2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
2. Institute of Animal Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
鸡蛋作为高营养的畜禽产品,在我国产量和需求量大。目前,鸡蛋安全事故频发,如2005年我国苏丹红事件、2013年美国毒鸡蛋事件以及2014年德国假鸡蛋事件。镉(Cd)、铬(Cr)、铅(Pb)为强毒性的3种重金属元素,近年来,随着现代工农业发展,空气、土壤、水质中3种重金属严重超标,进而蓄积于农作物中,造成饲料原料中Cd、Cr、Pb污染。同时,为降低成本,部分商家在饲料中使用劣质矿物质,亦会造成配合饲料中3种重金属超标[1-2]。饲料重金属污染是鸡蛋重金属污染的主要途径,且3种重金属对动物和人类有严重的毒害作用,蛋鸡饲料和鸡蛋一旦受到3种重金属污染将很难消除。因此,评估畜禽养殖大省(四川、山东、河北省)蛋鸡养殖配合饲料中Cd、Cr、Pb污染情况,对3个省目前鸡蛋安全、养殖环节饲料质量安全评估具有重要意义。
Cd、Cr、Pb的检测技术主要包括传统锐线光源原子吸收光谱法(AAS)[3-4]、电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)[5-6]和高分辨率连续光源原子吸收光谱法(high resolution-continuum source atomic absorption spectrometry,HR-CS FAAS)[7-9]。因传统方法不能同时测定多种元素,目前使用较少,ICP-MS因仪器昂贵难以普及,而HR-CS FAAS因可同时测定多种元素,仪器成本相对较低,故应用较广。孟君等[8]采用湿法消解-火焰原子吸收光谱法测定河南省某养鸡场饲料和鸡蛋中的微量元素,测定结果表明:饲料中Pb、Cd的含量均超过我国《饲料卫生标准》限量,且对应的鸡蛋中Pb、Cd含量亦较高。原泽鸿等[5]使用ICP-MS测定四川省蛋鸡配合饲料及鸡蛋中的13种重金属含量,结果发现蛋鸡配合饲料中Cd含量未超过我国《饲料卫生标准》限量(0.5 mg/kg),但Cr和Pb含量(10和5 mg/kg)均超标,其超标率分别为11.1%和18.2%。涂杰峰等[10]采集福建省19种水产饲料共96个样品进行重金属含量检测,结果Pb含量为0.05~3.52 mg/kg,未超过水产饲料的安全限量(5 μg/g);Cd、Cr含量分别为0.08~3.05 mg/kg、1.28~20.26 mg/kg,部分样品Cd、Cr含量均超过水产饲料的安全限量(Cd:3 mg/kg;Cr:10 mg/kg),Cr含量超标严重。王飞等[11]对华北地区畜禽饲料中重金属含量调查分析表明,不同畜禽养殖场饲料差异变异较大,猪饲料和肉牛饲料中重金属超标最为严重,肉鸡饲料、蛋鸡饲料及奶牛饲料次之,参照我国《饲料卫生标准》,所有畜禽样品中Cd含量均未超标,但Cr、Pb含量均有不同程度的超标现象,肉牛饲料中Cr、Pb含量的超标率为83.33%、66.67%;奶牛饲料中Cr含量的超标率为60.00%;蛋鸡配合饲料中Pb含量的超标率为53.85%。朱建春等[12]测定陕西省11个地区64家规模化养殖场育肥猪饲料中重金属含量,结果表明,饲料中Cd、Cr、Pb含量均超过国家标准限量,其最高超标倍数分别为110.86、5.44、7.67。
综上所述,饲料中重金属污染严重,且重金属在禽蛋中的蓄积有逐年增加的趋势和风险[13]。四川、山东、河北省皆为畜牧业大省,同时也是现代工业发达地区,环境污染严重,给畜禽健康养殖造成一定威胁,目前对3个省3种重金属的风险因子的地区分布图报道较少。因此,本试验旨在采用HR-CS FAAS同时测定我国四川、山东、河北省蛋鸡养殖场蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量,评估蛋鸡养殖大省3种重金属污染程度,为蛋鸡配合饲料和鸡蛋安全评价提供数据基础。
1 材料与方法 1.1 样品采集产蛋高峰期蛋鸡配合饲料样品采集时间:2016年1月至2016年8月;地点:四川、山东、河北省(包括京津冀地区,以下统称河北省)67个不同规模蛋鸡养殖场,每个养殖场平行采集4份样品,每份样品500 g,共268份蛋鸡配合饲料样品。按照《饲料采样》(GB/T 14699.1—2005)[14]标准采集四川省1个省会城市、6个地级市,地域涵盖四川省东、西、南、北部共16个不同规模蛋鸡养殖场的饲料样品64份;山东省1个省会城市、24个地级市共25个不同规模蛋鸡养殖场的饲料样品100份;河北省4个地级市、2个周边城市(天津蓟县及北京大兴、延庆地区)共26个不同规模蛋鸡养殖场的饲料样品104份。所有饲料样品均-20 ℃保存,待测。四川、山东、河北省蛋鸡配合饲料采样分布表见表 1。
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表 1 四川、山东、河北省蛋鸡配合饲料采样分布表 Table 1 Sampling distribution of compound feed of laying hens in Hebei, Shandong and Sichuan provinces |
蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量采用HR-CS FAAS进行测定,具体方法如下:蛋鸡配合饲料样品经粉碎过40目筛,准确称取0.5 g于聚四氟乙烯消解罐中,加入8 mL硝酸(HNO3)和2 mL双氧水,置于恒温加热仪预消解30 min后采用微波消解仪消化,用体积分数为0.5% HNO3溶液定容至25 mL容量瓶,摇匀,待测。HR-CS FAAS工作条件见表 2。
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表 2 HR-CS FAAS工作条件 Table 2 Working conditions of HR-CS FAAS |
主要仪器:ContrAA-700高分辨率连续光源原子吸收光谱仪(配备MPE-60自动进样器,Analytik Jena公司,德国);CEM-MARS6型智能微波消解仪(美国);BHW-09Y型恒温加热仪(上海博通化学科技有限公司)。
主要试剂:HNO3、30%(体积分数)过氧化氢(均为优级纯,广东西陇化工);Cd、Cr、Pb标准溶液(1 000 μg/mL)均购自国家标准物质中心,试验时稀释至所需浓度;试验用水为纯水系统(Milipore公司,美国)制备的18.2 mΩ·cm超纯水。
1.4 统计分析采用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析,不同区域(四川、山东、河北省)及不同规模蛋鸡养殖场的蛋鸡配合饲料用Duncan氏法进行多重比较,以P<0.05作为差异显著性判断标准,结果均以平均值±标准差表示。
2 结果 2.1 HR-CS FAAS的分析速度、准确性和检出限由表 3可知,采用HR-CS FAAS同时测定1个饲料样品中Cd、Cr、Pb 3种元素仅需2 h;Cd、Cr、Pb的回收率分别为96.0%~101.0%、98.6%~99.9%、95.4%~101.3%;检出限(LOD)分别为1.7、19.7、34.6 ng/mL。因此,本试验采用HR-CS FAAS准确快速,可用于蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量的测定。
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表 3 HR-CS FAAS的分析速度、准确性和检出限 Table 3 The analysis speed, recovery and LOD of HR-CS FAAS |
由表 4、表 5和表 6可知,四川省7个城市64份蛋鸡配合饲料中Cd含量均未超标,最大检出值所在城市为成都市。成都、德阳、乐山、雅安市蛋鸡配合饲料中Cd含量的最大检出值分别为0.48、0.44、0.41、0.41 mg/kg,趋近我国《饲料卫生标准》[15]限量标准(0.5 mg/kg),有超标风险。成都、德阳、绵阳、南充、雅安市蛋鸡配合饲料中Cr和Pb含量均未超标,乐山市蛋鸡配合饲料中Cr、Pb含量均超标,超标率分别为30%、45%,超标样品平均值分别为13.45、8.67 mg/kg,最大检出值分别为15.94、14.12 mg/kg;崇州市蛋鸡配合饲料中Pb含量超标,超标率为50%,超标样品平均值为5.59 mg/kg。整体来看,四川省蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量最大检出值所在城市分别为成都、乐山、乐山市;Cr、Pb含量最高超标率所在城市分别为乐山、崇州市。
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表 4 四川省蛋鸡配合饲料中Cd含量 Table 4 Contents of cadmium in compound feed of laying hens in Sichuan province |
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表 5 四川省蛋鸡配合饲料中Cr含量 Table 5 Contents of chromium in compound feed of laying hens in Sichuan province |
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表 6 四川省蛋鸡配合饲料中Pb含量 Table 6 Contents of lead in compound feed of laying hens in Sichuan province |
