2. 北京同力兴科农业科技 有限公司, 北京 100193
2. Beijing Tonglixingke Agricultural Science & Technology Co., Ltd., Beijing 100193, China
哺乳动物肠道不仅是机体消化吸收营养物质的首要部位，还扮演着阻挡有害抗原和病原菌入侵的首要屏障[1]。肠道形态、黏液合成能力(杯状细胞数目)、上皮渗透性、刷状缘酶活力等均可反映肠道黏膜的完整性，其中使用最多也最直接的评价肠道黏膜完整性的指标是绒毛高度、隐窝深度、杯状细胞数目和淋巴细胞数目。另外，分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和内源防御素的表达直接反映了肠道先天性免疫能力[2]。新生仔猪主要通过从摄取的母乳中获得免疫球蛋白等免疫蛋白和调节因子，仔猪断奶后肠道的结构和功能都会发生显著变化[3]，影响仔猪的生长，每年“早期断奶应激综合征”给养猪业带来巨大的经济损失[4]。近些年研究发现，断奶会影响肠道先天免疫功能相关蛋白的表达，如人断奶后肠道内抗菌肽血管生成素4(ANG4)的表达是断奶前的20倍[5]。有关仔猪断奶前后肠道结构变化的报道很多，但鲜见系统地研究断奶对仔猪肠道先天免疫功能的研究。随着内源抗菌肽的研究，前人在猪体内发现了多种抗菌肽，但尚未发现与人ANG4同源的抗菌肽基因，在肠道内表达较多的是猪防御素1(porcin β-defensin 1,pBD-1)和猪防御素2(porcin β-defensin-2，pBD-2)[6]，它们与sIgA一起形成肠黏膜先天免疫屏障，抵御病原微生物的入侵[7]。因此，本文以不同日龄仔猪肠道黏膜形态及sIgA浓度和防御素基因表达的变化为切入点，旨在研究断奶对仔猪肠道屏障功能的影响，特别是完整性、免疫球蛋白和防御素有无变化，为断奶仔猪肠道屏障功能发育规律的进一步研究和预防调控仔猪断奶应激提供理论基础。
试验选用6窝杜×长×大健康仔猪，每窝挑选出生状况良好仔猪各4头。仔猪试验期由各自母猪喂养，无教槽料适应，产房统一安装保温箱及保温垫，混凝土产床，室内平均温度(27±2) ℃，湿度35%~55%。试验期间，每日对产房地面，产床进行消毒。断奶前仔猪采食母乳，21 d断奶后仔猪在产床待1周后转入保育舍，饲喂商业保育颗粒饲料，自由采食。试验期间仔猪自由饮水。
本试验于中国农业大学涿州动物试验基地进行。于出生7、14和21 d以及断奶后14 d(出生35 d)分别从6窝仔猪中每窝挑选1头健康仔猪(共24头)，每个时间处理6头仔猪，屠宰后剖开腹腔，去除淋巴结后将小肠放平，取相同部位的空肠10 cm，用无菌0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)(pH 7.4)冲洗后用干净的滤纸小心擦干，用载玻片刮取空肠黏膜，放于1.5 mL离心管冷冻保存。另从十二指肠中部和空肠中部分别采集2段5 cm左右的肠断，用预冷的生理盐水冲洗后一段放于4%多聚甲醛溶液(0.1 mol/L PBS，pH 7.0~7.6)中进行固定，另一段放于液氮迅速冷冻，然后贮存于-80 ℃冰箱中。
多聚甲醛溶液固定后的肠段经石蜡包埋后切成5 μm切片，苏木精-伊红(HE)染色，每个样品做5张切片，每个切片选取6个典型视野，采用图像分析软件对处理采集的图像并量取绒毛高度(绒毛顶端至隐窝开口处)和隐窝深度(绒毛隐窝基底处至隐窝低端)，单位μm。每头仔猪测定6个不同肠段的绒毛，从基部开始计数，每100个柱状细胞中杯状细胞和淋巴细胞的数目。
向空肠黏膜中加入1 mL含2 mg/mL蛋白酶抑制剂(华兴博创生物技术有限公司，北京)的0.01 mol/L PBS，用组织匀浆机(IKA Work，南京)匀浆黏膜组织，3 500 r/min离心15 min，收集上清。按照酶联免疫吸附法(ELISA)定量测定试剂盒(Cusabio Biotech Company，武汉)的说明，进行酶联免疫吸附试验测定黏膜sIgA浓度。
