自抗生素被广泛应用于养殖业以来，其对维持畜禽健康、提高生产性能方面发挥了巨大作用。然而随着抗生素在养殖业中大量使用，抗生素所产生的副作用越来越受到生产者和消费者的关注。迫切需要一种既有效又环保的新方法或新产品来控制畜禽疾病，改善畜禽产品品质。防御素为参与机体最初防御活动的小分子多肽，是一类极为重要的内源性抗菌肽^{[1, 2, 3, 4]}，其主要分子特征为含有由6个半胱氨酸残基组成的3个二硫键。大量研究表明，禽β-防御素(avian β-defensins，AvBD)具有广谱抗菌活性，且无论是重组表达、天然存在或是人工合成的，均对细菌、真菌、螺旋体、囊膜病毒(如艾滋病)等具有很强的杀伤活性^{[1, 2, 5, 6, 7]}，在机体的先天性免疫及获得性免疫中发挥重要作用。然而，天然抗菌肽分子量小，在机体内含量极少，分离提纯困难，故天然产量非常有限。化学合成难以实现其分子结构的正确构象，因此，利用基因工程技术生产防御素具有现实意义^[8]。目前，已从鹅体内分离出AvBD1~AvBD7、AvBD9、AvBD10、AvBD12和AvBD16共11种防御素^{[9, 10, 11]}。其中，鹅AvBD7包括完整的开放阅读框(ORF)，它的cDNA由201个碱基组成，编码66个氨基酸。本研究在前期研究的基础上，采用组氨酸(His)标签蛋白原核表达系统，将鹅AvBD7基因亚克隆到pProEX HTa上，构建重组表达质粒，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，实现鹅AvBD7重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。并在体外测定鹅AvBD7重组蛋白的抗菌活性及理化活性，为进一步开展鹅防御素的研究与应用提供理论依据。

重组质粒pMD18-T-AvBD7^[9]、pMD18-T-Simple Vector、表达载体pProEX HTa及表达菌株大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 9193、金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus)ATCC 29213、四联球菌(Micrococcus tetragenus)ATCC 2835、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)C79-11-S11、大肠杆菌BL21均由本实验室保存。

ExTaq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4 DNA连接酶、Marker、IPTG购自日本TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司；蛋白纯化复性试剂盒购自Novagen公司；所使用的试剂均为分析纯。

根据pProEX HTa和重组质粒pMD18-T-AvBD7酶切位点设计1对鹅AvBD7特异性表达引物P1: 5′ GAATTCATGCAGCACGTCTTCCCTAG 3′，P2: 5′ CTCGAGTCAGTGCCTCCACCCCCTC 3′。其中P1的5′端含有EcoRⅠ酶切位点，P2的5′端含有XhoⅠ酶切位点，以重组质粒pMD18-T-AvBD7为模板，用表达引物进行PCR扩增。PCR扩增体系(25 μL)：Premix Taq^TM(Ex Taq^TM Version 2.0 plus dye)12.5 μL，重组质粒pMD18-T-AvBD7 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，用灭菌双蒸水补足25 μL。PCR扩增程序如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s为一个循环，进行25个循环；72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保温10 min。

将扩增产物用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆到原核表达载体pProEX HTa上，构建重组表达质粒pProEX-AvBD7，利用质粒PCR和双酶切方法筛选阳性克隆。PCR扩增体系(25 μL)：Premix Taq^TM(Ex Taq^TM Version 2.0 plus dye)12.5 μL，重组表达质粒pProEX-AvBD7 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，用灭菌双蒸水补足25 μL。PCR扩增程序同前。酶切体系(10 μL)：重组表达质粒pProEX-AvBD7 3 μL，ddH₂O 5 μL，EcoRⅠ 0.5 μL，XhoⅠ 0.5 μL，10×H Buffer 1 μL，37 ℃水浴中反应2 h进行双酶切鉴定。将阳性质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

