农作物秸秆和棉籽壳等农副产物是新疆农区肉牛肉羊养殖中应用最普遍的粗饲料种类。由于品质差，粗蛋白质(CP)含量极低，为达到一定的生产性能，对精饲料特别是蛋白质补充料的依赖性很大。许多研究表明，如果精饲料中非纤维碳水化合物(NFC)含量过多，虽然可提高牛[1, 2]或羊[3]的有机物(OM)的采食量，但粗饲料的采食量和纤维的消化率往往被抑制。如能补饲适宜水平的瘤胃降解蛋白质(RDP)将会促进瘤胃微生物生长与活性，提高粗饲料的采食量和消化率[4]。此外，体外研究表明，氨基酸(AA)[5]或小肽[6]也能刺激瘤胃微生物的生长与活性。虽然大部分游离AA被瘤胃微生物发酵生成氨和挥发性脂肪酸，精饲料中添加水溶性真蛋白质饲料可显著提高小肠AA和小肽的流量[7]。据此分析，在以农副产物为粗饲料的饲养条件下，要达到预期的生产性能，不仅饲粮CP要满足需要量，而且要求CP中RDP与瘤胃非降解蛋白质(RUP)的比例(RDP∶RUP)要适宜，才能确保瘤胃微生物的生长与活性，促进采食与消化，增加小肠养分的供应量，提高养分的利用效率。但目前人们对该饲养条件下饲粮中适宜RDP∶RUP知之甚少。
为此，本研究以安装有瘤胃、十二指肠近端和回肠末端瘘管的哈萨克羊公羔为试验动物，采用双标记物法测定消化道食糜流量技术，比较研究了育肥羔羊在以小麦秸和棉籽壳为粗饲料的饲粮中不同CP水平对小肠AA流量及吸收率的影响，为今后进一步研究小肠限制性AA顺序以及建立小肠理想AA模式提供试验依据和研究基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物与饲粮选取体重(30.0±3.7) kg的哈萨克羊公羔3只作为试验动物，手术安装永久性瘤胃瘘管、十二 指肠近端瘘管和回肠末端瘘管，代谢笼内单笼饲 养。按NRC(2003)推荐采食量和营养需要量配制试验饲粮，全混合日粮(TMR)1、2、3 CP水平分别为11.00%、12.00%和13.00%，其余营养水平基本一致。每天等量饲喂2次，自由饮水。每天自由采食量为1 200~1 300 g。试验饲粮组成及营养水平见表1。
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表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
采用3×3拉丁方试验设计。各处理分别饲喂3种不同CP水平的饲粮；每期预试期10 d，使羊只适应试验饲粮，正试期10 d。每天准确记录试验羊的采食量。
1.3 食糜标记物溶液的配制与灌注按Udén等[8]的方法制备锂铬乙二胺四乙酸(LiCr-EDTA)结晶盐，溶解于蒸馏水中，实测溶液中铬(Cr)元素的浓度为3 780.22 mg/L。分4次由瘤胃瘘管灌注，每次15 mL，连续灌注8 d。配制好的镱锕(Yb-Ac)水溶液中实测镱(Yb)元素的浓度为560.10 mg/L，灌注方法同前，灌注时间比Cr延后15 min左右，避免相互干扰。每日灌注时间点08:00、14:00、20:00、02:00。连续灌注4~5 d后可达到平衡状态[9]。从灌注的第5天开始采集瘤胃、十二指肠和回肠食糜样品。
1.4 样品采集方案正试期的第5天开始采集小肠食糜。每天采样4次，连续采集3 d。第5天的采样时间点08:00、14:00、20:00、02:00；第6天的采样时间点06:00、12:00、18:00、24:00；第7天的采样时间点04:00、10:00、16:00、22:00。每隔6 h采集瘤胃食糜50 mL，十二指肠食糜30 mL，回肠食糜15 mL。将3 d内不同时间点采集到的十二指肠和回肠食糜样本等份量混合制成混合样本。放置于磁力搅拌器(WH220，Wiggens,德国)上搅拌约3 min，待食糜充分混匀后，边搅拌边用自制的前端挖孔的塑料注射器进行取样。一份食糜样品放入已称重的小烧杯中称重，记录食糜湿重，60 ℃烘干后细粉碎，用于测定食糜中2种元素及AA的含量；另取一份食糜样品放入离心管中，5 000 r/min离心10 min，取上清液或沉淀置于三角瓶称重，用于测定2种元素及AA的含量；其余样品60 ℃烘干后细粉碎，用于测定食糜干物质(DM)及氮含量。第8~10天进行全收粪和全收尿的消化代谢试验。每天取10%有代表性的粪样和尿样，于-20 ℃冰柜中冷冻保存。