由表 7、表 8和表 9可知,山东省9个城市100份蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量均未超过我国《饲料卫生标准》相关限量标准,重金属污染程度相对较轻。蛋鸡配合饲料中Cd含量最大检出值以青岛和日照市最高,皆为0.45 mg/kg,平均值含量以烟台和日照市最高,分别为0.31和0.34 mg/kg;Cr含量最大检出值以菏泽和德州市为最高,分别为6.17和5.88 mg/kg,平均值含量以菏泽和聊城市最高,分别为5.42和4.95 mg/kg;Pb含量最大检出值以烟台和日照市为最高,分别为3.88和4.11 mg/kg,平均值含量以烟台和临沂市为最高,分别为3.14和3.03 mg/kg。
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表 7 山东省蛋鸡配合饲料中Cd含量 Table 7 Contents of cadmium in compound feed of laying hens in Shandong province |
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表 8 山东省蛋鸡配合饲料中Cr含量 Table 8 Contents of chromium in compound feed of laying hens in Shandong province |
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表 9 山东省蛋鸡配合饲料中Pb含量 Table 9 Contents of lead in compound feed of laying hens in Shandong province |
由表 10、表 11和表 12可知,河北省6个城市104份蛋鸡配合饲料中Cd含量均未超过我国《饲料卫生标准》限量标准,最大检出值以张家口和保定市为最高,分别为0.45和0.44 mg/kg,城市平均值含量由高到低依次为张家口>保定>高碑店>廊坊>天津>北京;张家口和保定市蛋鸡配合饲料中Cr含量最大检出值分别为18.35和15.38 mg/kg,均超过我国《饲料卫生标准》限量标准(10 mg/kg),超标率分别为20.00%和7.50%,超标样品平均值为17.44和13.02 mg/kg;张家口、保定和天津市蛋鸡配合饲料中Pb含量最大值分别为8.02、8.38和7.32 mg/kg,均超过我国《饲料卫生标准》限量标准(5 mg/kg),超标率分别为20.00%、12.50%和15.00%,超标样品平均值分别为7.54、6.81和6.43 mg/kg。与其他城市相比,张家口市配合饲料中Cr和Pb含量超标率最高,污染程度最为严重,其次为保定市。
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表 10 河北省蛋鸡配合饲料中Cd含量 Table 10 Contents of cadmium in compound feed of laying hens in Hebei province |
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表 11 河北省蛋鸡配合饲料中Cr含量 Table 11 Contents of chromium in compound feed of laying hens in Hebei province |
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表 12 河北省蛋鸡配合饲料中Pb含量 Table 12 Contents of lead in compound feed of laying hens in Hebei province |
由表 13可知,3省蛋鸡配合饲料中Cd含量无显著差异(P>0.05),其平均含量由高到低依次为山东省>河北省>四川省,均未超过我国《饲料卫生标准》(0.5 mg/kg)。四川、河北省配合饲料中Cr含量均有超标现象,超标率分别为9.38%、6.73%,超标样品平均值分别为13.45、15.55 mg/kg。四川省蛋鸡配合饲料中Cr含量与山东和河北省无显著差异(P>0.05),河北省的平均含量显著高于山东省(P<0.05)。四川、河北省蛋鸡配合饲料中Pb平均含量亦显著高于山东省(P<0.05),且均超过我国《饲料卫生标准》(5 mg/kg),超标率分别为17.19%、14.42%,超标样品平均值分别为8.11、6.93 mg/kg。
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表 13 3省蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量比较 Table 13 Comparison of Cd, Cr and Pb in compound feed of laying hens of three provinces |
