2. 四川农业大学食品学院, 雅安 615014
2. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya'an 615014, China
青贮饲料作为牲畜的重要饲料之一，通常是将水分含量较多的植物性饲料经切碎后，在密闭缺氧的条件下，通过厌氧乳酸菌的发酵作用，同时抑制各种杂菌的繁殖而得到的一种粗饲料[1]。经青贮处理后的饲料，不仅能延长保存时间，还能最大程度保留其营养价值，在年度均衡供应优质饲料中起重要作用。同时，青贮还能软化饲料中的植物纤维，改善其适口性[2]。
研究发现，微生物添加剂能有效改善青贮饲料的营养价值和饲用价值[3]，其中乳酸杆菌能在厌氧环境下良好生长，青贮过程中添加乳酸杆菌能抑制有害菌的生长，降低细胞的有氧消耗，从而减少青贮原料的养分损失[4]。乳酸杆菌种类多样，不同的乳酸杆菌在青贮过程中具有不同的作用。王思伟等[5]研究发现，添加枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和产脘假丝酵母的混合添加剂可以显著降低青贮饲料pH和氨态氮含量，提高乳酸和丙酸含量，从而抑制有害菌的生长。孙志强等[6]研究发现，组合添加布氏乳杆菌和植物乳杆菌可以有效提高青贮饲料的有氧稳定性，进而提高青贮品质。不仅如此，不同的乳酸杆菌添加剂在青贮过程中还会改变微生物群落的结构和多样性，对青贮饲料的发酵品质有积极作用[7]。Wang等[8]在辣木青贮过程中添加乳酸菌，发现其在抑制有害细菌生长的同时提高了发酵品质。李雁冰等[9]将鼠李糖乳杆菌和布氏乳杆菌添加至青贮黑麦草和青贮玉米中，发现其可以抑制有害真菌菌群的生长，从而防止腐败的发生。
皇竹草(Pennisetum sinese)是隶属于禾本科(Poaceae)、狼尾草属(Pennisetum)的多年生直立丛生的草本植物，相比于狼尾草和象草具有营养丰富、产量高和适口性好等优点，可作为草食动物的优质饲料来源[10]。皇竹草在光照充足、湿润的气候条件下能够更好地生长，较难做到全年均衡供应；且皇竹草粗纤维含量较高，水溶性碳水化合物含量较低，直接青贮易腐烂且适口性不佳，难以获得优质的青贮饲料[11]。因此，本研究以从黑麦草青贮饲料中分离到的3种乳酸杆菌应用到皇竹草青贮发酵，研究其发酵品质、营养成分及微生物多样性的变化，筛选适宜青贮发酵的优良菌株，旨在为皇竹草的高效利用以及青贮品质的提升提供理论依据，并为进一步促进产业的发展提供支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所用皇竹草于2020年12月刈割于四川省某市，长约1.5 m，留茬20 cm左右。参考张丽英[12]的方法，对皇竹草原料中的常规营养成分含量进行测定(表 1)，其中干物质含量为29.54%(鲜样基础)，粗灰分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和无氮浸出物含量分别为1.80%、7.51%、6.09%、41.04%、79.86%、49.19%和43.56%(干物质基础)。
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表 1 皇竹草原料常规营养成分含量 Table 1 Contents of conventional nutrient components of Pennisetum sinese |
采集自然发酵的黑麦草青贮饲料样品，向90 mL无菌生理盐水中分别加入10 g样品，充分混匀后用无菌生理盐水进行梯度稀释，依次稀释至10-6 g/mL，每个梯度设3个平行。然后，分别吸取100 μL不同浓度梯度的样品稀释液涂布于改良MRS(含CaCO3)培养基上，37 ℃下培养48 h。挑取有溶钙圈的单菌落在MRS固体培养基中继续划线，进行分离纯化，并通过革兰氏染色镜检确定其形态特征。将纯化后的菌落接种于MRS液体培养基中，经37 ℃培养24 h后加入浓度为50%的等体积甘油，并于-20 ℃保存。
采用煮沸法提取菌株的DNA，使用细菌16S rRNA通用引物对菌株进行PCR扩增，将PCR产物送至成都有康生物科技有限公司进行测序，测序结果拼接后进行BLAST比对。
1.3 乳酸杆菌菌悬液的制备和产酸能力测定将3株菌株活化后按1%接种量接入MRS液体培养基三角瓶中，于37 ℃、180 r/min条件下培养16~20 h，调整菌悬液600 nm吸光度(OD)值为0.80待用(菌落数约108 CFU/mL)，取5 mL发酵液用pH计测定pH。
