畜禽呼吸道与畜禽舍内环境相通，时刻受到舍内温度、湿度、细菌、病毒、粉尘颗粒以及多种有害气体的刺激，有害物质通过损伤呼吸道黏膜或通过气道上皮细胞间隙进入动物体内，引发呼吸道疾病。随着集约化养殖的飞速发展，畜禽呼吸道疾病逐渐增多，导致动物生产性能下降，免疫功能降低，严重者直接导致畜禽死亡，给畜牧业生产和发展带来严重的经济损失[1-2]。畜禽呼吸道综合征、传染性支气管炎、流感等呼吸道传染病的大规模爆发引起了人们高度重视，畜禽呼吸道疾病的预防和治疗变得尤为重要。呼吸道黏膜屏障作为黏膜屏障的重要组成部分，与外界环境直接相通，将外界环境中各种有害物质与机体环境相隔离，是保护畜禽健康，尤其是保护畜禽呼吸道免受病原微生物、粉尘等有害物质侵袭的重要屏障。呼吸道黏膜屏障能够清除气道内致病菌、粉尘等异物，抵制病原菌感染，维护呼吸道健康。因此，深入了解呼吸道黏膜屏障的结构和功能以及呼吸道疾病的发病机理，对畜禽呼吸道疾病的治疗和新药物的研发以及健康养殖的发展意义重大。目前，关于黏膜屏障的报道多集中于肠道黏膜，而对呼吸道黏膜的研究报道较少，呼吸道黏膜是呼吸系统抵抗外界有害物质的重要屏障，是保护机体健康的重要防线。此外，养殖户多采用抗生素防治畜禽呼吸道疾病，导致致病菌产生耐药性[3]。本文通过简要综述畜禽呼吸道黏膜屏障的结构和功能及呼吸道黏膜屏障的改善措施，引起人们对呼吸道黏膜屏障的关注，为改善畜禽健康及疫苗研制提供新的研究方向。
1 呼吸道黏膜屏障概述动物机体黏膜系统主要包括呼吸道及胃肠道黏膜，其中呼吸道黏膜作为机体的第二大黏膜系统，是维护呼吸道健康的有效屏障。呼吸道黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障共同组成，各自通过不同的分子调控机制、信号通路以及生物学功能相互结合共同保护机体呼吸道屏障，抵御病原菌等有害物质的攻击[4]。当各种外界致病因子相互作用时，破坏呼吸道黏膜屏障完整性，导致气道氧化应激及炎症和感染，引发呼吸道疾病，降低免疫功能，甚至导致畜禽肺脏损伤，严重危害动物的健康[5-6]。
2 呼吸道黏膜屏障的结构与功能 2.1 机械屏障呼吸道黏膜上皮细胞以及细胞间的紧密连接(tight junction，TJ)构成呼吸道黏膜的机械屏障[7]。机械屏障的各部分相互作用，阻止病原微生物穿透呼吸道黏膜进入机体深部组织，是构成呼吸道黏膜屏障的结构基础。呼吸道黏膜上皮细胞(图 1)主要有纤毛细胞、杯状细胞、基底细胞以及黏膜下分泌腺体等[8-9]。纤毛细胞是呼吸道黏膜上皮的主要细胞，纤毛细胞上附有一定数量的纤毛并按一定频率进行摆动，通过纤毛的摆动作用，及时清除进入鼻腔、气管内的细菌和粉尘等有害物质[10]。纤毛细胞受到外界有害因子如细菌、病毒、粉尘等应激时，纤毛的运动功能下降，导致呼吸道内有害物质清除功能降低，致病菌、粉尘等在呼吸道停留时间延长，进而导致呼吸道发生氧化应激及炎症感染[7, 11]。纤毛细胞还具有可塑性，可化生成杯状细胞[12]。纤毛细胞之间的杯状细胞和Clara细胞，在一定的条件下可继续分化为纤毛细胞。基细胞借助黏附分子固定在基膜上，能够增殖分化形成纤毛细胞[13]；杯状细胞及黏膜下腺体是主要的分泌细胞，通过分泌黏蛋白等化学物质保护呼吸道黏膜。
