脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)是饲料中2种最常见的霉菌毒素。霉菌毒素不仅会使动物生长性能、繁殖性能下降，还会造成免疫抑制，引起疾病高发。细胞是生物体的基本单位，细胞内环境稳定是维持细胞正常功能的必要条件^[1]。当细胞内环境失调时，就会出现糖类、脂类、蛋白质三大物质代谢紊乱，基因表达复制异常，蛋白质合成异常，细胞结构、功能异常^[1]。脾脏是机体重要的免疫器官，体外培养鸡脾脏淋巴细胞已成为重要的研究模型^[2-3]。在前期的预试验中我们发现DON与ZEA联合暴露会导致体外培养鸡淋巴细胞的凋亡(数据未列出)。在细胞凋亡过程中，多伴随细胞内环境稳态失衡，其中细胞内氧化还原、酸碱度与离子浓度平衡状态失调既是细胞凋亡的特征，又在一定程度上促进细胞凋亡^[4]。我们的前期研究表明单独染毒DON^[5]或ZEA^[6]均可导致鸡体外脾脏淋巴细胞内环境失衡，进而引起细胞凋亡，但两者联合暴露对体外培养鸡脾脏淋巴细胞内环境稳态影响的研究报道较少。本研究以原代培养鸡脾脏淋巴细胞为模型，重点研究DON与ZEA联合暴露后细胞膜ATP酶(Ca²⁺-ATP酶、Na⁺/K⁺-ATP酶)活性及细胞内Ca²⁺水平、pH及钙调蛋白(calmodulin，CaM)mRNA表达水平变化，为阐明DON与ZEA联合暴露致细胞凋亡的机制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

胎牛血清(FBS)(美国Gibco)，DON、ZEA及无酚红的RPMI1640培养基(美国Sigma)，细胞计数试剂盒(CCK-8)(日本Dojindo)，细胞内pH荧光探针BCECF-AM染液(日本Dojindo)，细胞内钙离子荧光探针Fluo-3/AM染液(美国Molecular Probes)，活化Taq酶等PCR反应试剂(日本TaKaRa)，Trizol试剂盒、M-MLV反转录酶(美国Invitrogen)，溴化乙锭(EB)(美国Sigma)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)(美国Sigma)，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液(美国Sigma)，细胞内蛋白质测定试剂盒(Lorry法)、细胞膜ATP酶(Ca²⁺-ATP酶与Na⁺/K⁺-ATP酶)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 试验方法

脾脏淋巴细胞悬液的制备：在无菌条件下，将由东北农业大学动物医学院动物中心提供的40~60日龄健康的伊莎公鸡的脾脏取出，放入盛有磷酸盐缓冲液(PBS)的培养皿里，用PBS轻轻洗涤脾脏周围的血液残渣，仔细剥去脾脏周围的结缔组织，将其移入另一个盛有PBS的浸泡有200目网筛的培养皿中，用镊子将脾脏放在200目铜网上，用20 mL一次性注射器的内芯轻轻研磨，过滤，将滤液适当稀释成一定浓度的细胞悬液，再将细胞悬液移入预先装有鸡淋巴分离液的离心管里，立即缓缓以1 : 1体积比将细胞悬液移入到鸡淋巴分离液上层，室温下2 000 r/min离心15 min，用巴氏吸管移取淋巴细胞，加入冷的PBS洗涤，4 ℃下1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，加入不含毒素的RPMI1640完全培养液(加胎牛血清)再洗涤1次，重悬，制备5×10⁶细胞/mL的细胞悬液，并用台盼蓝检测细胞活力大于95%即表明脾脏淋巴细胞悬液制备成功。

DON与ZEA联合暴露浓度的确定：本试验应用CCK-8法分别检测了DON、ZEA对体外培养的鸡脾脏淋巴细胞的活性的影响。染毒48 h时，DON的半数抑制浓度(IC₅₀)为(30.82±10.48) μg/mL，ZEA的IC₅₀为(23.91±4.96) μg/mL。通过IC₅₀，筛选出DON、ZEA单独的作用浓度，由于在前期预试验中DON、ZEA单独染毒时高浓度组均造成脾脏淋巴细胞的严重损伤。因此，在正式试验中以DON、ZEA低浓度进行联合暴露，即确定联合暴露剂量为0.012 50 μg/mL DON+0.006 25 μg/mL ZEA(DZ-1组)、0.050 μg/mL DON+0.025 μg/mL ZEA(DZ-2组)、0.2 μg/mL DON+0.1 μg/mL ZEA(DZ-3组)、0.8 μg/mL DON+0.4 μg/mL ZEA(DZ-4组)。同时设不添加毒素的空白对照组。

