随着我国奶牛单产大幅提升，高产奶牛的营养代谢类疾病发病率也逐年跃升。作为奶牛代谢疾病发生的一个重要因素，如何避免机体代谢稳态维持机制遭到破坏已经成为奶牛育种、营养和生理研究领域的重要热点。基于自由基生成和清除的氧化应激调控是维持奶牛代谢稳态的重要内容。目前，奶牛代谢应激方面的研究主要集中于热应激[1]、运输应激[2]、密度应激[3]等方面。
作为细胞代谢过程中一种重要物质，氧气在哺乳动物代谢稳态和功能维持中发挥重要作用。例如，当肺泡细胞发生缺氧时，氧敏感基因[低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和低氧诱导因子-2α(HIF-2α)]表达量上调可直接导致其线粒体功能紊乱和肺功能障碍[4]。另外，心衰和呼吸衰竭可直接降低肝脏输氧量，进而提高肝脏谷丙转氨酶活力并导致其器质性病变[5]。然而，氧供给对奶牛机体代谢影响及其机制仍有待深入研究。
由于较高的乳汁合成代谢过程和维持需要，高产奶牛不仅在葡萄糖、氨基酸等乳成分前体物方面具有较高的需要量，同时也消耗了大量氧气，在合成乳汁的同时产生大量自由基。与泌乳盛期奶牛相比，泌乳后期奶牛在产奶量和乳腺应激方面均较低[6]。然而，作为乳汁合成的直接器官，氧供给对奶牛乳合成效率和乳腺代谢应激之间的关系仍有待研究。因此，本研究通过比较不同泌乳时期荷斯坦奶牛血气参数、乳腺氧化应激状态相关参数，在明确不同泌乳时期奶牛氧代谢差异的同时，为深入研究氧调节奶牛机体代谢和功能稳态的作用机制提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验设计本试验的研究内容以及所实际用到的试验动物均经过浙江大学动物福利委员会(中国杭州)的批准，符合浙江大学动物研究指南。试验在中国浙江省杭州市临安区杭州正兴牧业有限公司(浙江大学奶业科学研究所的试验站)开展，所有涉及动物的程序均经浙江大学动物保护和使用委员会批准。选择18头处于泌乳盛期[泌乳天数(61.80±3.72) d，产奶量(55.65±3.95) kg/d，胎次(2.74±0.19)胎，体重(701±55) kg]和16头处于泌乳后期[泌乳天数(289.10±6.78) d，产奶量(12.27±4.70) kg/d，胎次(2.81±0.15)胎，体重(727±63) kg]的上一胎次产奶量相近、胎次一致的泌乳荷斯坦奶牛作为试验动物。
1.2 采样与相关指标测定奶样采集和检测：采样周期为3 d，每天记录早、中、晚3次产奶量。产奶量测定的最后1 d采集奶样，按早: 中: 晚=4 : 3 : 3的比例取50 mL奶样，取3份。每1份奶样再均分为3份，第1份奶样中加入甲酸防腐剂，之后送至光明乳业DHI检测中心，采用乳成分分析仪(Foss Eletric，Hillerød，丹麦)对乳蛋白、乳脂、乳糖、尿素氮含量及体细胞数进行检测; 第2份奶样放置在4 ℃环境下保存，之后用氨基酸自动分析仪(Hitachi High-Technologies Corporation，日本)测定氨基酸含量，样品前处理参考前人方法[7]; 第3份奶样置于-20 ℃环境保存，之后用于乳中氧化应激[活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量]和抗氧化应激相关指标[氧化自由基吸收能力(ORAC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性]测定，检测方法为酶联免疫吸附测定(ELISA)法。
血样采集和检测：晨饲后约3 h，分别从每头奶牛的尾动脉和乳静脉处收集血液样品到真空采血管中，每个样品采集3份。第1份血样采集后立刻测定生理、生化、血气等参数(雅培300-G血气分析仪，美国)，测定指标包括：生化/电解质参数(钠、钾、离子钙、葡萄糖、尿素氮、肌酐和乳酸含量)、血液学参数(红细胞压积和血红蛋白含量)和血气参数(pH、二氧化碳分压、氧分压、总二氧化碳含量、碳酸根离子含量、碱剩余和氧饱和度); 第2份血样以3 000×g离心15 min获得血浆，用于测定氨基酸含量; 第3份血样采集后，乳静脉血以3 000×g离心15 min获得血浆并储存于-20 ℃，用于测定血浆中氧化应激(ROS和MDA含量)与抗氧化应激相关指标(ORAC GSH-Px和SOD活性)，方法为ELISA法，尾动脉血则用五分类血球仪分析血常规指标。
1.3 计算公式乳腺血流量(MPF)估测参考菲克原理[8]，计算公式：
