自封袋，贴上标签，乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水溶物分别记为提取物B、C、D，放入冰箱保存备用。
1.2.3 桑叶粗提物的制备称取150 kg的干燥桑叶粉加入提取罐，2次加热回流提取：1)加入750 kg的水提取1.5 h后过滤。2)第1次过滤后的滤渣加入600 kg的水提取1.5 h后过滤。将2次滤液浓缩，并经喷雾干燥制成桑叶粗提取物干粉(以下简称提取物E)，保存备用。
1.3 主要仪器酶标仪(Bio-Rad imark)，全自动生化分析仪(迈瑞BS-200)，TASUN-SLT-20-小型中药渗漉提取系统M404058。
1.4 试验设计及饲粮108只小鼠随机分为6组：1个对照组(基础饲粮)和5个试验组(基础饲粮+不同桑叶提取物A、B、C、D和E，添加量为1 200 mg/kg)，每组6个重复，每个重复3只小鼠，1个小鼠笼喂养1个重复，个体间体重差异不显著(P>0.05)。预试期3 d，第4天进入正试期，正试期为28 d。基础饲粮为小鼠饲粮，购自江苏协同生物工程有限责任公司，其营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮营养水平(风干基础) Table 1 Nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验第28天，小鼠禁食不禁水24 h，以重复为单位，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)，试验期间观察试验小鼠是否有异常或死亡，并计算死淘率。
1.5.2 血清抗氧化和生化指标试验第28天，小鼠禁食不禁水24 h，每组18只小鼠均眼球采血，采集的血液室温静置2 h，3 000 r/min离心10 min，吸取血清保存于-80 ℃待测。使用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)的含量；使用全自动生化分析仪检测血清天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)活性及白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)和肌酐(CREA)的含量(试剂盒为Mindray)；采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)和总胆固醇(TC)含量(试剂盒为Elabscience)，严格按照试剂盒说明书操作。
1.5.3 肝脏中炎症细胞因子含量正试期结束时采用颈椎脱臼法处死，取肝脏样品用锡箔纸包裹，液氮速冻后转入-80 ℃保存。应用双抗体夹心法测定肝脏组织中白细胞介素(IL)-17、IL-2、IL-1、干扰素-γ(INF-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，具体步骤严格按照试剂盒(购自江苏雨桐生物科技有限公司)说明进行操作。
1.6 统计分析用Excel 2013对数据进行初步整理，用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法进行多重比较，P < 0.05判断为差异显著，P < 0.01判断为差异极显著，0.05 < P < 0.10判断为有趋势。
2 结果与分析 2.1 桑叶提取物对小鼠生长性能的影响由表 2可知，各组小鼠始重符合试验要求，各组间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，各试验组小鼠末重、ADG和F/G差异不显著(P>0.05)，但E组有增加趋势(0.05 < P < 0.10)；试验E组ADFI极显著升高(P < 0.01)；试验期间，各组小鼠死淘率均为0，试验小鼠生长环境及情况正常。结果表明，基础饲粮中添加1 200 mg/kg桑叶粗提物显著提高了小鼠采食量。
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表 2 桑叶提取物对小鼠生长性能的影响 Table 2 Effects of mulberry leaf extract on growth performance in mice |
由表 3可知，与对照组相比，C、D和E组小鼠血清GSH-Px活性显著提高(P < 0.05)，分别提高了27.22%、19.62%、27.21%；B、D和E组小鼠血清T-SOD活性极显著提高(P < 0.01)，分别提高了66.66%、37.54%、38.77%；各试验组小鼠血清T-AOC和MDA含量差异不显著(P>0.05)。结果表明，基础饲粮中添加1 200 mg/kg桑叶水溶物和粗提物能提高小鼠抗氧化功能。
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表 3 桑叶提取物对小鼠血清抗氧化功能的影响 Table 3 Effects of mulberry leaf extract on serum antioxidant function in mice |