1.4 青贮试验设计试验共设置1个对照组和3个试验组，每组设3个重复。待皇竹草样品晾晒至含水量为60%~70%时，用铡草揉丝一体机粉碎样品至1~2 cm，混合均匀。每组取切碎样品80 kg，3个试验组按青贮质量的0.1%均匀喷洒菌悬液，其中LAB158组喷洒植物乳杆菌LAB158(Lactobacillus plantarum LAB158)、MZN1组喷洒玉米乳杆菌MZN1(Lactobacillus zeae MZN1)、P-1-12组喷洒草本乳杆菌P-1-12(Lactobacillus herbaceous P-1-12)，对照组则添加等量的无菌水，搅拌均匀后用打捆包膜一体机打包，室温条件下避光密封储藏。青贮60 d后取中部样品混匀，每个样品取500 g用于高通量测序，300 g样品用于品质测定。
1.5 青贮品质测定感官评定：参照王杰等[13]的感官评定标准，分别对皇竹草青贮饲料的色泽、气味、质地、水分和pH各方面具体情况打出相应得分，最终得到综合评分，按照得分76~100为优质、51~75分为良好、26~50分为一般和0~25分为劣等的标准得出皇竹草青贮饲料等级。
发酵品质评定：取20 g青贮饲料样品加入到装有180 mL无菌水的三角瓶中，摇床(180 r/min, 3 min)混匀后用4层纱布过滤，取出部分浸提液，利用pH计测定其pH；另取10 mL滤液离心(4 500×g, 15 min)，采用高效液相色谱法测定上清液乳酸含量[14]。
营养成分含量测定：参考张丽英[12]的方法测定青贮饲料中干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、无氮浸出物、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和粗灰分等含量，以此来反映该青贮饲料品质的总体情况。
1.6 发酵菌群16S rRNA高通量测序称取0.5 g青贮饲料样品，参考陶莲等[15]的方法进行DNA的提取，并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，使用16S rRNA通用引物进行定量PCR检测，产物使用1%浓度的琼脂糖凝胶进行检测[16]。将检测合格的细菌DNA送于深圳华大基因科技服务有限公司，并采用Illumina HiSeq测序平台进行高通量测序。
1.7 数据统计分析首先用QIIME软件对Illumina HiSeq平台得到的原始数据进行过滤。将原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据[17]；然后基于有效数据进行操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的OTU和分类谱系的基本分析结果；再对OTU进行丰富度、多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析[18]。
用Excel 2007整理原始数据，再用SPSS 21.0软件对营养成分含量数据及青贮饲料各处理样品在门和属水平上优势菌群的相对丰度数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行多重比较，P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 菌株分离鉴定结果通过形态学鉴定和分子生物学鉴定，从黑麦草青贮样品中获得的3种乳酸杆菌分别是植物乳杆菌LAB158、玉米乳杆菌MZN1和草本乳杆菌P-1-12，菌悬液pH分别为4.5、4.8和4.2，菌株由本实验室保存。分离到的菌株在MRS固体培养基上呈圆形乳白色单个菌落，菌落表面光滑，中央微凸(图 1)；经革兰氏染色呈紫色，显微镜下观察菌株呈短杆状，无芽孢，形态学均鉴定为乳酸杆菌。将分离到的菌株送检测序后，经BLAST比对，分离出的菌株分别与NCBI数据库中序列相似度高达100%。
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图 1 3种乳酸杆菌的形态观察 Fig. 1 Morphological observation of three species of Lactobacillus |
不同乳酸杆菌对皇竹草青贮饲料感官评定的影响见表 2，LAB158组、P-1-12组和MZN1组在色泽评分和pH评分上均显著高于对照组(P < 0.05)，且LAB158组最高；与对照组相比，LAB158组和P-1-12组在气味评分上也有所提高，但未达到显著水平(P>0.05)；而3个试验组在质地评分和水分评分上均显著低于对照组(P < 0.05)。总得来说，LAB158组和P-1-12组综合评分显著高于对照组(P < 0.05)，MZN1组综合评分高于对照组但差异不显著(P>0.05)，4组的感官评定等级均为一般。
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表 2 不同乳酸杆菌对皇竹草青贮饲料感官评定的影响 Table 2 Effects of different Lactobacillus on sensory evaluation of Pennisetum sinese silage |