1.5 测定分析DM、CP、OM含量的分析按张丽英[10]的方法进行。中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的含量按Van Soest等[11]的方案进行测定，不添加亚硫酸钠，按每克样品添加20 μL热稳定性α-淀粉酶(A3306,Sigma，美国)于中性洗涤液中。小肠食糜的AA含量采用AA分析仪(S433D，Sykam，德国)按国家标准(GB/T 18246)方法进行分析。小肠食糜分别进行酸水解[用于测定除蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)以外的其他AA]和过甲酸氧化水解[用于测定Met和Cys]。样品中Cr、Yb元素的浓度按电感耦合等离子体原子发射光谱法通则(JY/T 015—1996)用VISTA-MPX电感耦合等离子体原子发射光谱仪(Varin,美国)进行测定分析。
1.6 食糜流量及AA吸收率计算与单胃动物相比，采用体内法测定小肠食糜流量时，由于反刍动物消化生理的特殊性，小肠食糜特别是十二指肠食糜通常呈现为非均质状态，表现出明显的大或中食糜颗粒(固相)和液态食糜(含细小食糜颗粒，液相)的双相或多相特征。当利用安装有“T”型小肠瘘管的反刍动物通过点采样来测定食糜流量时，如采用单标记物[如三氧化二铬(Cr2O3)]作为食糜标记物，测得的食糜流量不准确。这主要是由于点采样难以采集到有代表性的食糜样品以及Cr2O3不能在固相和液相食糜中均匀分布造成的。为此，本试验采用Yb-Ac和Cr-LiEDTA分别作为食糜固相和液相标记物，由瘤胃瘘管连续灌注，对育肥羔羊在每日等量饲喂2次的饲养条件下小肠食糜流量及AA吸收率进行了测定，并对3种不同CP水平饲粮对小肠AA的流量及吸收率的影响进行了比较分析。
食糜流量计算按Faichney[12]建立的非代表性食糜样品重组法进行。连续灌注标记物，使标记物在小肠内的流量达到稳衡状态，从瘘管中采集食糜样品，离心分离固液相。计算公式如下：
RT=(CYb,X/IYb-CCr,X/ICr)/CCr,T/ICr-CYb,T/IYb;
CCr,D=(CCr,X+RTCCr,T)/(1+RT);
CYb,D=(CYb,X+RTCYb,T)/(1+RT);
FD=ICr/CCr,D=IYb/CYb,D;
CAA,D=(CAA,X+RTCAA,T)/(1+RT);
FAA=CAA,D×FD;
AAA=100×(十二指肠AA流量-回肠AA流量)/十二指肠AA流量。
式中：RT为重组因子(流通常数)；ICr和IYb分别为标记物Cr和Yb的灌注速率(mg/d)；CCr,D和CYb,D分别为真食糜(D)中Cr和Yb的浓度(mg/g)；CCr,X和CYb,X分别为非代表性食糜样品(X)中Cr和Yb的浓度(mg/g)；CCr,T和CYb,T分别为食糜上清液(T)中Cr和Yb的浓度(mg/g)；FD为真食糜流量(鲜重)(g/d)；CAA,D、CAA,X、CAA,T分别为真食糜、非代表食糜和食糜上清液中AA的含量(mg/g，鲜重基础)；FAA为总氨基酸(TAA)(g/d)；AAA为AA吸收率(%)。
1.7 统计分析采用GLM模块按如下模型对饲粮处理、动物效应对小肠AA流量及吸收率测定结果的效应进行统计检验：
Yijk=μ+Ti+Aj+TAij+eijk[13]。