由表 4可知，各组小鼠血清ALT活性及LDL-C、GLU和UN含量差异不显著(P>0.05)；B和D组的小鼠血清AST活性显著高于对照组(P < 0.05)。与对照组相比，A、C、D和E组小鼠血清ALB含量显著提高(P < 0.05)；各试验组小鼠血清TP含量显著提高(P < 0.05)；B、D、E组小鼠血清HDL-C含量显著降低(P < 0.05)；B和E组血清TG含量显著降低(P < 0.05)；C组血清CREA含量显著降低(P < 0.05)。
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表 4 桑叶提取物对小鼠血清生化指标的影响 Table 4 Effects of mulberry leaf extract on serum biochemical indexes in mice |
由表 5可知，与对照组相比，A、C、D、E组肝脏IL-17含量极显著升高(P < 0.01)，肝脏IL-2含量极显著下降(P < 0.01)，A、C、D组肝脏IL-1β和IFN-γ含量极显著升高(P < 0.01)，A组肝脏TNF-α含量显著升高(P < 0.05)。
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表 5 桑叶提取物对小鼠肝脏细胞因子含量的影响 Table 5 Effects of mulberry leaf extract on live cytokine contents in mice |
桑叶中含有的抗营养因子会使畜禽的养分消化受到影响，同时也会影响饲粮的适口性，大量添加反而会使畜禽生长性能降低。桑叶提取物可以降低畜禽的血糖、血脂，抑制有害菌，增强畜禽的抗氧化能力，也可使桑叶中有效成分进一步加以分离、纯化，充分发挥其功效。曲培滨[7]研究发现，桑叶黄酮有利于犊牛的生长性能，尤其是能够显著提高犊牛的体长和增重效果。因此适量的桑叶提取物添加到畜禽饲粮中以提高其生长性能，提高经济效益。
桑叶正己烷提取物主要含有脂肪醇类和甾体类化合物[8]，植物甾醇、脂肪酸及其衍生物均具有一定的抑菌效果[9]。刘琳[4]研究发现，桑叶乙酸乙酯提取物中含有香豆素类、萜类、苯基苯并呋喃类、脂肪酸类单体化合物。桑叶乙醇提取物主要含有酯类(82.85%)、烷烃类(6.31%)、芳烃类(1.62%)和醇类(0.21%)，具有一定的抑菌作用，同时对1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)和羟自由基(·OH)具有一定清除能力[5]。挥发油又名精油，存在于植物的枝叶或种子中，具有芳香气味且不溶于水，是桑属植物含有的多种类型的化合物中的一种。本研究结果表明，基础饲粮中添加1 200 mg/kg桑叶不同提取物对小鼠生长性能无明显作用，可能是受提取方法、添加量、动物品种等因素影响，而基础饲粮中添加1 200 mg/kg桑叶粗提物显著提高了小鼠采食量，推测可能是桑叶粗提物中的精油通过特有的气味刺激神经诱发食欲[10]。
3.2 桑叶提取物对小鼠血清抗氧化功能的影响陈冰等[11]研究发现，桑叶黄酮显著提高了肌肉SOD活性和T-AOC。杨继华[12]研究也表明，桑叶黄酮显著提高了血清SOD、GSH-Px活性和T-AOC以及肝脏CAT和SOD活性。总桑叶多酚能延长秀丽新小杆线虫寿命，提高抗氧化剂的抗压能力[13]。桑叶多酚提取物能够调节大脑中氧化应激和抵消草甘膦引起的有害作用和氧化损伤，降低乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性和蛋白质羰基化合物和丙二醛含量，并增加了SOD活性[14]。桑叶甲醇提取物中酚类物质含量与抗氧化电位之间具有高度的相关性和回归性，可以作为有效的自由基抑制剂或清除剂[15]。李冠楠等[16]发现，桑叶提取物泡腾片在一定程度上能够清除羟自由基、DPPH和O2-自由基。Andallu等[17]研究发现，桑叶提取物能够显著清除DPPH和O2-自由基。王丽娟[18]研究发现，桑叶提取物具有清除DPPH和·OH自由基能力。张贵会等[19]对药桑叶醇提物的乙酸乙酯萃取部分进行分离，其中分离出的黄酮单体化合物对DPPH和2, 2′-氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基有很强的清除能力。槲皮素及其糖苷的细胞抗氧化能力可能取决于它们在细胞膜上的渗透性和H2O2或·OH清除能力[20]。夏伯候[21]等发现，桑叶中的异槲皮苷、紫云英苷和芦丁均能够清除ABTS自由基，其中异槲皮苷与芦丁的清除能力较强，可达80%。何新苗等[22]研究发现，药桑叶多糖能够一定程度上清除DPPH、ABTS、·OH和O2-自由基，并呈现一定剂量关系。将桑叶多糖与低浓度槲皮素混合后，分析发现桑叶多糖和槲皮素能够协同作用于抗氧化活性，尽管较高纯度的桑叶多糖仅具有很低的抗氧化活性，但其能够使类黄酮抗氧化活性显著增强[23]。