1.3 细胞内Ca²⁺水平测定

染毒培养48 h后，收集细胞，1 500 r/min离心3 min，后用PBS洗涤细胞3次。用PBS悬浮细胞，加入细胞内钙离子荧光探针Fluo-3/AM染液使其终浓度为1 μmol/L，混匀，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤3次，在流式细胞仪上测定其平均荧光强度(激发波长488 nm，发射波长530 nm)。

1.4 细胞内pH测定

染毒培养48 h后，收集细胞，1 500 r/min离心3 min，后用PBS洗涤细胞3次。在收集的细胞中加入不含胎牛血清的RPMI1640培养液，制备5×10⁶细胞/mL的细胞悬液，加入细胞内pH荧光探针BCECF/AM染液，使其终浓度为2 μmol/L；然后在CO₂培养箱(避光，37 ℃)中孵育30 min。收集细胞，用不含胎牛血清的RPMI1640培养液洗涤3次，再用PBS重悬细胞，在流式细胞仪上488 nm激发，相应的细胞内pH根据其荧光强度大小显示于一个二维点阵图上(X轴525 nm，Y轴610 nm)上。根据标准曲线结果，细胞内pH即为绿/与红荧光强度的比值，每个样本至少选用10 000个细胞进行统计分析^[7]。

1.5 细胞膜Ca²⁺-ATP酶与Na⁺/K⁺-ATP酶活性测定

染毒培养48 h后，收集细胞，1 500 r/min离心3 min，后用PBS洗涤细胞3次。每个样品中加入500 μL含0.1% TritonX-100的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4) 后，进行超声裂解(4 ℃)。将裂解液1 000×g离心10 min，取其上清液进行蛋白质定量，并用生理盐水(无磷)适当稀释使其蛋白质含量控制于3~5 mg/mL。取裂解上清液测定其细胞膜Na⁺/K⁺-ATP酶与Ca²⁺-ATP酶活性(定磷法)，详细测定方法见试剂盒说明书。

1.6 细胞内CaM mRNA的测定

应用Trizol法提取鸡脾脏淋巴细胞总RNA，使用M-MLV反转录酶反转录成cDNA。根据GenBank中公布的鸡的β-肌动蛋白(β-actin)(L08165) 和CaM(NM205005) 的全基因序列，应用Prime 5.0软件设计特异的上、下游引物，并经GenBank Blast进行同源性检索后由Invitrogen公司(上海)合成。引物序列及参数见表 1。按cDNA模板的反转录反应体系进行加样(30 μL)：10 μL总RNA，1 μL M-MLV反转录酶，1 μL RNA酶抑制剂，4 μL dNTP，2 μL Oligo dT，4 μL DTT和8 μL 5×Buffer。按反转录程序进行，具体如下：42 ℃，反应30 min，99 ℃灭活5 min，5 ℃ 5 min。反转录产物瞬时离心，保存在-20 ℃备用。通过Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪对反转录产物进行PCR，反应条件为：活化Taq酶95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。

1.7 数据统计分析

采用REST 2009软件分析毒素处理样品各目的基因mRNA表达水平的差异。

应用SPSS 13.0软件对数据进行显著性F检验及其相关性分析，各指标的测定均重复3个不同批次的细胞，每批细胞每个组重复3次，数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析 2.1 DON、ZEA联合暴露对体外培养鸡脾脏淋巴细胞内Ca²⁺水平的影响

由表 2可知，DON、ZEA联合暴露48 h后，鸡脾脏淋巴细胞内Ca²⁺水平随毒素浓度的升高而增加，各试验组均极显著高于空白对照组(P＜0.01)，除DZ-2与DZ-3组间没有显著差异(P > 0.05) 外，其余各试验组间差异显著或极显著(P＜0.05或P＜0.01)。由此表明，DON、ZEA联合暴露可导致体外培养鸡脾脏淋巴细胞内Ca²⁺水平随毒素浓度的升高而增加，具有显著的剂量依赖关系。

