动物机体氧化是疾病和生产性能异常的重要内源性致因。近年来，如何摒弃药物治疗保障动物的传统行为，从可持续发展角度的源性控制来达到健康养殖目标，是业界同仁共同关注的重大课题，其中动物抗氧化剂的研发与应用是该课题的重要选择途径之一。动物专用抗氧化剂研发与应用一般分为2类：一类是人工合成的抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)、二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、没食子酸丙酯(propyl gallate,PG)、特丁基对苯二酚(tert-butyl hydroquinone,TBHQ)等，价廉易得，抗氧化效果良好，但均有一定的潜在毒副作用，长期使用危害动物健康^[1]。这种“应急式”的非可持续使用的特点与动物机体内氧化的持续性特征不能有效对接，很难从根本上解决机体氧化的危害问题。另一类是发掘新型的、无毒副作用、可持续使用的天然植物抗氧化剂，该类型的研究越来越多^{[2, 3]}。

本试验选用的葡萄原花青素(grape procyanidins,GPC)是一种植物多酚，存在于葡萄皮、籽中，是由儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸等聚合成不同聚合度的物质^[4]。体外研究表明，GPC具有较强的抗超氧阴离子和清除自由基的功效^[5]，其清除自由基的能力优于维生素C、维生素E和β-胡萝卜素^[6]。饲喂或食用GPC，可显著提高大鼠血浆总抗氧化能力(T-AOC)^[7]，显著降低小鼠血清中丙二醛(MDA)含量和提高总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性^[8]，显著提高人血液T-SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性并降低血液MDA含量^[9]。GPC还可用做肉鸡的抗氧化剂^[10]和免疫调节剂^[11]；还能显著降低鸡蛋蛋黄胆固醇含量^[12]。

现代蛋鸡是一种高产、机体代谢十分旺盛、利用周期相对较短的动物。在经过高负荷、高强度代谢的产蛋高峰期以后，蛋鸡体内代谢和生理功能逐渐退化，特别是机体自身抗氧化功能的弱化，会导致其抗病力降低，一方面产生诸多损害健康的代谢疾病，另一方面诱发和感染危害严重的疫病。生产实践证明，降低这种风险的实际操作措施是从保障蛋鸡抗氧化功能的源头入手，通过延缓蛋鸡生产性能下降等指标来实现。因为蛋鸡不健康的最敏感指标是产蛋性能的变化。GPC的已有研究主要集中在动物体外、小鼠和不同于产蛋后期蛋鸡生理功能的肉鸡上，在蛋鸡上的研究较少。因此，本试验用人工合成抗氧化剂TBHQ作为参照，研究饲粮添加50和100 mg/kg GPC对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质和抗氧化能力的影响，以期为产蛋后期蛋鸡健康和鸡蛋品质改善的蛋鸡用天然抗氧化饲料添加剂提供依据。

GPC由天津市尖峰天然产物研究开发有限公司提供，原花青素含量99.47%，其中寡聚原花青素65.19%，原花青素单体9.88%，多聚原花青素24.93%；TBHQ由盐城捷阳精细化工提供，纯度为99%。

选取产蛋率、体重相近，健康状态良好的64周龄罗曼蛋鸡288只，随机分为4组，每组6个重复，每个重复12只鸡。对照(CON)组饲喂基础饲粮；GPC50组和GPC100组：分别在基础饲粮中添加50和100 mg/kg的GPC；TBHQ组：基础饲粮+200 mg/kg TBHQ。预试期7 d，正试期56 d。