式中：Yijk为小肠食糜AA的流量或吸收率；μ为总体平均值；Ti为饲粮处理效应；Aj为动物效应；TAij为饲粮与动物间的互作效应；eijk为残差，且假设符合正态及独立分布。运用TSR对各处理平均值的显著性差异进行多重比较，P<0.05为差异显著，0.05≤P<0.10可看作趋势。
2 结果与分析 2.1 饲粮不同CP水平对进食量、表观消化率及氮平衡的影响由表2可知，饲粮CP水平的提高可增加羔羊对氮表观消化率和氮沉积，TMR3显著高于TMR1(P<0.05)，并有提高饲粮DM、OM和NDF表观消化率的趋势(0.05≤P<0.10)，但对ADF表观消化率无影响(P>0.05)。
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表2 饲粮不同CP水平对羔羊进食量、表观消化率及氮平衡的影响 Table 2 Effects of different dietary CP levels on intake, apparent digestibility and N balance of lambs |
由表3可知，饲粮CP水平的提高对十二指肠和回肠真食糜流量(鲜重)无显著影响(P>0.05)，3个处理的平均值分别为9 479和1 711 g/d。3个处理的十二指肠和回肠DM流量平均值分别为 723和181 g/d。TMR1和TMR3十二指肠氮流量均大于氮进食量，而TMR3十二指肠食糜TAA流量在数值上大于其他2种饲粮，差异不显著(P>0.05)。
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表3 饲粮不同CP水平对羔羊小肠食糜DM、氮及TAA流量的影响 Table 3 Effects of different dietary CP levels on small intestinal chyme DM, N and TAA flows of lambs |
由表4可知，随饲粮中CP水平的升高，虽然十二指肠AA流量在各处理间无显著性差异(P>0.05)，但必需氨基酸(EAA)中精氨酸(Arg)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)与赖氨酸(Lys)的流量增加幅度明显。
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表4 饲粮不同CP水平对羔羊十二指肠氨基酸流量 Table 4 Effects of different dietary CP levels on duodenal flows of AA of lambs |
由表5可知，单个AA的回肠流量在3个处理间的差异不显著(P>0.05)，除个别AA(Arg和His)的流量TMR2较低外，其他AA的回肠流量TMR2在数值上均高于其他2个处理。
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表5 饲粮不同CP水平对羔羊回肠AA流量的影响 Table 5 Effects of different dietary CP levels on ileal flows of AA of lambs |
由表6可知，饲粮CP水平对小肠AA吸收率 无显著影响(P>0.05)。总体上，TMR2的AA吸 收率偏低，而TMR3的AA吸收率普遍较高，而且TAA的吸收率也是最高的。
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表6 饲粮不同CP水平对羔羊小肠AA吸收率的影响 Table 6 Effects of different dietary CP levels on small intestinal absorption rate of AA of lambs |