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反映乳腺氧供给和利用的指标计算公式如下：
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采用SAS 9.2软件的one-way ANOVA程序对不同泌乳时期奶牛的试验结果进行统计分析，利用配对t检验对不同组间数据进行显著性分析，结果用平均值和均值标准误表示。以P≤0.01表示差异极显著，0.01＜P≤0.05表示差异显著，0.05 <P≤0.15表示具有趋势。
2 结果 2.1 泌乳盛期与泌乳后期奶牛的泌乳性能比较奶牛产奶量、泌乳天数和乳成分等相关信息列于表 1。泌乳盛期奶牛的乳蛋白、乳脂含量均极显著低于泌乳后期奶牛(P < 0.01)，而乳糖含量极显著高于泌乳后期奶牛(P < 0.01)。
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表 1 泌乳盛期与泌乳后期奶牛的泌乳性能比较 Table 1 Comparison of lactation performance between early-lactating and late-lactating dairy cows |
泌乳盛期与泌乳后期奶牛的乳静脉血气参数列于表 2。与泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛乳静脉血中葡萄糖(P < 0.01)、钠(P < 0.01)、离子钙(P < 0.01)和血红蛋白(P < 0.01)含量和红细胞压积(P < 0.01)均极显著降低，而总二氧化碳含量(P < 0.01)、pH(P < 0.01)、碳酸氢根含量(P < 0.01)、碱剩余(P < 0.01)均极显著升高，氧饱和度(P=0.09)有升高趋势。
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表 2 泌乳盛期与泌乳后期奶牛的乳静脉血气参数比较 Table 2 Comparison of mammary vein blood gas parameters between early- lactating and late-lactating dairy cows |
泌乳盛期与泌乳后期奶牛的尾动脉血气参数列于表 3。与泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛尾动脉血中葡萄糖(P < 0.01)、钠含量(P < 0.01)极显著降低，氧分压(P=0.07)有降低趋势。
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表 3 泌乳盛期与泌乳后期奶牛的尾动脉血气参数比较 Table 3 Comparison of caudal artery blood gas parameters between early-lactating and late-lactating dairy cows |
泌乳盛期与泌乳后期奶牛的乳腺氧代谢相关指标列于表 4。与泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛尾动脉氧含量(P < 0.01)极显著降低，乳静脉氧含量(P=0.06)有降低的趋势。从乳腺氧气消耗的角度来看，泌乳盛期奶牛乳腺氧总供给量(P < 0.01)和总消耗量(P < 0.01)极显著高于泌乳后期奶牛，但生产单位牛奶的耗氧量(P=0.02)显著低于泌乳后期奶牛。2个泌乳时期奶牛的氧气消耗供给比(P=0.62)无显著差异。
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表 4 泌乳盛期与泌乳后期奶牛的乳腺氧代谢相关指标比较 Table 4 Comparison of oxygen metabolism related indexes in mammary gland between early-lactating and late-lactating dairy cows |
泌乳盛期与泌乳后期奶牛乳中氨基酸含量列于表 5。与泌乳盛期奶牛相比，泌乳后期奶牛乳中苏氨酸(Ser)含量(P < 0.01)极显著降低，其余氨基酸含量(P < 0.01)均极显著升高。