参照NRC(2004)和我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)，结合《罗曼蛋鸡饲养手册》配制玉米-豆粕型粉状基础饲粮，饲粮组成及营养水平见表 1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 63.00 豆粕 Soybean meal 25.28 大豆油 Soybean oil 0.50 石粉 Limestone 9.45 磷酸氢钙 CaHPO4 1.00 食盐 NaCl 0.30 蛋氨酸 Met 0.10 植酸酶 Phytase 0.05 预混料 Premix1) 0.32 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 代谢能 ME/(MJ/kg) 11.18 粗蛋白质 CP 16.00 钙 Ca 3.61 总磷 TP 0.49 有效磷 AP 0.28 赖氨酸 Lys 0.82 蛋氨酸 Met 0.35 1)预混料为每千克饲粮提供Premix provided the following per kg of the diet: VA 12 500 IU,VD 34 125 IU,VE 15 IU，VK 2 mg，硫胺素 thiamine 1 mg，核黄素 riboflavin 8.5 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 50 mg，烟酸 niacin 32.5 mg，吡哆醇 pyridoxine 8 mg，生物素 biotin 2 mg，叶酸 folic acid 5 mg，VB 125 mg，胆碱 choline 500 mg，Mn 65 mg，I 1 mg，Fe 60 mg，Cu 8 mg，Zn 66 mg，Se 0.3 mg。 2)代谢能为计算值，其余为实测值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

有窗鸡舍3层阶梯式笼养，每窝位3只鸡，每层鸡笼各组鸡数量相等，自然光照加人工光照使光照时间达到16 h/d，试验期鸡舍温度平均20.5 ℃，相对湿度45%～65%，采用负压通风的纵向通风。每天喂料3次(08:00、11:30和16:00)，捡蛋、清粪各1次，每7天消毒1次，自由采食和饮水，其他为常规饲养管理。

观察每组鸡的健康状况。试验期以重复为单位，记录每天饲喂量、产蛋数和蛋重，每7天结算统计饲料消耗量。分别在试期第28天、第56天末计算每重复产蛋率(LR)、平均蛋重(AEW)、平均日采食量(ADFI)和料蛋比(F/E)。

试验期的第28天、第42天和第56天每个重复随机选取5枚鸡蛋，采用日本富士坪公司生产的蛋形指数测定仪测定蛋形指数，采用SONOVA蛋品质自动分析仪(Egg Analyzer^TM,Orka Technology Ltd.)测定鸡蛋蛋白高度、哈夫单位和蛋黄颜色；蛋壳强度分析仪(Egg Force Reader,Orka Technology Ltd.)测定蛋壳强度；蛋壳厚度测定仪(Egg Shell Thickness Gauge,Orka Technology Ltd.)测定蛋壳厚度。

试验结束时，以重复为单位称重，随机选取与重复内标准体重差异不显著的3只鸡，翅静脉采血，肝素钠抗凝，3 600 r/min离心10 min，制备血浆，-20 ℃保存，待测血浆抗氧化指标。

屠宰采血后每只鸡摘取左侧肝脏，锡箔纸包裹，液氮速冻，-80 ℃保存；组织匀浆的制备：取-80 ℃保存的肝脏样品5 g，加9倍的生理盐水，匀浆，制备10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液，分装待测肝脏的抗氧化指标(整个匀浆操作在刨冰中进行)。

试验第56天每重复随机取3枚鸡蛋，测蛋黄抗氧化及胆固醇指标。

血浆、肝脏和蛋黄MDA含量、T-SOD活性，血浆、肝脏T-AOC，血浆GSH-Px活性及蛋黄胆固醇含量均用试剂盒测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

试验数据以“平均值±标准差”表示。所有数据用Excel 2003处理后，采用SPSS 16.0的one-way ANOVA程序进行方差分析，当P＜0.05时，用Duncan氏法进行多重比较，做显著性判断。