2.2 DON、ZEA联合暴露对体外培养鸡脾脏淋巴细胞内pH的影响

由表 2可知，DON、ZEA联合暴露48 h后，鸡脾脏淋巴细胞内pH随毒素浓度的升高而逐渐降低，各试验组均显著或极显著低于空白对照组(P＜0.05或P＜0.01)，同时各试验组间差异显著或极显著(P＜0.05或P＜0.01)。由此表明，DON、ZEA联合暴露可导致鸡脾脏淋巴细胞内pH随毒素浓度的升高而降低，具有显著的剂量依赖关系。

2.3 DON、ZEA联合暴露对体外培养鸡脾脏淋巴细胞内CaM mRNA表达水平的影响

由表 2可知，DON、ZEA联合暴露48 h后，除DZ-1组鸡脾脏淋巴细胞内CaM mRNA表达水平较空白对照组稍有降低(P > 0.05) 外，其余试验组均较空白对照组显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。各试验组间，鸡脾脏淋巴细胞内CaM mRNA表达水平随着毒素浓度的升高而升高，除DZ-1与DZ-2组差异不显著(P > 0.05) 外，其余各试验组间差异显著或极显著(P＜0.05或P＜0.01)。由此表明，DON、ZEA联合暴露可导致体外培养鸡脾脏淋巴细胞内CaM mRNA表达水平随毒素浓度的升高而增加(除DZ-1组低于空白对照组)，具有显著的剂量依赖关系。

2.4 DON、ZEA联合暴露对体外培养鸡脾脏淋巴细胞膜ATP酶活性的影响

由表 3可知，DON、ZEA联合暴露48 h后，鸡脾脏淋巴细胞膜Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶活性均随毒素浓度的升高而逐渐降低，各试验组均极显著低于空白对照组(P＜0.01)，同时各试验组间除DZ-3与DZ-4组差异显著(P＜0.05) 外，其余试验组间差异均极显著(P＜0.01)。由此表明，DON、ZEA联合暴露可导致体外培养鸡脾脏淋巴细胞膜ATP酶活性随毒素浓度的升高而降低，具有显著的剂量依赖关系。随毒素浓度的升高，Ca²⁺-ATP酶活性下降比Na⁺/K⁺-ATP酶活性下降明显，表明Ca²⁺-ATP酶对DON、ZEA更敏感。

3 讨论

Tonshin等^[8]研究表明，DON对小鼠肝脏线粒体内进行了氧化磷酸化，引起了线粒体的膜电位、H⁺、K⁺及其他离子水平的变化，线粒体肿胀，K⁺渗透性增强，Ca²⁺也流出，损害了线粒体膜的功能，造成钙稳态失衡。彭双清等^[9]的研究表明，DON对体外培养的人心肌细胞B、L、T三型Ca²⁺通道均有明显的阻滞作用，减少三型Ca²⁺通道的开放概率，缩短开放时间，延长关闭时间。上述研究结果说明DON能够导致小鼠肝细胞及人心肌细胞内的钙稳态失衡，干扰与Ca²⁺相关的信号传导，导致细胞功能障碍。而细胞内Ca²⁺超载在细胞凋亡过程中发挥重要作用。研究表明，细胞内Ca²⁺超载主要通过激活Ca²⁺/Mg²⁺依赖性核酸内切酶和激活Ca²⁺/CaM依赖性相关酶活性而诱导细胞凋亡^[10]。细胞内Ca²⁺超载与线粒体功能关系密切，一方面，线粒体作为细胞内钙存储器而在细胞内Ca²⁺内环境稳定过程中发挥重要作用^[11]，线粒体功能受损所引起的ATP水平降低直接介导细胞内Ca²⁺水平增加^[12]；另一方面，细胞内Ca²⁺超载可以促进线粒体氧化磷酸化解耦联与线粒体通透性转移孔的开放，这将导致氧化磷酸化作用的抑制、质子动力势降低、线粒体肿胀、线粒体内Ca²⁺释放进入胞浆而促进细胞死亡^[13]。本研究发现，DON、ZEA联合暴露导致体外培养鸡脾脏淋巴细胞内Ca²⁺超载，造成线粒体功能障碍，这可能是DON、ZEA导致鸡脾脏淋巴细胞发生凋亡的一条重要机制，这与Busk等^[14]应用定量蛋白质组学分析ZEA对人的肾上腺皮质细胞株H295R的影响时发现ZEA影响氧化磷酸化途径和线粒体功能障碍的途径相一致。