将重组表达质粒pProEX-AvBD7转化到表达感受态细胞大肠杆菌Rosetta中，挑取单个菌落在含有氨苄的LB液体培养基中37 ℃振荡培养，待吸光度(OD)_{600 nm}值达到0.6~0.8时，留取1 mL菌液作为对照，将终浓度为0.6 mmol/L的IPTG加到剩余菌液中，进行蛋白的诱导表达，分别在诱导2、4、6 h各留取1 mL菌样。按照Novagen公司的蛋白纯化复性试剂盒说明书进行包涵体的纯化、复性和透析，并测定重组蛋白浓度。留取1 mL超声波破碎离心的上清液和少量沉淀，将沉淀用100 μL磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.4)重新悬起。将诱导前对照菌样、诱导后菌样、上清液、沉淀样和纯化后的蛋白进行N-三(羟甲基)甲基甘氨酸十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)分析，用薄层扫描仪观察结果。

采取菌落计数法测定重组鹅AvBD7蛋白的抗菌活性。将纯化后的重组鹅AvBD7蛋白与His标签蛋白，用pH 7.4的无菌PBS稀释，使其终浓度分别为50、100、250、500 μg/mL，各取250 μL加入无菌管中。将1.1.1所述各株细菌培养至对数生长期，然后用相应的液体培养基将细菌稀释到2×10⁶ CFU/mL，分别向各管中加入10 μL稀释后的细菌培养物，设PBS为阴性对照，每组设置3个平行。37 ℃振荡孵育4 h后，每个稀释度各取100 μL接种在相应的LB平板上，37 ℃培养过夜，观察并记录每个营养琼脂平板上的菌落数量。3个相同稀释度的营养平板的菌落数平均值作为该稀释度样品的菌落数。按接种量和稀释倍数计算每管原液中的细菌量，绘制细菌存活率和重组蛋白浓度关系图。

选取大肠杆菌(革兰氏阴性菌，G^-)和四联球菌(革兰氏阳性菌，G⁺)为检测菌，用PBS调整氯化钠(NaCl)浓度，使其浓度分别为0、50、100、150 mmol/L。然后将重组蛋白分别用上述不同浓度的NaCl溶液稀释至终浓度为250 μg/mL，各取250 μL分别加入无菌离心管中，同时设相应NaCl浓度的溶液为阴性对照，分别向各管加入细菌培养物10 μL，每组设3个平行，37 ℃振荡孵育4 h，具体操作方法同1.2.3。

新采集的抗凝无特定病原(SPF)鸡血红细胞用无菌PBS(pH 7.4)清洗并稀释为2%~3%；重组鹅AvBD7融合蛋白用PBS稀释为100、250、500 μg/mL。取20 μL蛋白分别加入无菌离心管中，0.2% Triton X-100作为阳性对照，PBS作为阴性对照。分别向每管加入180 μL稀释的红细胞。每组设3个平行对照，37 ℃孵育1 h，1 000 r/min离心10 min后取上清，用微量紫外分光光度计测OD_{560 nm}值。每个样品做3个重复，取平均值。

数据采用SPSS 18.0软件进行方差分析，所有数据均以平均值±标准误表示。

以重组质粒pMD18-T-AvBD7为模板进行PCR扩增，构建表达用重组质粒pMD18-T-S-AvBD7。将表达用重组质粒及表达载体pProEX HTa分别进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，将其转化到大肠杆菌Rosetta感受态中，构建重组表达质粒并进行双酶切和PCR鉴定及测序。电泳结果表明，酶切产物大小与质粒PCR扩增得到的条带大小一致(157 bp)，如图 1所示。重组质粒测序结果表明将编码鹅AvBD7成熟蛋白基因成功插入原核表达载体的目的位点。Tricine-SDS-PAGE结果显示，诱导后与诱导前的菌体蛋白相比，有1条明显的蛋白条带，大小为10~15 ku且诱导2、4、6 h的蛋白表达量随时间增加而变大。将诱导后的菌液经超声波破碎后，分别取上清和沉淀Tricine-SDS-PAGE分析，可见大部分重组蛋白在沉淀中，表明重组蛋白于大肠杆菌中以包涵体的形式存在。采用Novagen蛋白质纯化复性试剂盒对重组蛋白进行纯化。对纯化后的蛋白进行Tricine-SDS-PAGE分析，观察结果显示可见10~15 ku大小的蛋白带，与预期蛋白相符，如图 2所示。获得的重组鹅AvBD7融合蛋白采用微量紫外分光光度仪测得的浓度为2 200 μg/mL。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