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表 5 泌乳盛期与泌乳后期奶牛乳中氨基酸含量比较 Table 5 Comparison of amino acid contents in milk between early-lactating and late-lactating dairy cows |
泌乳盛期与泌乳后期奶牛乳静脉血浆中氨基酸含量列于表 6。与泌乳盛期奶牛相比，泌乳后期奶牛乳静脉血浆中天冬氨酸(Asp)(P < 0.01)、脯氨酸(Pro)含量(P < 0.01)极显著降低，苏氨酸(Thr)(P < 0.01)、甘氨酸(Gly)(P < 0.01)、蛋氨酸(Met)(P < 0.01)、赖氨酸(Lys)(P < 0.01)、组氨酸(His)(P < 0.01)和精氨酸(Arg)含量(P < 0.01)极显著升高，谷氨酸(Glu)(P=0.04)、异亮氨酸(Ile) (P=0.02)、亮氨酸(Leu)(P=0.02)含量显著升高，其他氨基酸含量(P>0.05)无显著差异。
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表 6 泌乳盛期与泌乳后期奶牛乳静脉血浆中氨基酸含量比较 Table 6 Comparison of amino acid contents in plasma of mammary vein between early-lactating and late-lactating dairy cows |
泌乳盛期与泌乳后期奶牛尾动脉血浆中氨基酸含量列于表 7。与泌乳盛期奶牛相比，泌乳后期奶牛尾动脉血浆中Asp(P < 0.01)、Gly(P < 0.01)、丙氨酸(Ala)(P < 0.01)、苯丙氨酸(Phe)(P < 0.01)、Pro含量(P < 0.01)极显著降低，Met(P=0.04)、Lys(P=0.03)、His(P=0.02)含量显著升高，Thr含量(P=0.10)具有升高的趋势，其他氨基酸含量(P>0.05)无显著差异。
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表 7 泌乳盛期与泌乳后期奶牛尾动脉血浆中氨基酸含量比较 Table 7 Comparison of amino acid contents in plasma of caudal artery of early-lactating and late-lactating dairy cows |
泌乳盛期与泌乳后期奶牛乳静脉血浆和乳中氧化应激与抗氧化应激相关指标列于表 8。与泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛乳静脉血浆中ROS(P=0.09)、MDA含量(P=0.07)以及ORAC(P=0.07)具有提高的趋势。泌乳盛期奶牛乳中MDA含量(P=0.01)极显著高于泌乳后期奶牛。与泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛乳中ORAC(P=0.07)、GSH-Px(P=0.06)和SOD(P=0.07)活性具有提高的趋势。
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表 8 泌乳盛期与泌乳后期奶牛乳静脉血浆和乳中氧化应激与抗氧化应激相关指标的比较 Table 8 Comparison of oxidative stress and antioxidant stress-related indexes in mammary vein plasma and milk of early-lactating and late-lactating dairy cows |
泌乳盛期与泌乳后期奶牛尾动脉血常规指标列于表 9。与泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛尾动脉血中血小板分布宽度(P < 0.01)极显著降低，嗜酸性粒细胞数量(P=0.04)显著降低，血小板平均体积(P=0.07)有降低的趋势，中性粒细胞数量(P=0.07)有升高的趋势，其余指标(P>0.05)无显著差异。