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Antimicrobial peptides：抗菌肽；Airway surface liquid：气道表面液体；Apico-lateral junctional complex：顶端侧面连接复合物；Environmental factors：环境因素；Mucus layer：黏液层；Periciliary layer：纤毛层；Ciliated cell：纤毛细胞；Serous cell：浆液细胞；Goblet cell :杯状细胞；Basal cell：基细胞。 图 1 呼吸道上皮细胞组成 Figure 1 Components of airway tract epithelium[9] |
呼吸道黏膜细胞之间通过各种连接蛋白和信号分子形成紧密连接、黏附连接及桥粒连接来维持上皮细胞的正常结构和功能，细胞间通过多种连接蛋白互相作用，保持上皮细胞的完整，调节各种物质有效转运[14]。上皮细胞之间的连接方式主要有紧密连接、黏附连接和缝隙连接(图 2)，紧密连接是最重要的连接方式[15]；黏附连接起着细胞与细胞之间的黏附和细胞内信号传递的作用[16]；缝隙连接是细胞之间进行物质及信息交换的通道，对细胞增殖、分化及机体的生长发育至关重要。紧密连接是多种蛋白质相互作用下形成的复合结构，主要位于相邻细胞间连接的最顶部，是细胞间最基本、最常见的组织结构形式，通过封闭相邻细胞间的缝隙，阻止呼吸道内致病菌等外来有害物质通过细胞间隙渗入机体组织，保证动物内环境的相对稳定[17]。紧密连接蛋白主要包括跨膜蛋白和胞浆蛋白，其中跨膜蛋白有闭锁蛋白(Occludin)、闭合蛋白(Claudins)和连接黏附分子(junction adhesion molecules，JAM)[18]，胞浆蛋白是闭合小环蛋白(zonula occludens，ZO)，包括ZO-1、ZO-2、ZO-3，这些跨膜蛋白通过胞浆蛋白连接于肌动蛋白细胞骨架，进而形成紧密连接复合体与上皮细胞一起形成完整的上皮结构并调节细胞的屏障功能[19-22]。紧密连接蛋白能够调节呼吸道上皮细胞间多种大分子物质的通透性与渗透性，阻止致病原、粉尘颗粒等外来有害物质进入机体，同时参与机体信号传导和固有免疫[23]。细胞间紧密连接的稳定性与Claudins间及Claudins与其他紧密连接蛋白间复杂的相互作用有关，Claudins是构成紧密连接的主要骨架蛋白。Occludin能够密封上皮细胞间的空隙，具有维持机体渗透屏障以及上皮细胞极性、调节细胞之间的黏附性、接受并传递细胞信号等生物学功能[24]。ZO具有连接跨膜蛋白与细胞骨架及传递信号分子、调节和运输细胞内物质、维持上皮细胞的极性等功能，是紧密连接支持结构的基础[25]。ZO-1和ZO-2使Claudins与肌动蛋白紧密结合在一起，构成稳定的连接系统[26]。
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Occludin：闭锁蛋白；Claudins：闭合蛋白；JAM：连接黏附分子junction adhesion molecules；ZO-1：闭合小环蛋1 zonula occludens-1；ZO-2：闭合小环蛋2 zonula occludens-2；ZO-3：闭合小环蛋3 zonula occludens-3；E-cadherin：E-钙黏蛋白；α/β-actin：α/β肌动蛋白；Actin：肌动蛋白；Cortactin：皮肌动蛋白；Cingulin：扣带蛋白。 图 2 气道上皮细胞连接结构示意图 Figure 2 Cartoon diagram of airway epithelial cells indicating junction structures[27] |