由表 2可知，GPC组与对照组和TBHQ组相比，蛋鸡平均蛋重、平均日采食量和料蛋比均无显著差异(P>0.05)。试验1～4周GPC50组产蛋率有高于其他3组的趋势(P>0.05)，试验5～8周GPC50组产蛋率显著高于对照组和TBHQ组(P<0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。试验期1~8周GPC50组产蛋率显著高于对照组(P<0.05)，其他3组差异不显著(P>0.05)。试验开始时到1～4周和5～8周，各组产蛋率均在降低；试验开始和5～8周相比，产蛋率对照组降低了5.2%，TBHQ组降低了3.3%，GPC50组降低了0.2%，GPC100组降低了2.1%。因此，GPC能够抑制后期蛋鸡产蛋率降低，表现为随着试验期的延长而效果更为明显。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 GPC对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of GPC on production performance of old laying hens 项目 Items 时间 Time/周 组别 Groups P值 P-value CON TBHQ GPC50 GPC100 产蛋率 LR/% 0 77.81±2.08 77.64±1.52 78.37±2.10 77.58±1.31 0.864 1～4 75.19±1.70 76.99±2.06 78.61±2.10 76.42±2.30 0.061 5～8 73.74±1.97b 75.06±2.00b 78.21±2.09a 75.96±2.28ab 0.011 1～8 74.46±1.72b 76.03±2.03ab 78.42±2.10a 76.19±2.29ab 0.026 平均蛋重 AEW/g 1～4 67.30±1.94 68.22±1.94 67.72±1.91 67.83±1.23 0.847 5～8 67.75±1.78 68.61±2.02 68.23±1.84 68.04±1.17 0.856 1～8 67.49±1.83 68.38±1.91 67.94±1.84 67.91±1.17 0.848 平均日采食量 ADFI/g 1～4 135.87±6.06 137.19±2.91 135.49±5.34 132.85±5.33 0.521 5～8 136.50±1.15 139.28±11.66 139.76±5.93 135.74±6.69 0.726 1～8 136.13±3.33 138.08±3.95 137.30±5.12 134.09±4.79 0.434 料蛋比 F/E 1～4 2.70±0.27 2.64±0.31 2.57±0.27 2.59±0.33 0.870 5～8 2.75±0.30 2.77±0.51 2.66±0.33 2.66±0.37 0.938 1～8 2.72±0.27 2.69±0.36 2.61±0.27 2.62±0.34 0.901 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表2 GPC对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of GPC on production performance of old laying hens

由表 3可知，与对照组和TBHQ组相比，试验期GPC组对鸡蛋的蛋白高度、蛋黄颜色、蛋形指数和蛋壳强度无显著影响(P>0.05)，而试验第8周GPC组显著增加了鸡蛋的蛋壳厚度和哈夫单位(P<0.05)。以时间为纵轴，后期鸡蛋哈夫单位在逐渐降低，添加TBHQ和GPC均能缓解其降低；第8周和第4周相比，对照组降低了4.0%，TBHQ组降低了2.8%，GPC50组降低了1.1%，GPC100组降低了1.9%。因此，GPC能够抑制产蛋后期鸡蛋哈夫单位降低，50 mg/kg的添加效果优于100 mg/kg，100 mg/kg优于200 mg/kg的TBHQ。

表3

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表3(Table 3)

