2. 吉林大学动物医学学院, 长春 130062
, WU Jinjie1, WANG Xichun1, FENG Shibin1, DING Hongyan1, LIU Guowen2, LI Xinwei2, LI Xiaobing2, WANG Zhe2, LI Yu1
2. College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China
奶牛酮病是围产期奶牛常见的营养代谢性疾病，多见于泌乳初期能量负平衡的奶牛[1, 2]，常引起食欲不振、精神沉郁等症状，严重的可引起神经功能紊乱，常诱发脂肪肝、皱胃变位、胎衣不下和生产瘫痪等代谢性疾病[3]，给奶牛业带来巨大的经济损失。当奶牛发生能量负平衡时，脂肪大量动员，导致肝脏脂代谢紊乱[1, 4]。当机体发生氧化应激、低血糖等代谢紊乱时，腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)被磷酸化激活，蛋白质、脂肪和糖原合成代谢通路受到抑制，葡萄糖转运、脂肪酸氧化及糖酵解等代谢通路得到增强[5, 6]。
1 AMPK信号转导通路肝脏是动物机体脂代谢的枢纽，肝脏脂代谢紊乱是造成酮病、脂肪肝和胰岛素(insulin,INS)抵抗等能量代谢性疾病的重要原因之一[7]。AMPK是一个进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由催化亚基α、调节亚基β和γ组成，参与细胞中的多条代谢通路来适应能量的变化，在调节细胞和机体能量稳态上有重要作用，被认为是细胞的能量感受器[8]。它广泛存在于骨骼肌、肝脏、胰腺和脂肪组织中，可通过对靶蛋白的磷酸化调节代谢通路，影响脂代谢[9]。AMPK在肝脏脂代谢中起着核心作用[9]。对大鼠的研究表明，AMPK活化后，导致大鼠体内β-羟-β-甲基戊二酰辅酶A(β-hydroxy-β-methyl glutaryl coenzyme A,HMG-CoA)合成酶、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)和甘油-3-磷酸酰基转移酶活性降低甚至丧失，从而抑制胆固醇、脂肪酸和甘油三酯(triglyceride,TG)的合成，提高脂肪酸的氧化速度[10]。AMPK通过甾醇调节元件结合蛋白Ⅰc(sterol regulatory element-binding protein-Ⅰc,SREBP-Ⅰc)、磷酸化碳水化合物应答元件结合蛋白(carbohydrate responsive element-binding protein,ChREBP)和过氧化物酶体增殖激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)α参与脂代谢的调节[5, 11, 12]。SREBP-Ⅰc是一种主要高表达于肝脏的转录因子，通过调控脂肪酸、TG合成和转运相关酶的表达来促进脂合成和转运作用[5]。肝脏高表达SREBP-Ⅰc基因的小鼠，可导致TG的聚集，且脂肪酸的合成速率和相关酶类表达升高[5]。ChREBP同样是调控肝脏脂代谢的主要转录因子，与SREBP-Ⅰc相互协作，共同完成肝脏的脂代谢调节[13]。在正常饮食情况下，ChREBP基因敲除小鼠的肝脏中，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)-柠檬酸裂解酶、ACCⅠ和脂肪酸合成酶的mRNA水平较对照组小鼠均显著下降，最终导致其肝脏脂肪酸合成减少[13]。PPARα是PPAR的一种亚型，主要高表达于具有丰富线粒体和β氧化活性的组织，如肝、心脏[11]。动物研究表明，PPARα能与配体结合而活化，从而增强与脂质代谢有关的酶和基因的转录，如肉碱脂酰基转移酶Ⅰ、肉碱脂酰基转移酶Ⅱ、酰基辅酶A氧化酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶，使肝脏氧化脂肪酸能力加强[11]。
2 胰高血糖素(glucagon,GLN)与奶牛酮病及AMPK信号转导通路 2.1 GLN与奶牛酮病当发生酮病时，奶牛参与能量调节的内分泌激素发生显著变化，主要是INS和GLN[7]。酮病奶牛血液中INS含量降低，GLN的含量显著升高[7]。其中，GLN是由胰岛α细胞分泌的一种多肽激素，由29个氨基酸残基组成，主要作用于肝脏，促进肝糖原分解，抑制肝糖原合成，促进葡萄糖异生、分解和脂肪分解[12]。因此，GLN对于反刍动物的能量代谢至关重要。近年来对GLN在脂代谢方面的研究逐年增加。Bobe等[14]研究表明，中度脂肪肝奶牛产犊后2~3周注射GLN(15 mg/d)，可以缓解由脂肪肝导致的体温升高，以及减低患乳房炎的风险。他们还指出，环境低于35 ℃时，皮下注射GLN，效果更明显，且无副作用。