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表 3 不同乳酸杆菌对皇竹草青贮饲料常规营养成分含量的影响 Table 3 Effects of different Lactobacillus on conventional nutrient contents of Pennisetum sinese silage |
由表 3可知，试验组皇竹草青贮饲料中干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和乳酸含量均显著高于对照组(P < 0.05)；LAB158组青贮饲料中的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量最高，且显著高于MZN1组、P-1-12组和对照组(P < 0.05)；对照组青贮饲料中无氮浸出物含量最低，但各组间差异并不显著(P>0.05)；而对照组青贮饲料中粗纤维含量最高，仅显著高于LAB158组(P < 0.05)，与MZN1组和P-1-12组差异不显著(P>0.05)。
此外，由表 4可知，在各组的皇竹草青贮饲料中，均检测出17种氨基酸，其中LAB158组青贮饲料中总氨基酸含量最高，显著高于MZN1组(P < 0.05)，但与P-1-12组和对照组无显著差异(P>0.05)；LAB158组和对照组青贮饲料中谷氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和精氨酸等5种氨基酸含量显著高于MZN1组和P-1-12组(P < 0.05)；LAB158组青贮饲料中缬氨酸含量显著高于MZN1组和P-1-12组(P < 0.05)；LAB158组和对照组青贮饲料中亮氨酸含量显著高于P-1-12组(P < 0.05)；LAB158组青贮饲料中脯氨酸含量显著高于MZN1组和P-1-12组(P < 0.05)；LAB158组青贮饲料中甘氨酸含量显著高于其他3组(P < 0.05)；LAB158组青贮饲料中丙氨酸和半胱氨酸含量显著高于对照组(P < 0.05)；除此之外，对照组青贮饲料中蛋氨酸、组氨酸和苏氨酸含量显著高于3个试验组(P < 0.05)，对照组青贮饲料中酪氨酸和丝氨酸含量显著高于MZN1组和P-1-12组(P < 0.05)。
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表 4 不同乳酸杆菌对皇竹草青贮饲料氨基酸含量的影响(干物质基础) Table 4 Effects of different Lactobacillus on amino acid contents of Pennisetum sinese silage (DM basis) |
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表 5 不同样本的Alpha多样性分析 Table 5 Alpha diversity analysis of different samples |
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表 6 不同乳杆菌对皇竹草青贮饲料优势菌门相对丰度的影响 Table 6 Effects of different Lactobacillus on dominant bacterial phyla relative abundance of Pennisetum sinese silage |
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表 7 不同乳酸杆菌对皇竹草青贮饲料优势菌属相对丰度的影响 Table 7 Effects of different Lactobacillus on dominant bacterial genus relative abundance ofPennisetum sinese silage % |
由表 5可知，对皇竹草青贮开封后进行微生物Alpha多样性分析，所有组的覆盖度均能达到99.80%以上，说明测序深度基本能全面覆盖微生物的核心组成。相比于对照组，MZN1组和LAB158组的Chao1指数和Ace指数均有所升高，说明菌群的丰富度升高；同时，MZN1组和LAB158组的Shannon指数和Simpson指数也有所升高，说明菌群的多样性升高，P-1-12组则相反。