C:质粒pProEX HTa-AvBD7 PCR产物;D:质粒pPro- EX HTa-AvBD7双酶切产物;M:100 bp ladder DNA marker。 C:plasmid pProEX HTa-AvBD7 PCR product;D: product of plasmid pProEX HTa-AvBD7 restriction enzyme digestion;M:100 bp ladder DNA marker.图1 重组质粒pProEX-AvBD7的 双酶切及PCR产物的鉴定 Fig. 1Identification of pProEX-AvBD7 recombinant plasmid digested and PCR product

图 2(Figure 2)

Fig. 2

1:上清:2:包涵体:3:无IPTG诱导:4~6:IPTG诱导2、4、6 h后融合蛋白表达;7:纯化蛋白;M:蛋白质Marker (ku)。 1:supernatant;2:inclusion body;3:without IPTG induction;4 to 6:fusion protein expression on 2,4 and 6 h after induc- tion with IPTG;7:purified protein;M:protein marker (ku).图2 重组鹅AvBD7蛋白的表达与纯化 Fig. 2 Expression and purification of recombinant goose AvBD7 protein

采用菌落计数法测定重组鹅AvBD7蛋白对5种菌的抗菌活性。由图 3可知，与对照相比，重组鹅AvBD7蛋白对所测定的细菌具有显著抑菌作用(P<0.05)。且随着蛋白浓度的增加，抗菌活性增加。重组鹅AvBD7蛋白对四联球菌的抗菌活性最强，在蛋白浓度为50~500 μg/mL时都有极显著作用(P<0.01)。对金黄色葡萄球菌抗菌活性较强，在蛋白浓度为100~500 μg/mL时具有显著或极显著的抗菌作用(P<0.05或P<0.01)，对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌和枯草芽孢杆菌抗菌活性较低，只有在蛋白浓度为250~500 μg/mL时，才有显著或极显著抗菌作用(P<0.05或P<0.01)。

图 3(Figure 3)

Fig. 3

*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。下图同。 * mean significant difference (P<0.05),** mean extremely significant difference (P<0.01).The same as below.图3 重组鹅AvBD7蛋白和His标签蛋白的抗菌活性 Fig. 3 Antimicrobial activity of recombinant goose AvBD7 protein and His tag protein

采用菌落计数法测定重组鹅AvBD7蛋白在不同盐离子浓度下的抗菌活性。由图 4可知，无论是以革兰氏阳性菌(四链球菌)还是革兰氏阴性菌(大肠杆菌)为检测菌，当重组鹅AvBD7蛋白浓度为250 μg/mL时，随着盐离子浓度的升高，细菌存活率上升，即抗菌活性下降。当盐浓度达到100 mmol/L时，重组鹅AvBD7蛋白对大肠杆菌的抗菌活性与对照(盐浓度为0 mmol/L)相比显著下降(P<0.05)，当盐浓度达到150 mmol/L时，重组鹅AvBD7蛋白对四联球菌的抗菌活性与对照(盐浓度为0 mmol/L)相比显著下降(P<0.05)。

图 4(Figure 4)

Fig. 4

图4 NaCl浓度对重组鹅AvBD7蛋白抗菌活性的影响 Fig. 4Effects of NaCl concentration on the antimicrobial activity of recombinant goose AVBD7 protein

本试验以不同浓度的重组鹅AvBD7蛋白作为检测对象，结果如图 5所示。不同浓度(100、250、500 μg/mL)的重组鹅AvBD7蛋白对鸡血红细胞的溶血活性极低，与PBS阴性对照相比，差异不显著(P>0.05)，表明该重组蛋白不具有溶血活性。

图 5(Figure 5)