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表 9 泌乳盛期与泌乳后期奶牛尾动脉血常规指标的比较 Table 9 Comparison of blood routine indexes of caudal artery of early-lactating and late-lactating dairy cows |
氧是哺乳动物生殖、发育等生命活动中的必要营养素，在机体生理代谢调控中起关键作用。作为哺乳动物重要的代谢器官，研究乳腺代谢稳态和生理代谢如何受氧含量和供给的调控，具有重要生物学意义和应用价值。目前，生命科学领域有关氧气参与乳腺代谢和健康调控方面的研究主要聚焦于乳腺癌发生和发展，例如，乳腺癌细胞可通过提高胶原蛋白Ⅰ分泌加剧局部氧消耗，并通过HIF-1α-核因子-κB(NF-κB)信号通路介导细胞快速增殖[9]，另有研究发现，碳酸酐酶Ⅸ可通过加速乳腺癌细胞所在区域内的氧气消耗速率，诱发上皮-间质转化机制，最终加速乳腺癌细胞迁移进程[10]。然而，乳腺氧供给与泌乳性能、乳成分之间的因果关系和调节机制尚不明确。本研究中，泌乳盛期奶牛尾动脉和乳静脉氧含量和生产单位牛奶的耗氧量均低于泌乳后期奶牛，提示泌乳盛期奶牛乳腺氧的总需求量较高，泌乳盛期奶牛可能一方面通过提高血液流速另一方面通过提高氧气的利用效率，来增加乳腺氧供给总量，从而满足其泌乳代谢过程中对氧气较高的需要量[11]。
Ruocco等[12]研究发现，氨基酸可以降低氧化应激水平，调节代谢稳态。有研究发现，乳腺氨基酸的清除效率是奶牛自身维持泌乳机制的部分原因，其还用来满足细胞内代谢的需要[13]，并且主要取决于乳腺上皮细胞数量及双向转运活性，不受血液浓度和流量的影响[8]。本研究中，泌乳盛期奶牛乳与乳静脉血浆中大多数氨基酸的含量均保持较低水平，提示泌乳盛期奶牛乳腺氨基酸的清除效率可能更高，总耗氧量较高的时期，代谢应激发生的可能也较高。前人研究表明，乳腺Lys的摄取量取决于动脉血供应量[14]，本研究中，泌乳后期奶牛乳、乳静脉血浆中Lys含量较高，与尾动脉血浆中Lys含量较高的结果保持一致。
前人研究发现，血液中嗜酸性粒细胞数量在机体缺氧条件下显著降低[12]，嗜酸性粒细胞是免疫反应和过敏反应过程中极为重要的细胞，在杀伤细菌和寄生虫方面具有重要作用。本研究发现，对于血液氧分压和氧含量均较低的泌乳盛期奶牛，其血液中嗜酸性粒细胞数量显著低于血液氧分压和氧含量均较高的泌乳盛期奶牛，提示不同泌乳时期奶牛血液中嗜酸性粒细胞数量可能受血液中氧含量的影响，具体的调节机制有待进一步研究。中性粒细胞在动物血液非特异性细胞免疫系统中发挥重要作用，由于它们获得能量的方式是糖酵解，因此机体缺氧情况下仍能够生存并发挥作用。同时，缺氧条件下的血液中性粒细胞降解速率显著降低，以维持其参与机体免疫系统和代谢稳态的功能[13]。本研究发现，血液氧分压和氧含量均较低的泌乳盛期奶牛血液中性粒细胞数量有高于泌乳后期奶牛的趋势，提示奶牛血液中中性粒细胞数量可能受血液中氧含量的影响，需要进一步研究其机制。血小板分布宽度和体积是反映哺乳动物血液中血小板比容变异的重要参数，当哺乳动物机体处于缺氧状态下时，血小板分布宽度和体积均会发生下降。本研究中，泌乳盛期奶牛血液中血小板分布宽度和体积比泌乳后期奶牛低，可能与其血液中氧含量较低有关。这些结果提示，血液中氧含量的变化可能是造成泌乳奶牛血常规指标发生变化的原因。
我们进一步分析了泌乳盛期和泌乳后期奶牛乳静脉血浆和乳中氧化应激和抗氧化应激相关指标，发现乳静脉血浆和乳中的相关指标变化趋势一致，且泌乳盛期奶牛乳腺氧化应激水平高于泌乳后期，而机体抗氧化能力低于泌乳后期。前人研究发现，组织氧耗量与自由基产生量呈正相关[8]。本研究中，虽然泌乳盛期奶牛生产单位牛奶的耗氧量低于泌乳后期奶牛，但其总耗氧量较高，在正常代谢条件下，哺乳动物细胞约有38%左右的氧气被转化为ROS[14]。因此，泌乳盛期奶牛较高的代谢应激可能与该时期乳腺代谢中大量氧气消耗有关。
4 结论与泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛血液中氧分压和氧含量较低，但乳腺氧消耗量较高，其乳腺氨基酸的清除率与摄取也随总耗氧量的增加而提升。同时，与泌乳盛期奶牛相比，泌乳后期奶牛血常规和氧化应激指标均发生变化，结合泌乳盛期奶牛乳腺应激强于泌乳后期奶牛的发现，本研究提示耗氧量调节可能是泌乳盛期奶牛代谢应激调控的一种途径。
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