菌株形态学特征鉴定用革兰氏染色法^[17]和孔雀石绿芽孢染色法^[18]，生理生化特性鉴定参考东秀珠等^[19]和Garrity等^[20]的方法进行。为进一步确认，提取菌株基因组DNA，采用细菌通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)^[21]对菌株的16S rRNA基因进行扩增。PCR纯化产物和pGEM-T进行T连接后转化大肠杆菌DH5α，测序由北京华大基因生物公司完成。将测序结果在NCBI上用BLAST程序与GenBank中16S rRNA基因序列进行同源性分析，用Mega 5.1中的邻接(neighbor-joining)法构建系统发育树。

将种子液以1.0%的接种量接入100 mL LB液体培养基，6 h后每间隔2 h取样1次，31 h后每隔4 h取样1次，直至60 h。测定时将培养液均稀释10倍，采用分光光度法测定600 nm处的OD值，绘制菌株生长曲线。此外，将种子液以1.0%接种量接种至基础发酵培养基，在37 ℃、220 r/min条件下发酵培养，研究选定纤维素分解菌不同发酵时间的产酶能力。

试验菌株酶学特性研究的具体方法参考李忠玲等^[22]、Mawadza等^[23]和刘海艳等^[24]研究中的方法进行。

在需氧条件下，通过CMC平板法初筛，筛选出了10株透明圈明显的菌株，然后将初筛的菌株反复划线分离纯化培养4~5代，结合摇瓶发酵法复筛，最终确定选用发酵24 h时纤维素酶比活力最强的菌株C9(36.4 U/g)用于深入研究(表1)。将菌株C9点种于CMC平板上培养24 h，刚果红染色法染色后，菌落周围仍有很大的透明圈，说明该菌株具有强的分解CMC的能力，并且这种能力能够稳定遗传给后代(图 1)。

从图6生长曲线看，Bacillus sublitis BY-2在接种后8~20 h为对数期，20 h以后进入稳定期，并且持续至40 h左右，40 h后菌体的繁殖逐渐进入衰退期。

将种子液按1.0%接种量接种，在发酵的不同时间测定Bacillus sublitis BY-2所产CMCase的比活力。结果表明，在28 h内随着发酵时间的延长，Bacillus sublitis BY-2的产酶能力也逐渐增大，在发酵至28 h时CMCase的比活力达到最高(46.2 U/g)，随后CMCase的比活力略有下降，但基本保持稳定(图 7)。

由图 8可知，Bacillus sublitis BY-2产CMCase 的最适反应pH为5.5。将Bacillus sublitis BY-2 的粗酶液与不同pH的缓冲液混匀，在40 ℃水浴保温1 h后，与最适反应pH相比，其所产CMCase的相对比活力在pH 3~8的范围内均在80%以上(图 9)，说明Bacillus sublitis BY-2所产CMCase具有较强的耐酸碱性。

图 8(Figure 8)

Fig. 8

图 8 pH对CMCase比活力的影响 Fig. 8 Effect of pH on CMCase specific activity

图 9(Figure 9)

Fig. 9

图 9 pH对CMCase稳定性的影响 Fig. 9 Effect of pH on CMCase stability

在最适pH条件下，Bacillus sublitis BY-2产CMCase的最适反应温度为65 ℃(图 10)；将Bacillus sublitis BY-2的粗酶液分别在不同温度下水浴保温1 h，其所产CMCase的比活力在50 ℃以上时迅速下降，在80 ℃时几乎失活(图 11)。

图 10(Figure 10)

Fig. 10

图 10 温度对CMCase比活力的影响 Fig.10 Effect of temperature on CMCase specific activity

图 11(Figure 11)

Fig. 11

图 11 温度对CMCase稳定性的影响 Fig.11 Effect of temperature on CMCase stability

此外，在最适反应pH及最适反应温度条件下，在反应5 min时CMCase比活力最高(138.1 U/g)，随着与底物反应时间的延长，Bacillus sublitis BY-2所产CMCase的比活力逐渐降低，至30 min后CMCase比活力变化不大(图 12)。

图 12(Figure 12)