黄桑叶多糖体外抗氧化活性较强，具有较强的DPPH自由基清除能力，也能在一定程度上清除·OH和O2-自由基[24]。此外，粗桑叶多糖和其纯化馏分具有十分强大的体外抗氧化活性，是可用于药物或功能性食品的天然抗氧化剂[25]。李层层等[26]研究也表明，桑叶粗多糖对·OH自由基具有较强的清除能力[半抑制率(IC50)=0.570 mg/m L]，而对DPPH自由基的清除能力(IC50=0.235 mg/mL)较弱。本试验结果表明，饲粮中添加桑叶水溶物和粗提物能显著提高小鼠血清GSH-Px和T-SOD活性，推测桑叶中具有抗氧功能的成分主要是水溶性的，而粗提物中槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷和芦丁、黄酮、多糖类化合物协同发挥抗氧化作用，从而能起到抗氧化应激、保护机体健康的作用。
3.3 桑叶提取物对小鼠血清生化指标的影响血清ALT和AST活性可以在一定程度上反映机体肝脏和心脏的健康状况。桑叶多糖与桑叶提取物1-脱氧野尻霉素(DNJ)具有降血脂和血糖的作用。张入飞等[27]研究表明，桑叶多糖能够使试验性糖尿病大鼠的胰岛素含量显著升高，从而降低血糖和血脂。Li等[28]发现桑叶多糖与DNJ的混合治疗具有促胰岛素表达的作用，对异糖原诱导的糖尿病小鼠的肝脏GLU代谢具有调节作用。适量桑叶DNJ水提液可以增加脂肪分解代谢酶的活性，加速脂肪动员，促进脂肪消耗[29]。ALB由肝脏合成，血清TP和ALB含量的高低能直接反映机体蛋白质合成代谢的强弱[30]，TP含量越高则体蛋白合成效率越高。CREA是动物肌肉分解的主要产物，是肾脏功能强弱的主要评价指标，能反映机体蛋白质分解程度的强弱，而UN是蛋白质分解的最终产物，含量的高低可以反映饲粮蛋白质利用率的高低[31]。当动物机体血液中TC含量过高时会导致血液黏度增加，造成TC堆积血液流通受阻，诱发动脉粥样硬化，损伤机体健康。槲皮素衍生物可促进肝脏脂质代谢，降低血浆脂质含量，抑制肝脏和脂肪细胞引起的脂肪积累[32]。槲皮素已被证明可以改善血脂异常，上调脂肪细胞基因表达，从而增加脂质β氧化[33]。研究发现对高脂饮食小鼠灌胃适量桑叶水提物，不仅可以抑制脂肪合成，还增加了机体的脂肪分解[34]。经过桑叶提取液处理的高脂血症大鼠降低了血清TC、TG和标准化脂蛋白含量，对高脂血症大鼠肝脏、肾脏和脑脂质过氧化均有抑制作用，对血脂有潜在的治疗作用[31]。本研究结果表明，添加桑叶各提取物的小鼠血清ALT活性及LDL-C、GLU和UN含量无显著差异，表明饲粮添加桑叶各提取物对小鼠肝脏和心脏无不良影响；添加桑叶正己烷提取物、乙醇提取物、水溶物和粗提物的小鼠血清TP和ALB含量显著提高，表明桑叶提取物有利于小鼠体内的蛋白质合成、体内代谢及机体健康；饲喂桑叶乙酸乙酯提取物、水溶物、粗提物的小鼠血清HDL-C含量显著降低，桑叶乙酸乙酯提取物和粗提物显著降低了血清TG含量，表明桑叶乙酸乙酯提取物和粗提物能改善脂质代谢，与前面的研究报道结果一致；桑叶乙醇提取物显著降低了小鼠血清CREA含量，表明其可以有效保护肾脏免受损伤。
3.4 桑叶提取物对小鼠肝脏炎症细胞因子含量的影响IL-17为促炎性细胞因子，可协同炎性因子放大炎性效应，与机体的炎症和免疫性疾病等有关[35]。TNF-α是炎症反应的主要细胞因子之一，主要通过刺激肝脏产生急性期蛋白参与急性期反应，具有调控炎症反应的重要因子，适量的TNF-α能介导保护反应，但过量则会激活中性粒细胞的吞噬功能，导致细胞损伤。IL-1β主要是由活化的单核/巨噬细胞分泌的多功能细胞因子，在免疫反应过程中，能刺激T淋巴细胞分泌IL-2并表达其受体。IL-2、IFN-γ是由TH1细胞分泌的细胞因子，主要参与细胞免疫，主要介导细胞免疫和迟发性超敏反应，并辅助B细胞产生吞噬有关的抗体。机体在正常情况下，这些炎性细胞因子的产生是机体应对病毒或病菌入侵或组织损伤的有益反应，但体内含量过高则表示机体产生了过度的免疫反应，对机体健康产生不利影响[36]。陈晓兰等[37]比较了不同桑叶提取物对小鼠脾脏淋巴细胞的增殖作用，结果表明在桑叶提取物有助于免疫功能的增强。本试验结果表明，试粮中桑叶各提取物使小鼠肝脏IL-17、IL-1β和IFN-γ含量明显升高，IL-2含量显著下降，激活了免疫反应，其有效成分及作用机理有待进一步研究。
4 结论综合考虑不同方法提取的桑叶提取物的作用效果，本研究初步得出桑叶粗提物效果最好，具体作用效果如下：
① 饲粮中添加桑叶粗提物能够促进小鼠采食；
② 饲粮中添加桑叶水溶物和粗提物能够显著提高小鼠血清GSH-Px和T-SOD活性，提高小鼠抗氧化能力；
③ 饲粮中添加桑叶粗提物显著提高了小鼠血清中TP和ALB含量，显著降低HDL-C和TG含量，有效改善小鼠脂质代谢；
④ 饲粮中添加桑叶各提取物能够使小鼠肝脏IL-17、IL-1β和IFN-γ含量明显升高，IL-2含量显著下降，激活免疫反应。
由此可见，桑叶粗提物可促进小鼠采食，提高小鼠抗氧化能力，激活免疫反应，改善脂质代谢。
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