2.2 GLN与AMPK信号转导通路GLN和环腺苷酸(cAMP)的增加可导致HMG-CoA还原酶以及ACC的失活，而这2种酶正是AMPK的作用靶点[15, 16]。使用GLN刺激鼠的肝细胞，可以导致ACC磷酸化而失活，最初的研究认为这是由cAMP依赖蛋白激酶直接抑制所致，而进一步的研究却发现这是AMPK的作用结果[16]。因此，增加GLN的含量或者由条件改变引起GLN的增加，均可导致肝脏AMPK的活化[17]。GLN与AMPK信号转导通路相互关系如图 1所示。
 | 图1 GLN和INS与AMPK信号转导通路调控的相互关系 Fig. 1 The correlation between GLN and INS,and AMPK signal transduction pathways |
为了更清楚地了解GLN的生理作用，必须要知道GLN由胰腺分泌到门静脉，而门静脉是肝脏最主要的供血血管[18]。这是GLN对肝脏起作用的有效通道，但也是试验困难的所在。因为，大部分的GLN在肝脏被利用，检测系统血液并不能反映门静脉血液中GLN的含量[18]。GLN增加肝脏葡萄糖的输出、脂肪酸氧化和氨基酸代谢以及尿素生成[7]。近期研究表明，体内GLN的升高可以增加单磷酸腺苷(AMP)/ATP，同时活化AMPK，而且，饥饿和锻炼时，GLN受体信号是AMPK活化必不可少的[19]。
在氧气吸收和脂肪氧化增加时，GLN增加，AMPK活化[20]。三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)和糖异生的关系与ATP生成、消耗的关系是相对应的。TCA和糖异生的增加会引起肝脏ATP的消耗，这与锻炼和饥饿时引起AMP/ATP的增加是相似的[21]。活化脂肪酸的氧化和氨基酸的糖异生也需要消耗ATP。研究表明，氨基酸和脂肪酸糖异生，每生产1 mol葡萄糖分别消耗6和4 mol的ATP;乳酸、丙氨酸、丙酮酸以及油酸转移入TCA，AMP也会增加[22]。也就是说，GLN信号可通过增加肝脏AMP含量，进而活化AMPK。
AMP的增加可以使AMPK磷酸化增加，被认为是肝激酶BⅠ(liver kinase BⅠ,LKBⅠ)作用的结果[23]。GLN也可以增加细胞质内钙离子(Ca2+)的含量，从而活化钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶α/β，最终使AMPK磷酸化[24]。Berglund等[21]研究表明，野生型小鼠在饥饿处理18 h或运动到精疲力竭时，分别可以导致AMP/ATP增加5和10倍，而在GLN受体缺陷的小鼠模型中，则不会出现上述变化。同时，使用高胰高血糖素-正葡萄糖钳夹技术，可以提高循环血中GLN却不会造成高血糖和高INS血症。
饥饿时，肝脏AMPK活化，使ACC失活，这一现象在肝脏呈带状分布[25]。门静脉附近组织的糖异生、尿素生成和β-氧化以及酮体生成能力较强，这种现象同激素与肝脏底物的含量相对应[26]。饥饿的情况下，AMPK活化主要集中在门静脉附近，这与GLN在门静脉附近浓度较高一致[27]。长时间剧烈运动也会导致ACC的失活，降低丙二酰辅酶A含量，增加β-羟基丁酸(beta-hydroxybutyrate,BHBA)的含量，并活化AMPK[28]。GLN介导的AMPK活化可快速抑制肝脏脂肪的从头合成并促进脂肪酸的氧化，通过抑制ACC调节丙二酰辅酶A的能力，减少脂肪生成碳底物，并消除对肉碱棕榈酰转移酶-Ⅰ(carnitine palmitoyl transterase-Ⅰ,CPTⅠ)的抑制作用[29]。相同地，GLN抑制SREBP-Ⅰc的表达，SREBP-Ⅰ是肝脏脂肪生成的控制器[30]。Li等[5]的研究表明，AMPK磷酸化可以降低SREBP-Ⅰc的活性，缺乏AMPKβⅠ的肝细胞TG合成能力提升，脂肪酸氧化能力减弱。因此可以推断GLN通过AMPK抑制了SREBP-Ⅰc的活性。
通过对肝脏AMPKαⅡ缺乏或过表达小鼠的研究表明，AMPK活化抑制脂肪生成，促进脂肪氧化[31]。对肝脏缺乏AMPKαⅡ的小鼠进行5 h的饥饿处理，可导致其血浆游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)、TG的升高和BHBA减少。GLN受体基因敲除小鼠模型在饥饿处理16 h后，其血脂状态与上述AMPKαⅡ缺乏小鼠相似，TG和FFAs升高[32]。相反地，腺病毒介导的肝脏AMPKαⅡ过表达，可降低血浆TG含量，增加BHBA含量[31]。