呼吸道黏膜化学屏障主要由覆盖在整个呼吸道表面的具有一定弹性和黏性的表面液体组成，主要包括黏液层和浆液层，能够保持气道湿润，阻止多种有害因子侵袭。黏液层主要由黏膜下腺体、上皮细胞分泌物以及组织渗出液等组成，如防御素、溶菌酶、抗菌肽等多种化学组分，能够破坏多种细菌的细胞壁，消灭入侵的病原菌[28]。黏液主要成分为水，占84%~94%，此外包括蛋白质、糖类、脂质等，其中黏蛋白是黏液中最重要的蛋白质成分[29]。黏蛋白可分为膜结合黏蛋白以及分泌型黏蛋白，膜结合黏蛋白存在于上皮细胞的表层，具有保护细胞、黏附细菌、促进上皮细胞增殖等作用；分泌型黏蛋白具有润滑、保护黏膜屏障作用[30-31]。杯状细胞和黏膜下腺体细胞是呼吸道黏蛋白的主要来源，其中MUC5AC主要通过杯状细胞分泌产生，MUC5B主要由黏膜下腺体的浆液细胞产生。通常情况下，呼吸道存在少量的黏液，保护和润滑呼吸道黏膜，维持呼吸道的正常功能，但在外界有害物质应激作用下，杯状细胞肥大、增生，呼吸道黏蛋白MUC5AC表达上调，使气道黏液分泌增加，加重呼吸道阻塞[32-33]。浆液层作为呼吸道的化学屏障能够为纤毛生长提供良好的环境，对于维持纤毛的运动具有重要意义。
2.3 微生物屏障呼吸道黏膜表面时刻定居着一定数量和种类的微生物，这些微生物之间以及微生物和宿主之间相互作用形成动物机体稳定的微生态环境。一般微生态环境处于动态平衡状态，形成了抵御病原菌感染的微生物屏障。呼吸道有许多细菌定植，构成上呼吸道的正常菌群，这些菌群有助于宿主体内的食物代谢和营养吸收，同时还参与黏膜免疫稳态的维持以及外源病原体的抵抗和清除，通过竞争机体呼吸道黏膜上的黏附、分泌抗菌物质、增加黏液分泌来抑制致病菌的定植和生长，在发挥局部免疫功能和抵御外籍菌入侵方面具有重要的作用。随着肉鸡日龄的增加，喉部和气管菌群香农指数与丰富度逐渐增加，在微生物门水平上主要为厚壁菌门以及放线菌门和拟杆菌门[34-35]。潘康成等[36]研究报道，肉鸡呼吸道中微生物主要是肠杆菌科，其次是不可培养微生物。栾素军等[37]采用16S高通量测序方法测定肉鸡呼吸道微生物群落，结果表明，在肉鸡21日龄时，呼吸道微生物主要以厚壁菌门为主，在肉鸡42日龄时，呼吸道微生物菌群主要包括厚壁菌门和变形菌门；呼吸道微生物科水平的主要优势菌群为乳酸杆菌科、芽孢杆菌科、肠球菌科、葡萄球菌科、链球菌科和肠杆菌科等。呼吸道的特殊结构决定其容易受到环境中多种因子的影响，一旦呼吸道菌群失调，将会诱发机体产生多种呼吸道疾病。
2.4 免疫屏障呼吸道黏膜免疫系统主要包括黏膜相关淋巴组织和弥散性淋巴组织，其中黏膜相关淋巴组织是免疫应答的传入淋巴区，外来抗原从黏膜相关淋巴组织进入呼吸道黏膜，被呼吸道上皮细胞提取，通过抗原递呈细胞呈递给T细胞和B细胞，引发免疫应答[38]；弥散淋巴组织则是免疫应答的传出淋巴区，通过归巢机制，浆细胞和致敏淋巴细胞迁移至弥散淋巴组织并发挥生物学功能[39-40]。呼吸系统的黏膜相关淋巴组织主要是由支气管相关淋巴组织以及鼻相关淋巴组织组成[41]。杨树宝[41]研究报道，肉鸡呼吸道黏膜相关淋巴组织在4和7日龄时出现，形成呼吸道免疫的组织结构基础；随着日龄的增长，呼吸道相关淋巴组织抗原递呈细胞及T、B淋巴细胞等不断发育，35日龄之前主要以发挥细胞免疫功能为主，35日龄之后以发挥体液免疫为主。