切取1~2 cm空肠肠段在研钵中加入液氮研磨，取100 mg组织用于提取总RNA，提取方法参照RNAzol RT试剂盒(Molecular Research Center,Cincinnati,OH)说明。用Nanodrop ND-1000测定所提总RNA的质量和浓度，当OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.0和OD260 nm/OD230 nm在1.5~2.2说明RNA质量较好，可用于下一步试验。取1 μg RNA加入到20 μL反转体系中，按照反转录试剂盒(TaKaRa，大连)说明将RNA反转为cDNA。
根据NCBI数据库提供的相关基因序列，使用Primer Premier 5.0生物软件设计pBD-1、pBD-2以及内参基因β-肌动蛋白(β-actin)的PCR特异引物(表1)，由三博生物有限公司合成(北京)。
 | 表1 基因引物序列 Table 1 Sequences of gene primers |
首先制备实时荧光定量PCR标准曲线，取普通PCR反应产物1 μL用灭菌超纯水稀释100倍后，再逐级稀释至109倍，根据预试验模板中的所测基因cDNA浓度，选择8个连续的浓度梯度作为标准曲线模板与cDNA模板一起按照试剂盒(TaKaRa，大连)说明进行实时荧光定量PCR扩增。扩增体系如下：Buffer 5 μL，SYBR Green Ⅱ 0.2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板1 μL，无RNA酶超纯水3 μL，空白对照组以相同体积超纯水代替cDNA模板。反应于ABI 7500 RT-PCR仪器(Applied Biosystems)中进行，反应程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，退火温度下34 s，42个循环。
所有测定结果均以平均值和SEM表示，显著性统计采用SAS 8.1软件中单因素方差(one-way ANOVA)分析进行，差异显著时采用Duncan氏法多重比较。当P<0.05为差异显著，0.05<P<0.10为具有显著性趋势。
为研究仔猪出生至断奶后小肠形态变化，本试验测定了仔猪出生7、14、21和35 d的十二指肠和空肠绒毛高度和隐窝深度以及两者之比(表2)。结果表明，与十二指肠相比，哺乳仔猪空肠具有更高的绒毛、更浅的隐窝和更大的绒毛高度/隐窝深度(V/C)；断奶后(出生35 d)，以上指标全部逆转，即空肠绒毛高度低于十二指肠，隐窝深度高于十二指肠，V/C也低于十二指肠。较出生7 d，出生14和21 d的十二指肠和空肠绒毛高度显著降低(P<0.05)、空肠的V/C变小，断奶成为一个分界点，断奶之后，十二指肠的绒毛高度与出生7 d无显著差异(P>0.05)，但显著高于出生14和21 d(P<0.05)，空肠绒毛高度与出生21 d无显著差异(P>0.05)。断奶后空肠的隐窝深度增加，显著高于出生7、14、21 d(P<0.05)。另外，断奶后空肠的V/C显著低于出生7、14、21 d(P<0.05)。
| 表2 不同日龄仔猪肠道形态的变化 Table 2 The changes of intestinal morphology in piglets at different ages |
肠上皮杯状细胞是分泌黏液主要细胞，而肠上皮淋巴细胞主要参与肠道免疫和炎症反应。本试验对以上2种细胞进行计数(表2)，发现断奶前仔猪空肠上皮中杯状细胞和淋巴细胞数目明显多于十二指肠，说明空肠是小肠分泌和免疫的重要肠段。经过断奶刺激，十二指肠上皮的杯状细胞和淋巴细胞数目较断奶前(出生7、14、21 d)显著增多(P<0.05)。空肠上皮杯状细胞数目断奶后与断奶前没有显著差异(P>0.05)，但是断奶后其上皮淋巴细胞数目显著高于断奶前(P<0.05)。
肠道上皮的浆细胞能够分泌大量的sIgA，它在抵抗外来抗原及毒素中发挥着重要的作用，是黏膜天然免疫的重要组成部分之一。本试验结果表明，断奶前出生21 d空肠黏膜中sIgA浓度为42.88 mg/g，断奶后为71.19 mg/g(表3)，说明断奶后仔猪空肠分泌了更多的sIgA(P=0.001)以保护肠黏膜。
