随着农业农村现代化的发展，饲草饲料作为畜牧业发展的基础，对于促进养殖业和种植业产业结构调整以及发展现代高产、优质和高效农业战略有重要的作用[1]。我国的饲草资源主要来源于天然草地，占国土面积约42%，面积达到3.94亿hm2，但是由于长期以来的不合理利用，草地普遍退化，饲草生产力明显下降[2]。近年来，传统饲草已经无法满足畜牧行业快速发展的需求，开发非常规饲草是草食畜牧业可持续发展的有效途径之一，同时可缓解我国饲草资源紧张，起到降低草食动物养殖的饲草成本和积极促进现代畜牧业发展的作用[3]。
皇竹草(Pennisetum sinese Roxb)是由象草和美洲狼尾草杂交而来，它有着生物产量高、利用年限长以及抗病虫害能力强等优点。近年来，贵州省在贯彻落实国家供给侧结构性改革、脱贫攻坚等政策推动下，皇竹草种植面积在逐年增加。2019年。贵州省累计种植面积2.24万hm2，主要种植区域为毕节、安顺、黔西南、黔东南和铜仁等地区[4]。皇竹草地上生物量巨大，南方种植的皇竹草地上生物量可达400 t/hm2[5]。研究表明，在饲料中添加适量的皇竹草，能改善动物的肠道炎症，有利于动物的生长发育，降低养殖的饲料成本[6-8]。虽然皇竹草适宜在南方地区种植，但收获期多集中在雨季，不利于青草保存，所以对其进行青贮调制是最有效的利用方式。但皇竹草的中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量较高，分别为76.92% DM和48.90% DM；可溶性碳水化合物(WSC)和粗蛋白质(CP)含量较低，分别为6.99% DM和3.71% DM；缓冲能较高，为97.83 E/kg DM，这导致其直接青贮难以获得优质的青贮饲料，所以对其进行混合青贮是改善其青贮质量的有效方式[9]。陈作栋等[10]研究表明，将皇竹草与花生秧混合进行青贮，提升了青贮的发酵品质，抑制了青贮中蛋白质的水解，最适宜的混合比例是70%皇竹草和30%花生秧。王福春等[11]研究表明，将油菜秸秆与皇竹草混合进行青贮，可以显著提高锦江黄牛的饲粮表观消化率，油菜秸秆与皇竹草按照3 ∶ 7比例进行混合最适宜。
据统计，白酒与酒糟的产量比为1 ∶ 3，国内每年酒糟生产量高达5 866万t，其中茅台酒糟的产量达到了15万t以上，其水分含量高，易腐败变质，若不及时处理，大量的酒糟堆积会对环境造成严重的污染，酒糟的再利用是白酒行业面临的严重难题。目前，关于酒糟饲料化利用的研究较多。贾春旺等[12]研究表明，添加青稞酒糟可以提高多年生黑麦草和紫花苜蓿混合青贮的饲料发酵品质，以添加20%青稞酒糟较为适宜。康坤[13]研究表明，甘薯蔓与酒糟、稻草混合青贮后，较好地保存了青贮料的养分含量，提高了青贮料的发酵品质。以上研究表明，将酒糟和饲草进行混合青贮可以有效改善青贮饲料的发酵品质，从而实现酒糟的饲料化利用。茅台酒糟中CP和WSC含量分别为29.30% DM和8.30% DM，此外还含有丰富的氨基酸、粗纤维和粗脂肪等成分[14]。茅台酒糟中丰富的养分含量正好能够弥补皇竹草中养分含量单一和WSC含量低的缺点。因此，我们猜想皇竹草与茅台酒糟混合青贮能够获得高品质的青贮饲料，而目前关于皇竹草和茅台酒糟此类研究还未见报道。
鉴于此，本试验旨在研究皇竹草与茅台酒糟不同混合比例对其青贮品质的影响，通过对其养分含量、发酵品质和微生物多样性等指标进行综合分析，筛选出皇竹草与茅台酒糟混合青贮的最适比例，旨在为皇竹草和茅台酒糟饲料化利用提供科学依据，为缓解我国饲草资源紧缺和优质青贮产品的生产提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所用材料为在贵州省关岭县种植的皇竹草，以及从贵州省仁怀市茅台镇茅台集团酒厂取回的茅台酒糟。其原料的养分含量如表 1所示，新鲜茅台酒糟的CP、干物质(DM)和WSC含量高于新鲜的皇竹草，而NDF和ADF含量低于新鲜的皇竹草。
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表 1 新鲜茅台酒糟与皇竹草养分含量(干物质基础) Table 1 Nutrient contents of fresh Moutai distiller's grains and Pennisetum sinese Roxb (DM basis) |
本试验设置4个皇竹草与茅台酒糟的混合比例，分别为90%皇竹草+10%茅台酒糟(H9J1)、80%皇竹草+20%茅台酒糟(H8J2)、70%皇竹草+30%茅台酒糟(H7J3)和60%皇竹草+40%茅台酒糟(H6J4)，以鲜重为基础。青贮45 d后，对皇竹草和茅台酒糟原料以及不同混合比例处理的养分含量、发酵品质和微生物进行测定，每个处理设置3个重复。