2.4.2 基于门水平的微生物群落结构由图 2和表 6可知，基于门水平对皇竹草青贮饲料微生物群落进行结构分析发现，试验组和对照组的微生物群落组成存在差异，对照组以厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)以及拟杆菌门(Bacteroidetes)为主；而试验组以厚壁菌门和变形菌门为主，拟杆菌门相对丰度大幅下降。总体而言，厚壁菌门和变形菌门为优势菌门，但在各组中相对丰度存在差异。其中，LAB158组、P-1-12组和MZN1组厚壁菌门的相对丰度分别为92.50%、90.83%和84.48%，均显著高于对照组的71.89%(P < 0.05)；而LAB158组、P-1-12组和MZN1组变形菌门的相对丰度分别为6.88%、8.53%和13.64%，均显著低于对照组的18.88%(P < 0.05)。这说明在皇竹草青贮饲料中添加植物乳杆菌LAB158、玉米乳杆菌MZN1和草本乳杆菌P-1-12可以提高厚壁菌门所占比例，降低变形菌门所占比例。
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Acidobacteria：酸杆菌门；Actinobacteria：放线菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Proteobacteria：变形菌门；Firmicutes：厚壁菌门；Cyanobacteria：蓝藻门；Unclassified：未分类；Other：其他。 图 2 基于门水平的皇竹草青贮饲料微生物群落结构 Fig. 2 Microbial community structure of Pennisetum sinese silage at phylum level |
由图 3和表 7可知，基于属水平对皇竹草青贮饲料微生物群落进行结构分析发现，各组中绝对优势菌属均为乳杆菌属(Lactobacillus)，对照组、LAB158组、P-1-12组和MZN1组中乳杆菌属相对丰度分别达到85.03%、70.30%、90.25%和81.45%。对照组的优势菌属还有类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，相对丰度为3.31%，显著高于LAB158组、P-1-12组和MZN1组(P < 0.05)；LAB158组的优势菌属还有鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)，相对丰度为5.43%，显著高于对照组、P-1-12组和MZN1组；P-1-12组和MZN1组其次的优势菌属均为沙雷氏菌属(Serratia)，相对丰度分别为3.54%和4.69%，显著高于对照组(P < 0.05)，且MZN1组还显著高于LAB158组(P < 0.05)。除此之外，MZN1组魏斯氏菌属(Weissella)和乳球菌属(Lactococcus)相对丰度最高，而对照组明串珠菌属(Leuconostoc)相对丰度最高。
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Unclassified：未分类；Flavobacterium：黄杆菌属；Brevundimonas：短波单胞菌属；Alcaligenes：产碱杆菌属；Lactobacillus：乳杆菌属；Bacillus：芽孢杆菌属；Lactococcus：乳球菌属；Ochrobactrum：苍白杆菌属；Paenibacillus：类芽孢杆菌属；Pedobacter：土地杆菌属；Providencia：普罗威登斯菌属；Devosia：德沃斯氏菌属；Weissella：魏斯氏菌属；Serratia：沙雷氏菌属；Sphingobacterium：鞘氨醇杆菌属；Pseudochrobactrum：假苍白杆菌属；Stenotrophomonas：寡养单胞菌属；Leuconostoc：明串珠菌属；Other：其他。 图 3 基于属水平的皇竹草青贮饲料微生物群落结构 Fig. 3 Microbial community structure of Pennisetum sinese silage at genus level |
青贮饲料品质优劣首先从感官方面进行评定，本试验在青贮过程中添加植物乳杆菌LAB158、玉米乳杆菌MZN1和草本乳杆菌P-1-12之后，色泽评分和pH评分均显著高于对照组，气味评分也有所提高，而质地评分和水分评分上均显著低于对照组。产生这些变化的原因可能是因为青贮饲料在发酵过程中，通过乳酸杆菌破坏了皇竹草细胞壁结构，细胞内容物大量流出，与微生物进行各种反应，从而导致色泽、气味、质地和水分等发生变化。吴进东[19]研究表明，相比于对照组，添加不同种类的添加剂对于青贮饲料的色泽、气味、质地和pH会有所提高，但影响并不大。