| 表3 仔猪断奶前后空肠黏膜组织中sIgA浓度和防御素基因表达变化 Table 3 The changes of jejunal mucosa sIgA concentration and defensin gene expressions in piglets before and after weaning |
关于仔猪空肠防御素基因的表达，β-actin、pBD-1和pBD-2基因扩增片段长度与其引物一致，而且条带单一。以β-actin基因为参照，得到pBD-1和pBD-2基因的相对表达量(表3)，可知断奶后仔猪空肠pBD-1和pBD-2基因的表达分别是出生21 d的1.64和1.65倍(P<0.05)。
小肠是通过肠上皮绒毛和隐窝发挥吸收营养物质和阻挡各种抗原的功能。霍永久等[8]研究表明，与初生时期相比，出生3 d时仔猪肠道绒毛显著变高，隐窝显著加深。与其不同，本试验发现从出生7 d到断奶前，仔猪绒毛变短，隐窝有不变或变浅的趋势，Cera等[9]获得与本试验类似的结果，发现哺乳期间出生3~21 d的仔猪绒毛高度逐渐变短，造成不同研究结果的差异原因可能是研究仔猪的日龄阶段不同所致，出生后仔猪肠道仍在发育，初乳中的营养物质和抗原刺激了肠道绒毛的生长，同时也对乳中物质形成了抗原耐受性，但在之后的哺乳过程中，肠黏膜缺乏刺激，绒毛生长停滞。断奶应激使得仔猪采食量下降和营养缺乏，肠道的结构和功能受损，主要表现为断奶后5 d时肠道绒毛萎缩至断奶前的1/2高度，同时隐窝增生[10,11]。本试验结果与前人研究结果一致，断奶后空肠绒毛高度较出生7 d显著降低，同时断奶后空肠的隐窝增生明显，隐窝深度较断奶前出生21 d显著增加。
小肠黏膜上皮淋巴细胞是位于肠绒毛上皮细胞间或细胞内的一群淋巴细胞，其绝大多数为CD8+ T细胞。上皮淋巴细胞能够分泌干扰素-γ、白细胞介素(interleukin,IL)-2和IL-5等多种细胞因子；其还具有自然杀伤活性，能杀死和清除病原感染和受损的上皮细胞[12]。在正常健康生理状况下，上皮淋巴细胞处于相对稳定的水平，如本试验中出生7~21 d仔猪十二指肠和空肠上皮中的淋巴细胞数目无显著变化。当受到断奶等刺激时，淋巴细胞从血液向肠道上皮中迁移[13]，起到修复肠黏膜损伤和清除病原菌等作用。本试验结果验证了上述内容，断奶后仔猪十二指肠和空肠上皮中的淋巴细胞数目较断奶前显著增加。
sIgA的主要功能是防止细菌附着于黏膜细胞，一直以来被认为其参与抵抗病原微生物黏附并侵入到黏膜的第一道保护屏障[14]。有关断奶对肠道黏膜sIgA分泌的影响研究较少，研究发现仔猪在出生时固有层中含有T和B淋巴细胞，但其数目在出生后4周才加倍，出生时肠道中的sIgA浓度很低，出生后3周，sIgA分泌量随着其分泌细胞数目的增加而增加[15]。本研究也发现，出生35 d(断奶后)仔猪空肠组织中的sIgA浓度显著高于出生21 d时的仔猪。
防御素是一类内源性抗菌肽(具有抑菌或杀菌的小分子多肽)，可通过趋化和调节免疫因子的表达进而参与调节机体的天然免疫，其在肠道、呼吸道和皮肤等上皮中的功能已被证明[5]。防御素根据其二级结构差异可分为α、β和γ 3类，在猪体内目前只发现了α和β防御素[16]。有关内源抗菌肽表达随肠道发育的变化研究较少，近年研究发现人体内的一些抗菌肽，如ANG4和再生胰岛衍生蛋白3γ(REG3γ)在断奶后肠道内表达量远远高于断奶前[17]，而凯瑟琳类抗菌肽主要在新生儿肠道内表达[18]。从本研究也发现断奶影响仔猪肠道防御素的表达，断奶后空肠pBD-1和pBD-2的表达量都显著增加，可能是由于表达防御素的细胞数目增加，也可能是断奶刺激使得微生物通过免疫屏障进入固有层，然后通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)等通路刺激防御素的表达，其具体的机理还需进一步研究。
① 断奶前，仔猪健康状况下肠道屏障完整，sIgA和防御素表达的水平相对较低。
② 断奶破坏了肠道完整性，使得肠道绒毛萎缩，隐窝增生，V/C降低，肠道上皮屏障受到损伤，大量的淋巴细胞趋化至肠道上皮中。
③ 断奶后微生物入侵刺激了仔猪空肠sIgA和防御素的表达。
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