1.3 青贮调制将收获的新鲜皇竹草切成2~3 cm长小段，按照试验设计比例将皇竹草与茅台酒糟充分混匀后，称取300 g，装入聚乙烯袋中，用真空机抽真空密封青贮。青贮袋封口后置于室温下避光保存45 d。
1.4 测定项目及方法 1.4.1 养分含量和发酵品质测定pH采用精密pH计测定；氨态氮(ammonia nitrogen, AN)、乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)、丙酸(propionic acid, PA)和丁酸(butyric acid, BA)含量采用DB15/T 1458—2018[15]方法测定；DM含量测定方法参照张丽英[16]的饲料分析；CP含量采用凯氏定氮法(定氮仪KN680，ALVA仪器有限公司)测定[17]；WSC含量采用蒽酮-硫酸法[18]测定；NDF和ADF含量采用滤袋分析法[19]测定(ANKOM A-200i)。
1.4.2 微生物多样性分析将每个青贮处理中的3个重复样品均匀地混合在一起。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒提取青贮饲料中的微生物组总DNA，利用前引物(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和后引物(5′-GGACTACHVHHHTWTCTAAT-3′)获得细菌16S rRNA基因V3~V4高变异区。扩增产物回收纯化，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库。使用MiSeq测序仪进行2×300 bp的双端测序并对结果进行分析。利用UCLUST比对工具，按97%的序列相似度，对操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)进行归并和划分[20]，通过与Greengenes数据库的模板序列相对比，对OTU进行分类地位的鉴定。利用Shannon、Simpson、Chao1和Ace这4个α多样性指数来分析微生物菌群的丰富度和均匀度。使用QIIME软件进行各分类水平的分类学组成分析。
1.5 数据统计分析数据采用SPSS 26.0软件进行方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 皇竹草与茅台酒糟不同混合比例对其青贮饲料养分含量的影响由表 2可知，H8J2、H7J3和H6J4处理青贮饲料中CP和WSC含量显著高于H9J1处理(P＜0.05)，而NDF和ADF(H8J2处理除外)含量显著低于H9J1处理(P＜0.05)。H7J3和H6J4处理青贮饲料中CP含量较高，都高于19.00%；WSC含量都高于2.40%。
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表 2 皇竹草与茅台酒糟不同混合比例对其青贮饲料养分含量的影响 Table 2 Effects of different mixing ratios of Pennisetum sinese Roxb and Moutai distiller's grains on nutrient contents of their silage |
由表 3可知，H7J3处理青贮饲料的pH和AN含量都最低，显著低于其他处理(P＜0.05)。青贮饲料中LA含量最高的是H6J4处理，显著高于其他处理(P＜0.05)，最低的是H9J1处理。H8J2、H7J3和H6J4处理青贮饲料中AA含量显著低于H9J1处理(P＜0.05)。对于PA含量而言，H7J3处理青贮饲料中PA含量最低，为3.03 g/kg DM，显著低于其他处理(P＜0.05)。所有处理青贮饲料中都未检测到BA。
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表 3 皇竹草与茅台酒糟不同混合比例对其青贮饲料发酵品质的影响 Table 3 Effects of different mixing ratios of Pennisetum sinese Roxb and Moutai distiller's grains on fermentation quality of their silage |
由表 4可知，所有原料和处理微生物α多样性的覆盖度(coverage)都达到了0.999，说明测序基本全面覆盖所有微生物。α多样性分析包括群落物种多样性及丰富度的分析，Chao1指数和Ace指数用于表示群落物种的丰富度，Shannon指数和Simpson指数用于表示群落物种的多样性程度。H8J2、H7J3和H6J4处理的Chao1指数和Ace指数高于H9J1处理，说明这3个处理的菌群丰富度高；H8J2、H7J3和H6J4处理的Simpson指数低于H9J1处理，说明这3个处理的菌群多样性低。