长时间自主和强迫运动，可导致GLN作用增强，AMPK活化，这与改善高脂饮食造成小鼠脂肪肝相一致[19]。剧烈和长时间运动可以使肝脏AMP/ATP升高，AMPK活化，这依赖GLN受体信号以及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的含量[21]。AMP/ATP的提高、AMPK活化以及PPARα和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor XXI,FGFXXI)的转录和翻译伴随着脂肪肝的改善[19]。在脂肪细胞中，FGFXXI可增加AMPK活化、烟酰腺嘌呤二核苷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧气消耗；在线粒体中，FGFXXI发挥作用则主要依赖过氧化物酶体增生物激活受体辅助活化因子Ⅰα、LKBⅠ、AMPK和沉默信息调节因子[33]。在肝脏中，FGFXXI介导GLN发挥着长期的作用。完整的GLN-AMPK信号网络对肝脏疾病的恢复可能是至关重要的。因此可以推测，奶牛酮病肝脂代谢紊乱可能与高GLN状态引起的肝脏AMPK信号通路变化有关。
3 INS与奶牛酮病及AMPK信号转导通路当奶牛发生酮病时，另一能量代谢激素INS水平降低[13]。INS是由胰岛β细胞分泌的一种蛋白质激素，是机体内唯一降低血糖的激素，主要作用于肝脏，可促进糖原、脂肪和蛋白质合成。
INS和AMPK信号通路通过在关键信号位点进行重叠，来共同维持器官的稳态[34]。在很多病理状态下，可以检测到INS和AMPK信号通路的失衡，例如糖尿病、肥胖、营养缺乏[5]。已有研究证明，INS可降低肝脏AMPK的活性。经INS前期处理，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/蛋白激酶B可以使AMPKαⅠ第485位丝氨酸(Ser485)和AMPKαⅡ第491位丝氨酸(Ser491)磷酸化，而AMPKα第172位苏氨酸(Thr172)磷酸化减少[35]。前面提到，AMPK可抑制脂肪合成，促进脂肪氧化，可通过增加cAMP，GLN和肾上腺素来活化AMPK，从而迅速使ACC失活。与此相反，INS降低AMPK的活性，同时增加ACC的活性[36]。INS介导的ACC活化的具体机制仍未明确，可能是共价以及变构修饰的结果[37]。
GLN和AMPK共同降低SREBP-Ⅰc的表达与活化，GLN间歇地刺激活化AMPK，例如，定期的运动能调节氧化应激、肝脏抗脂肪生成区域，活化PPARα，抑制雷帕霉素靶蛋白复合物Ⅰ和SREBP-Ⅰc[30]。相反，INS增强SREBP-Ⅰc的编码和转录以及靶基因的表达[38]。机体在正常或者存在INS抵抗的状况下，INS通过对SREBP-Ⅰc的控制，介导肝脏中脂肪的合成[39]。AMPK对机体的调节并不是单一的，而是与许多代谢通路和调节信号组成的复杂网络而发挥作用。GLN和INS与AMPK信号转导通路调控的相互关系如图 1所示。
4 奶牛酮病与AMPK信号转导通路奶牛酮病的特点是高非酯化脂肪酸、高BHBA和低血糖，存在能量负平衡，体内代谢紊乱。而AMPK信号转导通路在调节糖酵解、葡萄糖转换、脂类代谢过程中发挥着重要的作用。已有研究通过培养牛肝细胞，添加BHBA和AMPK抑制剂(Compound C,Cpd C)来检测BHBA在AMPK信号转导通路中发挥的作用。结果表明，当BHBA含量达到1.2 mmol/L时，AMPK信号通路被激活，SREBP-Ⅰc及其目的基因的表达下降。没有添加Cpd C组中，PPARα、ChREBP及其目的基因的表达显著升高。这说明BHBA可以激活AMPK信号转导通路，调控AMPK脂代谢相关基 因[40]。Mahmoudi等[41]研究表明，通过调控AMPKγⅠ 3′非编码区基因的突变，血清中BHBA含量明显升高，说明AMPKγⅠ基因在酮体生成过程中发挥着重要的作用。
5 小结与展望
奶牛酮病的发生，是一个十分复杂的过程，尽管在过去的一段时间内，有关奶牛酮病的研究报道已经很多，但主要集中在奶牛酮病的防治上，其发生的分子机制目前为止还不清楚。近年来，AMPK信号通路已经逐渐成为生命科学研究的热点。但是，多数有关这方面的报道主要集中在小鼠和人，有关反刍动物，尤其是奶牛，这方面文献报道的资料还知之甚少。因此，研究奶牛酮病发生过程中，GLN和INS如何调控AMPK信号转导通路中关键酶、基因，非编码RNA的表达，将具有十分重要的意义。
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