闫梦菲等[42]报道，鸡鼻腔中分布有丰富的鼻相关淋巴组织。冯小刚[43]研究报道，鸡鼻腺形成于18胚龄，出壳后鼻腔黏膜发生明显变化，21日龄时鸡鼻相关淋巴组织完全发育成熟。弥散性淋巴组织是免疫应答的效应部位，主要在黏膜固有层中，包括上皮内淋巴细胞和固有层淋巴细胞[44]。上皮内淋巴细胞参与细胞介导的黏膜免疫，维持上皮细胞的完整性，它能够表达CD和B整合素，分泌干扰素(IFN)、白细胞介素(lL)-2、lL-5等细胞因子，具有抗原特异性辅助功能和自然杀伤细胞(NK细胞)的活性[45]。固有层淋巴细胞存在着多种免疫相关细胞，主要位于黏膜上皮固有层内，如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞等。当受到外界抗原刺激时，B细胞分泌大量分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，通过分泌片的介导来发挥作用；T细胞通过CD4和CD8细胞，分泌转化生长因子(TGF)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等发挥免疫功能[46]。
sIgA对呼吸道黏膜防御起着重要作用[47-49]。李鹏成等[50]研究报道，猪呼吸道含有较多的抗体分泌细胞，免疫球蛋白A(IgA)分泌细胞在气管中分布最多，其次是咽扁桃体、软腭扁桃体，肺中最少。sIgA由浆细胞产生，由J链和分泌片各1条以及2个IgA单体组成，能够阻止病原微生物的黏附，结合黏膜上皮细胞分泌的分泌片，中和抗原物质，溶解细菌[46]。
呼吸道黏膜中存在大量抗原呈递细胞，其中主要有树突状细胞(DC细胞)和巨噬细胞，能够表达主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ类分子，参与黏膜免疫。DC细胞迁移到黏膜表面，摄取抗原后带回黏膜淋巴组织诱导免疫应答，同时还能捕捉黏附于上皮的抗原，把抗原带到淋巴组织引发免疫应答[51-52]。此外，DC细胞还能有效激活T细胞，活化的DC细胞通过淋巴循环进入免疫器官，进而与淋巴组织中的T细胞和B细胞互相作用，启动、调节和维持免疫反应[53-54]。巨噬细胞是重要的天然免疫细胞，其数量占气道表面免疫细胞数量的90%以上[6]。微皱褶细胞(microfold cell，lM细胞)存在于靠近黏膜相关淋巴组织的上皮中，能快速地将抗原不经修饰地转运给抗原递呈细胞[55]。此外，呼吸道肥大细胞能够加工和提呈抗原，吞噬病原微生物，调节呼吸道免疫应答反应。
气道黏液也是呼吸道免疫防御的重要物质，如sIgA、抗菌肽、防御素、溶菌酶、乳铁蛋白及蛋白酶抑制剂等，是机体黏膜的天然液态性防御物质，能够破坏细胞壁的完整性，干扰细菌的作用途径，同时竞争细菌生存所需的营养物质，进而起到杀菌作用[28]。呼吸道黏膜上皮细胞也可通过分泌多种活性物质发挥免疫调节作用。上皮细胞可表达多种免疫模式识别受体(PRR)、MHC分子、协同刺激分子和黏附分子，识别微生物病原相关分子模式，启动抵御病原微生物的天然免疫反应。呼吸道上皮细胞还能够产生和分泌多种化学物质，如炎症介质、细胞因子和氧自由基等，参与介导呼吸道内各种炎性细胞的生存、趋化和活化[56]。如上皮细胞通过识别Toll样受体来激活核转录因子-κB(NF-κB)等转录调节因子，分泌溶菌酶、蛋白酶抑制剂等物质来消灭入侵的微生物[57]。