3.2 不同乳酸杆菌对皇竹草青贮饲料营养成分的影响原料中较多的有害微生物和发酵过程中营养物质的损失是影响青贮发酵品质的主要原因，在发酵过程中添加乳酸杆菌可使青贮饲料快速积累乳酸且降低pH，抑制有害菌的生长，从而减少有害菌生长所产生的有氧消耗，达到降低青贮原料养分损失的目的[5, 20]。本研究发现，青贮过程中添加乳酸杆菌能使其提前达到发酵所需乳酸菌数量，从而迅速降低pH，酸性环境的形成使得试验组中乳酸含量显著高于对照组，同时乳酸还会使发酵过程中气味发生变化[21]。除此之外，添加不同乳酸杆菌均能显著提高皇竹草青贮饲料中的干物质、粗蛋白质和粗脂肪含量，说明青贮过程中乳酸杆菌的添加使其营养物质得到较好的保存；而试验组粗纤维含量均低于对照组，说明乳酸杆菌的添加能更好地降解部分细胞壁成分，从而有效提高青贮质量。Oliveira等[22]在苜蓿青贮过程中分别添加了同型乳杆菌和异型乳杆菌，发现均能提高乳酸的生成，降低pH。寇江涛等[23]研究也表明，植物乳杆菌能促进乳酸生成，降低pH，使蛋白质水解酶活性在酸性环境中得到抑制，进而减少干物质和粗蛋白质的损失。塔娜等[24]在无芒雀麦青贮过程中也发现，同型发酵乳酸菌和异性发酵乳酸菌均可抑制牧草蛋白质的降解，2种菌混合添加使用效果最好。除本试验添加乳酸杆菌能增加粗脂肪含量外，寇江涛等[23]在皇竹草青贮中加木聚糖酶，Hou等[25]在牧草青贮中添加纤维复合酶均显著提高了粗脂肪含量。
蛋白质是青贮饲料中重要的营养物质，而蛋白质中氨基酸的含量是评价蛋白质品质的重要指标。本研究中，添加乳酸杆菌之后青贮饲料中总氨基酸含量与对照组相比无显著性差异，而甘氨酸、丙氨酸和半胱氨酸均以LAB158组最高，且显著高于对照组。其中，甘氨酸和丙氨酸为呈甘味的鲜味氨基酸，其含量的增加可能会提高青贮饲料的酸甜芳香味，从而提高其适口性；而半胱氨酸具有促进细胞氧化还原的作用，半胱氨酸含量的提高能增强机体的抗逆性功能。另外，3个试验组青贮饲料中蛋氨酸和苏氨酸等含量显著低于对照组，这可能与青贮饲料中微生物群落的物质转化代谢有关，其变化原因有待于下一步利用宏基因组学等手段进行研究。
3.3 不同乳酸杆菌对皇竹草青贮饲料微生物多样性的影响青贮过程是一个极其复杂的微生物共生体系，由参与其中的多种微生物的结构与多样性影响着发酵的品质与营养成分[26]。参加青贮过程的微生物除原料上附着的微生物和引起青贮发酵的微生物外，还有能引起青贮腐败变质的微生物[27]。Alpha多样性主要通过Chao1指数和Ace指数来反映微生物群落的丰富度，以Shannon指数和Simpson指数反映物种的多样性。张娟等[28]在研究圆叶决明中添加苹果酸和嗜酸乳杆菌青贮60 d后发现，添加苹果酸和嗜酸乳杆菌后，Ace指数和Shannon指数均高于对照组。本试验中，MZN1组和LAB158组OTU数量、Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数均高于对照组，表明MZN1组和LAB158组的微生物群落丰富度和物种多样性均较高，而P-1-12组则都低于对照组。
通过高通量测序技术对样品进行16S rRNA测序，发现各组的优势菌门均为厚壁菌门，其次为变形菌门。其中，厚壁菌门是革兰氏阳性菌，主要包括芽孢、支原体和非产芽孢菌群，大多数芽孢杆菌可降解纤维素和蛋白质等大分子化合物[29]。变形菌门是革兰氏阴性菌，主要包括大肠杆菌、弧菌和螺旋杆菌等病原菌，大部分病原菌是威胁禽畜健康存活的主要因素[30]。在皇竹草青贮过程中添加乳酸杆菌提高了厚壁菌门的相对丰度，并降低了变形菌门的相对丰度，说明添加乳酸杆菌能降低有害微生物的数量，从而降低致病菌对禽畜健康的影响。
在属水平上，对照组和3个试验组的优势菌属均为乳杆菌属，说明在青贮发酵后期起主要作用的是乳杆菌属[31]，乳杆菌属在发酵过程中不仅抑制了有害细菌的生长，同时促进了乳酸的生成，改变了青贮饲料的色泽和气味，使其适口性更强。Yang等[32]研究表明，在青贮过程中乳酸的含量与乳杆菌属相对丰度呈正相关。本试验3个试验组青贮饲料中乳酸含量均显著高于对照组，而MZN1组和LAB158组中乳杆菌属相对丰度低于对照组，与张娟等[28]结论相似，可能是因为植物乳杆菌和玉米乳杆菌的添加使pH下降更快，较强的酸性环境反而抑制乳酸杆菌活性。除此之外，试验组中普罗威登斯菌属(Providencia)相对丰度显著低于对照组，普罗威登斯菌属属于条件致病菌，常引起腹泻和肠道外感染[33]；而魏斯氏菌属和鞘氨醇杆菌属等在试验组中相对丰度较高，说明添加乳酸杆菌可以有效改变微生物群落组成。总得来说，皇竹草青贮过程中添加不同乳酸杆菌能改变其微生物群落的丰富度和物种多样性，形成不同的优势菌群，同时还能降低杂菌的数量，杂菌营养价值较低且可能会对禽畜的健康产生不利影响，杂菌数量的降低还能相应提高青贮饲料的品质[29]。
4 结论本研究结果表明，3种乳酸杆菌均能有效改善皇竹草青贮饲料感官评定的综合评分，提高营养成分含量，改变微生物优势种群的种类，从而提高青贮饲料的品质。综合考量，以添加植物乳杆菌LAB158菌株的青贮效果最佳。
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