细胞内Ca²⁺水平是由多种因素所调控的，除线粒体对细胞内Ca²⁺水平的调控作用外，细胞膜Na⁺/K⁺-ATP酶与Ca²⁺-ATP酶在细胞内Ca²⁺内环境稳态过程中发挥重要作用，它们主要参与将胞浆内游离Ca²⁺跨越细胞膜转移到细胞外液过程，同时还参与其他离子转运及ATP合成；若二者活性降低，将导致胞浆内Ca²⁺超载^[15]，而CaM是真核细胞内Ca²⁺的重要受体，通过传递Ca²⁺调节细胞功能的各种信息。当细胞内Ca²⁺达到一定水平(＞10 μmol/L)时，Ca²⁺便与CaM结合，使CaM活化，被活化的CaM再去激活Ca²⁺-ATP酶，使细胞质内维持较低水平的钙，行驶第二信使的功能^[16]。本研究结果表明，不同剂量的DON、ZEA联合暴露均可使鸡脾脏淋巴细胞膜Na⁺/K⁺-ATP酶与Ca²⁺-ATP酶活性显著或极显著降低，这可能是细胞内Ca²⁺超载的原因之一。Na⁺/K⁺-ATP酶与Ca²⁺-ATP酶均为ATP依赖性酶，细胞内充足的ATP对于维持二者的功能很必要，线粒体呼吸功能抑制而导致的细胞内ATP水平降低将会导致Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶活性受到抑制^[17]。本研究中2种ATP酶活性的降低可能是由于DON、ZEA对细胞膜的氧化损伤和对细胞内能量代谢的干扰^[18]。本试验中，各试验组体外培养鸡脾脏淋巴细胞内CaM mRNA表达水平显著或极显著高于空白对照组，说明DON、ZEA可通过影响胞内钙池释放Ca²⁺，使细胞内Ca²⁺水平升高，Ca²⁺便与CaM结合，使CaM活化，被活化的CaM再去激活Ca²⁺-ATP酶，使细胞质内维持较低的Ca²⁺水平，而Ca²⁺-ATP酶活性降低，不能将进入细胞内的Ca²⁺及时排出，从而呈现胞内Ca²⁺的超载，这可能是鸡脾脏淋巴细胞发生凋亡的一条重要机制。

细胞内环境稳定是维持细胞正常功能的必要条件，细胞膜Ca²⁺-ATP酶，它分解1个ATP分子可将1~2个Ca²⁺跨膜转移到胞外，同时以1 : 2比例将H⁺转运到细胞内，使离子交换结果为电中性，质膜两侧膜电位差不致影响Ca²⁺的转运，细胞膜特别是质膜的Na⁺/Ca²⁺交换，已被认为是钙稳态调节过程中的一个重要组分，而酸碱平衡的调节则是内环境稳定的前提。细胞内pH的调节是通过离子转运机制以及胞浆强大的缓冲能力来完成的，这种离子转运机制包括：Na⁺/H⁺对流、ATP驱动的H⁺泵以及几种碳酸氢盐交换器，而Na⁺/H⁺对流在细胞调控pH中起主要作用^[19]。细胞内酸化程度与细胞凋亡发生率存在量效关系，研究表明，细胞内pH变化直接参与线粒体介导的细胞凋亡，而胞内酸化可以促进细胞色素c介导的半胱天冬酶的激活^[20]。本研究发现，DON、ZEA联合暴露可引起体外培养鸡脾脏淋巴细胞内pH降低，因此，可以认为DON、ZEA所致的线粒体膜功能受损是胞内酸化的主要原因，而胞内酸化又进一步促进细胞凋亡。

4 结论

DON、ZEA联合暴露导致体外培养鸡脾脏淋巴细胞内环境稳态失衡，主要包括细胞内Ca²⁺超载(上调细胞内CaM mRNA表达、增加细胞内Ca²⁺水平)、胞内酸化、细胞膜ATP酶(Na⁺/K⁺-ATP酶与Ca²⁺-ATP酶)活性降低。

致谢: 感谢东北农业大学动物医学院徐世文教授、李艳飞教授、李金龙教授、王伟老师、张志刚老师、张子威博士、苏健硕士、张博硕士、关博硕士在试验期间给予的帮助。