干物质进食量(DMI)决定着维持羔羊健康和生产所需养分的数量，受饲粮水分和NDF含量及其精粗比的影响。饲粮的CP水平的高低决定可利用能量的高低，而可利用能量的高低直接影响小肠AA的吸收。但是饲粮的不同CP水平对采食量、表观消化率及氮平衡的是否有影响，不同学者的研究结果不同。Hentz等[14]采用与本研究近似体重的试验羊，代谢笼内进行的消化代谢试验结果表明，在自由采食苏丹草的条件下，补饲不同水平的坎诺拉菜籽粕，氮进食量不影响DM、OM、NDF或ADF的表观消化率，但是，氮进食量、氮表观消化率、粪氮和尿氮排出量以及氮沉积等均随补饲水平的增加而线性升高。马涛等[15]采用杜×寒杂交绵羊公羊作为试验羊，饲喂12种不同精粗比的全混合颗粒饲料，尿氮排出量和氮沉积均随饲粮精饲料比例的升高而显著升高。梁贤威等[16]则报道，随饲粮精饲料比例升高，尿氮和粪氮排出量均下降。本试验的结果表明，提高饲粮CP水平可显著增加羔羊对氮的表观消化率和氮沉积，这与以上结果一致。原因可能是随着饲粮中精饲料比例的增加，瘤胃食糜外流速度增加。一般认为，纤维的消化率与饲粮酸性洗涤木质素(ADL)含量及瘤胃食糜外流速度负相关。本试验虽未分析饲粮中ADL的含量，但3种饲粮的NDF含量比较接近，而ADF的含量略有差异。
3.2 饲粮不同CP水平对小肠真食糜流量的影响张乃峰等[9]应用Cr2O3和聚乙二醇4 000(PEG-4 000)分别作为固相和液相食糜标记物，试验羊的体重(35 kg)和DMI(1 100 g)与本试验接近，测定的十二指肠、回肠真食糜流量平均值分别为10.1和5.6 L/d。十二指肠真食糜流量与本试验非常接近，但回肠真食糜流量相差较大。造成此差异的原因不清，是否与饲喂频率有关还有待进一步试验证实。该试验采用的饲喂方式是自动饲喂器连续饲喂，每隔1 h饲喂1次，而本试验是采用每日等量饲喂2次的方式。
Hentz等[14]试验发现，随着菜籽粕补饲量的加大，十二指肠食糜OM、氮、α-氨基-氮(α-amino-N)、氨态氮以及非氨非微生物氮(NANMN)的流量均线性增加，但微生物氮流量、瘤胃OM真消化率以及微生物蛋白质(MCP)合成效率均不受影响。RDP转化为微生物氮的利用效率线性降低。说明虽然瘤胃内可利用氮的量增多了，但精饲料比例增加又加快了瘤胃食糜外流速度，造成食糜中来自于RUP的α-氨基-氮的比例相应增加了。上述分析或许可以解释本研究中十二指肠TAA流量数值上增加的结果。
Oosting等[17]试验采用4只体重为60 kg的安装有瘤胃、十二指肠和回肠瘘管的美利奴羊作为试验动物，分别饲喂不同水平二氧化硫处理小麦秸和大麦的混合饲粮，按4×4拉丁方试验设计进行消化代谢试验，氮进食量(18.0 g/d)与本研究的TMR1(19.0 g/d)非常接近。结果表明，饲喂100%小麦秸饲粮条件下绵羊瘤胃氮的转化效率最高，十二指肠氮流量随饲粮中小麦秸比例的减少而降低(22.4 g/d vs. 18.0 g/d)，但不影响小肠氮的吸收量，各处理羊的小肠氮吸收量介于13.6~14.6 g/d之间。此结果与本试验结果不一致。本试验测定的3种饲粮的十二指肠氮流量虽然与该结果非常接近，随精饲料比例的增高，十二指肠氮流量也相应增大(19.4~25.4 g/d)，TAA的流量也呈现一致升高的趋势。小肠氮的吸收量(19.88~22.42 g/d)明显高于该试验的报道值。进一步分析该试验饲粮可以看出，虽然各处理饲粮的氮含量为2%，但小麦秸的氮含量是通过添加NPN来达到2%，与大麦的氮含量持平。而大麦的CP中RDP约占80%，由此推测，饲粮中RDP和NFC的供给量可能偏高，随着大麦比例(30%、70%和100%)的增加，瘤胃液氨态氮的含量逐步升高，微生物发酵可能会因为瘤胃液pH降低而受到抑制，导致十二指肠非氨态氮的流量线性降低。本试验未进行瘤胃至十二指肠食糜中各种氮组分(氨态氮、微生物氮、非氨态氮非微生物氮)的流量的测定，下一步试验再深入分析增加饲粮CP水平对微生物氮的合成效率的影响。