表3 GPC对产蛋后期鸡蛋品质的影响 Table 3 Effects of GPC on egg quality of old laying hens 项目 Items 时间 Time/周 组别 Groups P值 P-value CON TBHQ GPC50 GPC100 蛋白高度 AH/mm 4 5.38±0.66 5.51±0.54 5.48±0.45 5.48±0.68 0.981 6 5.33±0.53 5.43±0.20 5.45±0.45 5.44±0.45 0.952 8 5.31±0.15 5.44±0.33 5.44±0.34 5.41±0.55 0.914 蛋黄颜色 YC 4 8.00±0.79 8.00±0.79 8.14±0.48 8.17±0.51 0.953 6 7.44±1.19 8.22±0.83 7.94±0.77 8.22±0.46 0.368 8 7.78±0.54 8.00±0.37 7.47±0.70 7.94±0.49 0.350 哈夫单位 HU 4 69.55±4.31 69.78±4.60 69.93±3.20 69.86±5.29 0.999 6 68.53±2.84 68.95±3.17 69.52±3.57 68.82±4.08 0.974 8 66.77±1.32b 67.86±0.76ab 69.16±1.35a 68.56±1.50a 0.023 蛋壳厚度 ET/mm 4 0.40±0.01 0.39±0.01 0.39±0.02 0.40±0.02 0.721 6 0.38±0.02 0.37±0.02 0.39±0.02 0.39±0.02 0.329 8 0.41±0.01b 0.39±0.02b 0.42±0.01a 0.42±0.01a 0.011 蛋形指数 ESI 4 1.31±0.02 1.34±0.02 1.31±0.05 1.31±0.02 0.351 6 1.31±0.03 1.32±0.03 1.32±0.02 1.32±0.02 0.981 8 1.36±0.03 1.35±0.05 1.34±0.04 1.34±0.02 0.781 蛋壳强度 ES/(N/m2) 4 43.54±3.44 46.02±3.58 47.18±3.9 44.60±3.73 0.358 6 44.80±7.14 43.27±4.11 46.68±4.07 43.87±2.54 0.631 8 44.97±5.32 41.19±4.52 46.24±1.78 45.39±3.06 0.154

表3 GPC对产蛋后期鸡蛋品质的影响 Table 3 Effects of GPC on egg quality of old laying hens

由表 4可知，GPC50组蛋鸡血浆MDA含量显著低于对照组、TBHQ组和GPC100组(P<0.05)，而其他3组之间差异不显著(P>0.05)；GPC50组蛋鸡血浆T-AOC显著高于对照组(P<0.05)，而与TBHQ组和GPC100组差异不显著(P>0.05)；TBHQ组和GPC50组蛋鸡血浆T-SOD活性均显著高于对照组和GPC100组(P<0.05)，且GPC50组提高幅度大于TBHQ组(P<0.05)；蛋鸡血浆GSH-Px活性4组之间差异不显著(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 GPC对蛋鸡血浆抗氧化能力的影响 Table 4 Effects of GPC on plasma antioxidant activity of old laying hens 项目 Items 组别 Groups P值 P-value CON TBHQ GPC50 GPC100 丙二醛 MDA/(nmol/mL) 8.32±2.14a 8.04±1.49a 4.33±1.50b 7.06±1.46a 0.010 总抗氧化能力 T-AOC/(U/mL) 6.84±0.46b 7.31±0.38ab 7.65±0.47a 7.30±0.46ab 0.041 总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mL) 221.71±8.58c 286.94±18.26b 329.77±37.97a 224.37±24.68c <0.010 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mL) 1 739.99±212.45 2 029.48±379.70 1 957.60±242.99 1 906.52±270.09 0.360

表4 GPC对蛋鸡血浆抗氧化能力的影响 Table 4 Effects of GPC on plasma antioxidant activity of old laying hens

由表 5可知，TBHQ组和GPC50组蛋鸡肝脏MDA含量显著低于对照组和GPC100组(P< 0.05)，而TBHQ组和GPC50组之间差异不显著(P>0.05)；GPC组蛋鸡肝脏T-AOC水平显著高于对照组和TBHQ组(P<0.05)；GPC50组蛋鸡肝脏T-SOD活性显著高于对照组和GPC100组(P<0.05)，但与TBHQ组差异不显著(P>0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 GPC对蛋鸡肝脏抗氧化能力的影响 Table 5 Effects of GPC on liver antioxidant activity of old laying hens 项目 Items 组别 Groups P值 P-value CON TBHQ GPC50 GPC100 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 0.81±0.07a 0.72±0.08b 0.71±0.07b 0.84±0.06a <0.010 总抗氧化能力 T-AOC/(U/mg prot) 1.52±0.05b 1.48±0.05b 1.63±0.08a 1.69±0.06a 0.037 总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mg prot) 20.33±0.81bc 21.42±0.70ab 22.22±0.62a 20.13±0.71c <0.010