Fig. 12

图 12 时间对CMCase比活力的影响 Fig.12 Effect of time on CMCase specific activity

纤维素是植物通过光合作用生产的地球上最丰富、最廉价的可再生资源^[25]。由于纤维素具有水不溶性的高结晶结构，其外围又被木质素层包围着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难。此外，高成本的纤维素酶也是利用纤维素的障碍，因此，纤维素到目前为止仍没有得到很好地利用^[26]。在畜牧业和饲料工业中，为了缓解目前能量饲料短缺的局面，高产纤维素分解菌种的分离筛选一直被人们重视。真菌所产的纤维素酶因种类齐全而被应用于食品、饲料、纺织、燃料和化学工业等生产领域中^[27，28]。但真菌生长慢，生产纤维素酶成本高，因此，筛选具有培养简单、生长速度快、世代周期短等特点的纤维素分解菌具有较高的潜在应用性^[29]。

以CMC为唯一碳源的选择培养基培养，用刚果红染色法来初步分离筛选纤维素分解菌，因简单快捷、成本低等优点，被广泛认为是初步筛选纤维素分解菌最好的方法^[15]。目前，人们已从牛的瘤胃^[30,31,32]，犀牛^[33]、藏香猪^[24]以及大熊猫^[12]的粪便，土壤^[34]，鹅的胃肠道^[35]以及海洋细菌^[36]等中分离出来了纤维素分解菌，主要有芽孢杆菌、梭菌、纤维菌属、瘤胃球菌属、拟杆菌属等^[37,38]。

本试验将采集到的藏香猪盲肠内容物用蒸馏水适当稀释后，在80 ℃振荡水浴条件下振荡30 min，将不含芽孢的菌体及杂菌杀死，然后通过反复初筛和复筛，筛选出了1株能够高效分解纤维素的菌株Bacillus subtilis BY-2。该菌株在发酵培养至24 h时，其所产CMCase比活力高于Sadhu等^[39,40]所报道的结果，但低于Wang等^[41]所报道的真菌所产CMCase的比活力。

在微生物生长繁殖的过程中，种龄、种子液的浓度、接种量的大小、菌体培养条件以及培养基的营养成分等对其生长和代谢均有重要的影响^[42]。本试验筛选的Bacillus subtilis BY-2菌株在接种8 h后生长开始进入对数期，20 h以后进入稳定期，并且持续至40 h左右，与汪海峰等^[43]、高颖等^[44]的试验结果基本一致，但却有别于殷晓敏等^[45]的试验结果。从Bacillus subtilis BY-2在不同发酵时间的产酶能力看，其产酶特性与生长特性基本吻合，即：在8~20 h这一时期生长最快，为代谢旺盛、酶系活跃阶段；在20~40 h之间，进入稳定产酶阶段。在菌种选育过程中，生长速率快、产酶早、产酶量高的菌株常作为筛选的目标菌株，因为在微生物的工业生产中，菌体在单位时间内合成的目标产物的数量是生产成本的决定性因素^[46]。另外，当产酶量高、生长速率快的菌株作为益生菌饲喂动物时，能够短时间在肠道内生长繁殖，维持肠道内微生态系统的稳衡^[43]。

研究表明，在纤维素酶系中作用于底物的最适pH大多在4.0～5.5之间^[47]，虽然酶促反应pH较为集中，但又不统一，这可能与菌株来源等因素有关。本试验筛选出的Bacillus subtilis BY-2所产CMCase的最适反应pH为5.5，与Mawadza等^[23]所报道的芽孢杆菌的试验结果基本一致，但低于Kim等^[36]、刘海艳等^[24]、Lee等^[48]所报道的芽孢杆菌的试验结果，而高于Rawat等^[49]、Rastogi等^[50]所报道的芽孢杆菌的试验结果。此外，Bacillus subtilis BY-2所产CMCase在宽pH范围内具有较强的稳定性，这也是芽孢杆菌属细菌所产CMCase的共同特点^[23]。

Bacillus subtilis BY-2产CMCase的最适反应温度为65 ℃，且在65~70 ℃范围内CMCase的比活力几乎维持在同一个水平，与Mawadza等^[23]所报道的芽孢杆菌的试验基本一致，高于Lee等^[48]和Kim等^[36]、Rawat等^[49]所报道的芽孢杆菌的试验结果，而低于Rastogi等^[50]所报道的芽孢杆菌的试验结果。

Bacillus subtilis BY-2所产CMCase在最适反应pH和最适反应温度条件下，随着反应时间的延长，其比活力逐渐降低，30 min后曲线逐渐呈现水平状态。该试验结果与姜心等^[51]的试验结果基本一致。这可能是因为随着反应的进行，底物浓度降低，产物浓度增加，逆反应从无到有，逐渐变得显著；同时，酸、热等因素也慢慢地使酶丧失部分活性。此外，酶反应的时间也与反应温度有关，反应时间延长，反应温度降低，反之则升高^[52]。