3.3 饲粮不同CP水平对小肠AA流量的影响梁贤威等[16]研究表明，不同碳源(玉米vs.大麦)和氮源(豆粕vs.鱼粉)组合处理对小肠AA的吸收量的影响也无显著性差异，但若将吸收量表示为进入十二指肠AA流量的百分比时，大麦-鱼粉组合饲粮组的AA吸收率显著高于其他组合处理。据Hussein等[18]报道，碱化处理小麦秸基础饲粮中补充不同混合比例的玉米蛋白粉和血粉蛋白质补充料(饲粮CP 12.9%DM)，对绵羊小肠TAA流量无显著性影响，但随血粉替代玉米蛋白粉比例的增大，Val、His、Lys和Arg的流量显著增加，而Ile、Leu和Met的流量显著降低，Thr和苯丙氨酸(Phe)的流量不变。在只补充豆粕的情况下，十二指肠食糜中微生物氮的流量增加，而饲料及内源AA流量降低。上述结果提示，改变饲粮中RDP的水平，即使不影响十二指肠TAA的流量，但可改变AA的比例。十二指肠食糜中His和Lys流量增加，对于促进羔羊的生长育肥来说非常重要。因为瘤胃MCP中的Lys、Met和His相对于生长的需要量是限制性作用最大的AA。
本试验测定的十二指肠EAA(Trp除外)流量的平均值(27.08 g/d)，与王洪荣等[19]报道值(31.13 g/d)非常接近。单个EAA流量测定值中，Met的流量比较接近，His和Thr的流量高于该报道的值，而其他AA和TAA的流量均低于其报道值。本试验测定的TAA流量明显低于一些报道的数值，这可能与不同的试验条件及测定方法有关，如Hussein等[18]、王洪荣等[19]的试验均采用单一Cr2O3作为食糜标记物。
3.4 饲粮不同CP水平对小肠AA吸收率的影响一些研究发现，随饲粮中血粉替代CGM比例的增加，Val、His和Lys的小肠吸收量增大，而Met、Ile和Leu的吸收量减小，说明改变饲粮RDP:RUP能够影响小肠中一些重要AA的吸收，这有可能与小肠中AA的平衡性得到改善有关。这或许也是生产上阉牛和羔羊在以农作物秸秆为基础饲粮条件下，补饲混合蛋白质饲料的增重速度和饲料转化效率要优于单独补饲尿素或大豆粕的原因。
本试验中，小肠TAA吸收率平均值(79.0%)略低于氮的吸收率平均值，且低于黄现青等[20]的报道值(82%)。Oosting等[17]用体内法测得的饲喂小麦秸与大麦混合饲粮的美利奴羊小肠AA的吸收量为70.1~72.6 g/d，高于饲喂100%小麦秸饲粮的绵羊的吸收量(60.9 g/d)。大麦不仅能够提供丰富的可发酵OM，而且大麦的蛋白质中RDP的比例高达80%。由此可以看出，补饲大麦明显增加了瘤胃MCP的合成量，从而增加了十二指肠AA的供应量。这是因为当农作物秸秆在饲粮中比例较高的情况下，瘤胃内MCP合成效率较低，秸秆自身可能因小肠消化率低所能提供的AA量也不足。
单个AA小肠吸收率比较发现，Glu的小肠吸收率在3种TMR中均最高，而Ile、Cys和脯氨酸(Pro)的吸收率较低，其余大部分AA的吸收率介于黄现青等[20]报道的吸收率范围之内(40.69% ~92.67%)。刘志友等[21]对敖汉细毛羊小肠AA吸收率的测定发现，Cys、Val和Pro的吸收率均较低。本研究测定的AA在绵羊小肠吸收率与NRC公布的数据相近，但His的吸收率平均值(85.7%)明显高于报道值(70%和58%)。
4 结 论① 提高饲粮CP水平可显著增加羔羊氮进食量、表观消化率和氮沉积，并有增加饲粮DM、OM和NDF表观消化率的趋势，但不影响ADF表观消化率。
② 提高饲粮CP水平虽然对小肠真食糜流量及AA吸收率无显著性影响，但十二指肠氮、TAA流量以及EAA中Arg、His和Lys的吸收率在数值上有所增加。
致谢：对试验过程中给予帮助和支持的新疆农业大学动物科技学院的李海英、李凤鸣和李昊老师表示诚挚的谢意。
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