表5 GPC对蛋鸡肝脏抗氧化能力的影响 Table 5 Effects of GPC on liver antioxidant activity of old laying hens

由表 6可知，GPC组鸡蛋蛋黄T-SOD活性与对照组相比显著提高(P<0.05)，TBHQ组和对照 组之间差异不显著(P>0.05)；3个试验组鸡蛋蛋黄MDA含量与对照组相比显著降低(P<0.05)，且3个试验组之间差异不显著(P>0.05)；GPC组鸡蛋蛋黄胆固醇含量显著低于对照组(P<0.05)，TBHQ组和对照组之间差异不显著(P>0.05)。

表6

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表6(Table 6)

表6 GPC对鸡蛋蛋黄抗氧化能力和胆固醇含量的影响 Table 6 Effects of GPC on egg yolk antioxidant activity and cholesterol content of old laying hens 项目 Items 组别 Groups P值 P-value CON TBHQ GPC50 GPC100 总超氧化物歧化物歧化酶 T-SOD/(U/mL) 65.66±2.32c 70.65±4.22bc 79.90±5.64a 74.65±5.69ab <0.010 丙二醛 MDA/(nmol/mL) 184.77±20.46a 152.10±19.6b 154.97±19.01b 144.37±20.67b 0.016 蛋黄胆固醇 Yolk cholesterol/(mg/g) 12.05±1.24a 11.42±0.95ab 9.64±1.91b 9.74±1.16b 0.038

表6 GPC对鸡蛋蛋黄抗氧化能力和胆固醇含量的影响 Table 6 Effects of GPC on egg yolk antioxidant activity and cholesterol content of old laying hens

衰老是动物各器官功能开始逐步降低的一种生理现象。但机体氧化可加快衰老，抗氧化则可延缓衰老。蛋鸡作为高产的动物种类，其旺盛的代谢会产生大量活性氧自由基。正常情况下，机体内自由基的产生和清除处于相对平衡状态，随着鸡日龄的增大，体内抗氧化酶类的活性下降，吸收或合成有抗氧化活性的维生素及微量元素等的功能也下降，故而清除自由基能力亦下降。大量自由基在机体内积累，可引起脂质过氧化，损伤细胞膜而影响细胞功能，进而导致机体代谢紊乱，影响健康和生产^[13]。本研究中对照组蛋鸡血浆、肝脏及蛋黄中MDA含量显著高于GPC添加组，这与Kara等^[14]报道的饲粮添加4%和6%葡萄渣显著降低了80周龄蛋鸡血浆MDA含量结果一致，说明产蛋后期蛋鸡体内氧化与抗氧化失衡，体内多余的自由基引起了脂质过氧化，研究其抗氧化具有重要现实意义。

GPC因其结构中含有多个活性酚羟基，能够提供氢质子中和自由基，还可以通过Nrf2信号通路调控抗氧化反应原件，提高机体抗氧化酶表达，减少自由基的再生，从而起到抗氧化作用^[4]。赵娇等^[15]研究指出，饲粮添加100 mg/kg的GPC能够显著提高应激仔猪血清和肝脏T-AOC，提高血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和抗羟基自由基(·OH)能力，改善血清GSH-Px活性；彭亮等^[16]研究认为葡萄籽粉能显著提高老龄大鼠体内的SOD和GSH-Px活性，降低体内MDA含量。本研究表明饲粮添加50 mg/kg的GPC显著提高了产蛋后期蛋鸡血浆、肝脏及蛋黄T-SOD活性，改善了血浆GSH-Px活性。这也与本实验室前期研究结果^[17](低剂量的GPC能够修复因球虫感染导致肉仔鸡T-SOD和GSH-Px活性降低和MDA含量升高)一致。