3 畜禽呼吸道黏膜屏障的改善措施 3.1 加强饲养管理，改善畜禽舍环境畜禽舍内有害气体、粉尘颗粒、病原微生物等能够刺激呼吸道黏膜，导致动物黏膜损伤。如李聪等[58]研究报道，25 mg/kg氨气组的肉鸡气管组织MUC2 mRNA表达量显著升高，50和75 mg/kg氨气组的肉鸡气管组织MUC2和Claudin1 mRNA表达量均显著下降。加强饲养管理，改善畜禽舍环境具体包括以下几方面：1) 合理控制畜禽舍内小气候环境，保持畜禽舍内适宜的温度和湿度，如刚出壳的肉仔鸡的育雏温度为33~35 ℃，以后每周根据雏鸡的生长发育，气温下降2~3 ℃，直至18~23 ℃为止；相对湿度前期控制在60%~70%，后期控制在50%~60%；饲养密度控制在30~33 kg/m2。2) 合理通风，冬季执行最小通风量，夏季执行最大通风量。3) 每周定期消毒，及时清洁舍内卫生。4) 使用磷酸氢钙、沸石等化学、物理除臭剂，降低舍内有害气体含量。5) 采用全进全出的饲养方式，空舍期对畜禽舍全面冲洗、消毒。
3.2 使用饲料添加剂近年来研究发现，维生素、益生菌等饲料添加剂能促进畜禽黏膜的发育和损伤的修复，维护畜禽呼吸道黏膜健康。饲粮中添加维生素A能够维持畜禽上皮细胞的结构和功能，阻挡致病菌的入侵。研究报道，维生素A参与呼吸道黏膜免疫调控，缓解脂多糖(LPS)和氨气(NH3)对呼吸道的应激作用，提高呼吸道免疫功能[59-60]，当维生素A的供给量不足时，可导致呼吸道黏膜上皮鳞状化生和脱落，使黏膜的屏障作用降低[61-62]。其次饲粮中添加益生菌制剂不仅能提高畜禽的生产性能和免疫功能，还能改善呼吸道黏膜屏障。王迪等[63]研究表明，乳酸菌能够抑制大肠杆菌的定植，调节肉鸡呼吸道菌群的多样性，同时还能提高呼吸系统的免疫力。具体实施可以每天喷雾1 mL/m3的枯草芽孢杆菌(108 CFU/mL)或者2 mL/m3复合芽孢杆菌(4×108 CFU/mL)[36-37]。此外，在饲粮中添加金银花、黄芪等中草药或植物提取物等能够提高动物的细胞修复能力，改善呼吸道黏膜屏障[64]。
3.3 合理免疫和用药合理免疫及用药能够有效地增强畜禽的局部免疫功能。具体措施有：1) 通过点眼、滴鼻以及喷雾等方法免疫，做好新城疫、传染性支气管炎等呼吸道疾病的疫苗接种。研究表明，猪呼吸道是黏膜免疫的理想位点[65]，通过鼻腔免疫猪肺炎支原体弱毒株，呼吸道IgA和免疫球蛋白G(IgG)分泌细胞显著增加，能够有效提高呼吸道黏膜局部的体液免疫应答[66]。通过点眼、滴鼻以及喷雾等方法免疫能够有效刺激呼吸道黏膜免疫细胞，产生免疫球蛋白、细胞因子等提高呼吸道局部免疫功能，提高呼吸道黏膜免疫屏障[67]。2) 畜禽场要根据实际情况合理选用抗菌药物。研究表明，呼吸道菌群对抗菌药物的敏感性有明显的区域性与区域差异[68]，因此要尽可能减轻药物对畜禽呼吸道正常菌群的影响，合理选择抗菌药物，增强畜禽的免疫力。
4 小结呼吸道黏膜组织各组分相互作用，形成了有机的网络，对于保护呼吸道健康意义重大。近年来，随着研究方法的创新和进步，为研究黏膜屏障提供了良好的技术，但呼吸道微生物作用方式、呼吸道黏膜免疫机理等问题都亟待我们去探索。加强呼吸道黏膜屏障的研究，深入了解呼吸道黏膜屏障的作用机制，进而为畜禽呼吸道疾病的预防和治疗提供全新的方法，对于健康养殖的发展意义重大。
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