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表 4 皇竹草与茅台酒糟不同混合比例青贮饲料微生物α多样性分析 Table 4 α diversity analysis of microorganism in silage with different mixing ratios of Pennisetum sinese Roxb and Moutai distiller's grains |
由图 1可知，各原料和处理的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)，其次是变形菌门(Proteobacteria)；除此之外，拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)也有少量存在，新鲜茅台酒糟中软壁菌门(Tenericutes)也有部分存在。H8J2和H7J3处理厚壁菌门的相对丰度相较于H9J1处理均有所提高，同时变形菌门的相对丰度都出现降低。
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Unclassified：未分类；Other：其他；Gemmatimonadetes：芽单胞菌门；Acidobacteria：酸杆菌门；Fusobacteria：梭杆菌；Deinococcus-Thermus：异常球菌-栖热菌门；Epsilonbacteraeota：埃普西隆杆菌门；Tenericutes：软壁菌门；Actinobacteria：放线菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Proteobacteria：变形菌门；Firmicutes：厚壁菌门。 图 1 皇竹草与茅台酒糟不同混合比例青贮饲料微生物在门水平上的分布 Fig. 1 Microbial distribution at phylum level in silage with different mixing ratios of Pennisetum sinese Roxb and Moutai distiller's grains |
由图 2可知，新鲜皇竹草和新鲜茅台酒糟中乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度较低，未分类和其他菌属相对丰度较高，单独青贮不易成功。青贮45 d后，H9J1、H8J2、H7J3和H6J4处理的优势菌属为乳杆菌属，相对丰度分别为79.33%、73.74%、72.73%和58.55%；此外，与新鲜皇竹草相比，H9J1、H8J2、H7J3和H6J4处理的肠球菌属(Enterococcus)相对丰度明显减少。由此可见，皇竹草与茅台酒糟混合青贮中的乳杆菌属等有益菌相对丰度增加，肠球菌属等有害菌相对丰度降低，且茅台酒糟混合比例在10%~30%时，乳杆菌属相对丰度较高，大于72.00%。
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Unclassified：未分类；Other：其他；Clostridium_sensu_stricto_11：狭义梭菌属11；Flavobacterium：黄杆菌属；Corynebacterium_1：棒状杆菌属1；Stenotrophomonas：窄食单胞菌属；Acetobacter：醋杆菌属；Enterococcus：肠球菌属；Bacillus：芽孢杆菌属；Pseudomonas：假单胞菌属；Lactococcus：乳球菌属；Lactobacillus：乳杆菌属。 图 2 皇竹草与茅台酒糟不同混合比例青贮饲料微生物在属水平上的分布 Fig. 2 Microbial distribution at genus level in silage with different mixing ratios of Pennisetum sinese Roxb and Moutai distiller's grains |