TBHQ是抗氧化效果较好的新合成的抗氧化剂，应用于食用油时抗氧化效果比BHA、BHT等较优。周鑫等^[18]研究指出，饲粮添加1%TBHQ能够显著提高热应激小鼠肝脏抗氧化水平。本研究亦表明添加200 mg/kg的TBHQ显著提高了产蛋后期蛋鸡血浆T-SOD活性，显著降低了肝脏和蛋黄MDA含量，有提高血浆GSH-Px活性及肝脏和蛋黄T-SOD活性的趋势，但整体抗氧化效果没有饲粮添加50 mg/kg的GPC效果好。这一方面可能是因为GPC所含多个活性酚羟基对蛋鸡抗氧化效果优于TBHQ所致，另一方面也可能植物源性的GPC更易于动物的吸收利用，具体原因还需进一步研究。

GPC不仅具有良好的抗氧化效果，还有研究指出，GPC能够抑制鸡蛋胆固醇合成酶的活性、增加蛋鸡体内胆固醇的分解，进而降低鸡蛋胆固醇含量^[19]。本研究表明，饲粮添加GPC能够显著降低鸡蛋蛋黄胆固醇含量。

蛋品质的好坏不仅影响蛋的种用价值，而且影响蛋的食用价值和商品价值。蛋白高度和哈夫单位是衡量鸡蛋蛋白质量和新鲜度的重要指标，哈夫单位越高，表示蛋白黏稠度越好，蛋白品质越好。蛋鸡日龄、环境应激等均能影响鸡蛋的哈夫单位^[20]，且随着蛋鸡日龄的增加，所产鸡蛋的哈夫单位降低^[21]。有研究表明，蛋白质变性或功能丧失是由于自由基对蛋白质造成了损伤^[22]，产蛋后期蛋鸡，由于其长时间的氧化代谢而导致体内自由基积累，亦可能损害鸡蛋蛋白的形成，进而降低蛋白哈夫单位。在环境条件和鸡龄相同的情况下，补充具有针对性的外源性物质是改善鸡蛋哈夫单位的主要途径。本试验中对照组的鸡蛋哈夫单位随鸡龄的增加而逐渐降低，但TBHQ组有一定改善，GPC组改善效果更佳，其中GPC50组最好，且在试验第8周时显著高于对照组。Kaya等^[23]研究表明，葡萄籽和葡萄籽提取物对鸡蛋破损率和饲料转化率无显著影响，但线性增加鸡蛋哈夫单位。蛋壳厚度的大小是衡量鸡蛋易破碎程度的关键指标，蛋壳愈薄，越容易破碎，产蛋后期蛋鸡钙、磷吸收能力降低，蛋壳质量变差，本试验中添加GPC可显著增加蛋壳厚度。

产蛋是禽类在神经内分泌系统共同调控下的复杂生理过程，GPC含有植物类黄酮物质，与蛋鸡体内雌激素受体互作可改变体内雌激素组成，进而改善产蛋后期蛋鸡的生理状态，提高产蛋率^[24]。本研究表明，饲粮添加50 mg/kg的GPC能显著抑制64周龄后期产蛋鸡产蛋率降低，这与胡如久等^[12]的结果相似，饲粮低量添加GPC极显著提高了产蛋率；但Kara等^[14]报道，饲粮添加葡萄渣对蛋鸡平均日采食量、产蛋率和饲料转化率没有显著影响。这可能与GPC的饲喂形式、添加量及蛋鸡日龄、饲养管理和其所处环境有关。

有报道称机体高含量的高聚合度GPC会影响养分的消化利用^[25]，试验中所用GPC为多聚合体混合物，因此整个试验过程中添加50 mg/kg的GPC对蛋鸡抗氧化能力、蛋品质和生产性能的影响比添加100 mg/kg的效果好。

对产蛋后期蛋鸡而言，饲粮添加50 mg/kg GPC的抗氧化效果优于添加200 mg/kg TBHQ，可减缓产蛋后期蛋鸡产蛋率的下降，改善鸡蛋哈夫单位和蛋壳厚度，降低蛋黄胆固醇含量。