Fig. 5

图5 重组鹅AvBD7蛋白的溶血活性 Fig. 5Hemolysis activity of recombinant goose AvBD7 protein

在过去的20多年中，有关鸡、鸭、火鸡、企鹅和驼鸟等AvBD的研究有了突破性进展。但是，对鹅抗菌肽的报道相对较少。大量研究表明，禽防御素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抗菌活性，在体外，对真菌同样有杀伤作用^{[12, 13]}。然而天然抗菌肽在机体内含量极少，分离提纯困难，化学合成难以实现其分子结构的正确构象，所以通过基因工程技术获得防御素。由于抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，对宿主大肠杆菌有很强的杀伤力，不能在大肠杆菌中直接表达，以融合蛋白形式表达可解决问题。

目前为止，谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合表达与His融合表达系统是原核表达最常用的2种表达系统。至今，已经有很多防御素通过GST融合表达系统大量表达，并且获得良好效果^{[6, 7, 10, 14, 15, 16, 17]}。但是由于GST的分子量相对于防御素很大，对其活性会产生影响，因此本试验采用His融合表达系统表达重组鹅AvBD7蛋白。经Tricine-SDS-PAGE分析，大部分蛋白存在于包涵体中，由于目的蛋白形成包涵体后不具有生物活性，进一步用Novagen公司的Protein Refolding Kit试剂盒对包涵体进行复性，最后得到具有活性的重组蛋白。经抗菌活性测定，该重组蛋白对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、四联球菌、枯草芽孢杆菌均有显著抑菌作用，本研究结果与前人研究结果一致^{[1, 18, 19]}，表明禽AvBDs具有广谱抗菌活性。另有研究表明，不同种类防御素的抑菌种类有所不同。例如，鸡AvBD1与AvBD2对白色念球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌等有抑制作用，而重组鸡AvBD6对沙门氏菌的抗菌活性则较弱^{[20, 21]}；企鹅AvBD103a和AvBD103b则对枯草芽胞杆菌、烟曲霉菌和白色葡萄球菌有抑制作用^[22]；鸭AvBD10对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌等有抑制作用^[23]。为探究His标签对重组蛋白抗菌活性的影响，李妍妍^[24]测定了His标签蛋白对本试验所用5种菌的抗菌活性，结果表明，His标签蛋白不具有抗菌活性，说明该重组蛋白抗菌活性不受His标签蛋白的影响。本研究进一步证实其结果。多种抗菌活性研究表明,AvBDs在高盐条件下即失去抗菌活性^[25]，这与前人报道一致^{[26, 27, 28, 29, 30]}。本研究结果显示，高浓度盐离子(150 mmol/L)显著抑制重组鹅AvBD7蛋白对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌活性。不仅是NaCl浓度对蛋白活性有影响，其他离子浓度或者没有特定的离子也会对蛋白的抗菌活性产生影响^[31]。这可能是因为高浓度离子破坏细菌外膜的阴离子和抗菌肽正电荷的相互作用而影响防御素的抗菌活性^[26]。为了更深一步研究鹅防御素的性质，我们对该重组蛋白进行溶血活性的试验，表明即使在最高浓度(500 μg/mL)时溶血活性仍然非常低，这与禽源防御素和人源防御素溶血活性结果相一致^{[27, 28]}。上述表明，至今未发现防御素对动物细胞具有毒性。可能是由于动物细胞表面存在较高水平的胆固醇以及缺少带负电荷的磷脂，使其抑制了抗菌肽与之发生作用^{[32, 33]}。以上研究结果为日后AvBDs重组蛋白作为一种高效的肽类抗生素和禽类饲料添加剂等应用的可能性提供了理论基础。

本研究应用原核表达载体pProEX HTa成功表达了重组鹅AvBD7蛋白，其大小在10~15 ku，且表达的重组蛋白以包涵体的形式存在。该重组蛋白对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球、四联球菌、鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌均有抗菌活性。在150 mmol/L高浓度盐离子下，重组蛋白对大肠杆菌和四联球菌的抗菌活性显著降低。此外，该重组蛋白对鸡红细胞的溶血活性极低。