本试验中所使用的新鲜茅台酒糟中DM、CP和WSC含量高于新鲜皇竹草，NDF和ADF含量低于皇竹草，所以皇竹草与茅台酒糟进行混合青贮可以改善青贮品质。刘志云等[21]研究表明，茅台酒糟的DM、CP和淀粉含量都比其他白酒糟含量高，这为微生物生长繁殖提供了良好的养分含量。高晓梅等[22]研究表明，DM含量高，可以抑制丁酸菌和大肠杆菌等有害菌的生长繁殖。本研究中，随着茅台酒糟混合比例的提高，各处理青贮饲料中CP含量逐渐提高，这与陈冬梅等[23]研究报道一致。CP含量增加的原因是新鲜酒糟本身的CP含量比较高。WSC含量越高，产生的LA越多，能快速降低环境的pH。本研究中，随着茅台酒糟混合比例的提高，各处理青贮饲料中WSC含量逐渐提高，这与Chiou等[24]结果一致，他们研究表明在象草青贮中添加高粱酒糟能增加其WSC含量。本研究中，当茅台酒糟的混合比例从10%提高到30%，皇竹草青贮的NDF和ADF含量呈现降低的趋势，这与任海伟等[25]研究报道一致，其研究表明，白酒糟与菊芋渣混合青贮，青贮的NDF和ADF含量呈现降低的趋势。NDF和ADF含量降低，说明了皇竹草与茅台酒糟混合青贮有利于青贮原料中纤维的降解，增加青贮的饲用价值[26]。但是当茅台酒糟的混合比例增加到40%时，皇竹草青贮的NDF和ADF含量反而有所增加，这说明茅台酒糟的混合比例不易过高。
3.2 皇竹草与茅台酒糟不同混合比例对其青贮饲料发酵品质的影响研究表明，优质青贮饲料要求pH不大于4.2，不小于3.8[27]。在本研究中，H7J3处理的pH(3.82)符合优质青贮的标准。H8J2、H7J3和H6J4处理的LA含量高于H9J1处理，说明皇竹草与茅台酒糟混合青贮有利于LA含量增加。本试验发现一个有趣的现象，H7J3处理的LA含量高于H9J1处理，但差异不显著，而H7J3处理的pH显著低于H9J1处理，此结果与刘秦华等[28]的研究一致，可能的原因是青贮中的pH是由各种因素共同影响的，并不是LA单一决定的。研究表明，青贮中的PA含量低，对青贮的有氧稳定性有积极作用[29]。本试验中，H7J3处理的PA含量最低，说明H7J3处理的有氧稳定性可能更高，这与孙安琪[30]的研究一致。如果青贮饲料中检测到BA说明青贮饲料中含有梭菌，这会加剧青贮中DM的损失。在本研究中，所有处理都未检测到BA，说明皇竹草与茅台酒糟混合青贮有利于青贮饲料养分含量的保存[31]。Shao等[32]研究表明，青贮初期，青贮发酵以同型乳酸菌发酵为主，但后期以异型乳酸菌发酵为主，从而导致AA含量增高。本试验中，H7J3和H6J4处理的AA含量低于其他2个处理，而且AA含量低于LA含量，这说明这2个处理可能主要以同型乳酸菌发酵为主；而H9J1和H8J2处理AA含量较高，且高于LA含量，说明这2个处理可能主要以异型乳酸菌发酵为主。AN含量可以反映青贮过程中蛋白质和氨基酸的降解程度[33]。本试验中，随着茅台酒糟混合比例的提高，其AN含量先降低后升高，在茅台酒糟混合比例为30%时达到最低，为0.01 g/kg DM，这说明H7J3处理的蛋白质水解程度最小，这与原现军等[34]的研究结果一致。从发酵指标综合来看，皇竹草与茅台酒糟混合比例为7 ∶ 3时的青贮品质最好。
3.3 皇竹草与茅台酒糟不同混合比例对其青贮饲料微生物多样性的影响青贮品质的变化本质是由微生物种类和数量的演绎变化引起的。厚壁菌门中的细菌大多属于革兰氏阳性细菌，主要包括产芽孢、非产芽孢和支原体菌群，可以降解纤维素、淀粉和蛋白质等物质；而变形菌门是一类革兰氏阴性菌，包括大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌，这些菌会跟乳酸菌竞争发酵底物，影响青贮的发酵品质[35]。结合OTU统计和α多样性分析，本试验中，新鲜茅台酒糟与新鲜皇竹草中的优势菌门为变形菌门，混合青贮后的各处理中的优势菌门为厚壁菌门，这与陶莲等[36]的研究结果一致。这说明皇竹草与茅台酒糟混合青贮后有益菌丰度增加，从而抑制了有害菌的生长，降低了青贮饲料养分的消耗。从属水平来看，新鲜茅台酒糟和皇竹草原料中的优势菌属为未分类和其他未识别的属，而乳杆菌属等有益菌含量很低，这说明这2种原材料单独青贮时都不易成功[37]。皇竹草与茅台酒糟混合青贮的各处理的优势菌属为乳杆菌属，而随着茅台酒糟混合比例的提高，皇竹草青贮中乳杆菌属的相对丰度降低，在茅台酒糟混合比例为10%~30%时，乳杆菌属的相对丰度较高，大于72.00%。这可能是由于白酒糟中的复膜孢子酵母属、伊萨酵母属和曲霉属丰度较高[38]，当酒糟添加比例较高时，反而抑制了乳酸菌的生长。从微生物多样性的角度来看，皇竹草与茅台酒糟混合比例为7 ∶ 3时，可以很好地促进青贮饲料中有益微生物的生长，抑制有害菌的繁殖，从而对青贮饲料品质起到很好的促进作用。
4 结论皇竹草与茅台酒糟混合青贮能使青贮饲料的营养价值和发酵品质均有不同程度的提升，并且能够提高青贮中有益菌群的相对丰度，降低有害菌群的相对丰度。结合养分含量、发酵品质和微生物多样性等指标综合分析，皇竹草与茅台酒糟混合比例为7 ∶ 3时，其混合青贮饲料品质较好。
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