根据本次采集蛋鸡养殖场规模范围,将3省养殖场分为小(小于1万只)、中小(1~2万)、中(2~5万)、大(大于10万)4个规模。由表 14可知,养殖场规模不同,蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量差异较大。小、中小、中规模养殖场蛋鸡配合饲料中Cr、Pb含量均有超标,而大规模养殖场蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量均未超标。从不同规模养殖场蛋鸡配合饲料中Cd、Cr平均含量来看,总体趋势为小规模养殖场>中小规模养殖场>中规模养殖场>大规模养殖场,且小规模养殖场显著高于大规模养殖场(P<0.05);从Pb平均含量来看,中规模含量最高,大规模含量最低,且中、小、中小规模养殖场显著高于大规模养殖场(P<0.05)。3种重金属以Pb含量超标最高,污染最为严重,特别是中小、小规模养殖场。
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表 14 不同规模养殖场蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量 Table 14 Contents of Cd, Cr and Pb in compound feed of laying from different scale farms |
本次调查结果因地域和养殖场规模不同,蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量差异较大。四川省以乐山、崇州市蛋鸡配合饲料中Cr、Pb含量超标严重,其他城市均无超标。乐山、崇州市采集的样品主要来自小、中小规模养殖场,配合饲料原料来源复杂,饲料加工、运输技术粗糙可能为超标率高的主要原因。四川省有1个养殖场的蛋鸡配合饲料中Pb含量超过美国Mineral Tolerance of Animals限量标准(10 mg/kg),主要原因可能为所使用的配合饲料原料、添加剂等劣质,养殖户自配料操作过程不规范。工业相对发达的成都、德阳、绵阳市等地蛋鸡配合饲料中3种元素均未超标,重工业少的雅安市散养蛋鸡配合饲料3种重金属含量低。整体看,四川省蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量的超标率分别为0.00%、9.38%、17.19%,与原泽鸿等[5]采用ICP-MS测定四川省蛋鸡产蛋期配合饲料中Cd、Cr含量的超标率(Cd:0.00%;Cr:11.1%)相比,基本一致;而Pb的超标率本研究结果为9.38%,大于原泽鸿等[5]的0%,可能与样品数量差异大以及样品来源有关,原泽鸿等[5]饲料样品主要来自规模化的饲料厂商,而本次调查所采用的饲料样品主要来自中、小规模个体养殖户。
山东省蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量检出率为100%,但均未超标,相对四川、河北污染较轻。山东省采样规模仍然以中小规模为主,但3种元素均未超标,分析原因可能为山东饲料行业发展特点决定。主要特点为:一是自配料市场逐渐缩小;二是20%左右的小旧企业被淘汰,行业总体素质大幅提升;三是大型企业借低势扩张势头不减;四是受原料价格低、养殖形式普遍恢复的利好带动,中小企业效益普遍向好。另外,山东省环境状况公报显示,山东省环境污染主要以大气污染和水体污染为主,全省城市大气污染物为可吸入颗粒物,平均占污染负荷的40%左右,其次为二氧化硫,占污染负荷的30%左右,而重金属污染相对较轻[16]。
河北省蛋鸡配合饲料中Cr、Pb含量超标的主要城市为张家口和保定市,这可能因畜禽养殖场主要集中在张家口和保定市,畜禽粪便中重金属流入土壤、水造成环境污染,进而蓄积在饲料原料中,造成恶性循环[17],同时为化工业重点发展区域,环境中土壤[18]、水[19]、空气受到不同程度污染也是可能原因之一;而环境污染严重的北京市样本未超标可能为采集的样本为较大规模蛋鸡养殖场,养殖场分布于生态涵养保护区和城市发展新区的缘故。王飞等[11]报道,华北地区(包含山东、河北省)蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量的超标率分别为0.00%、34.86%、53.85%,高于本研究山东、河北省蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量的超标率(山东省均无超标;河北省Cd、Cr、Pb含量超标率分别为0%、6.73%、14.42%),可能因华北区域包含广,样品来源复杂,部分样品来自污染区以及近2年监管部门对蛋鸡配合饲料中重金属的监管力度加大有关。
3个省综合对比,山东省蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量均未超过我国《饲料卫生标准》限量标准,污染较轻,但四川、河北省配合饲料中Cr、Pb含量均有不同程度超标,污染严重,且显著高于山东省,且本次调查结果发现3省蛋鸡配合饲料中Cd含量均未超标,污染较轻,但最大检出值均接近我国《饲料卫生标准》限量标准(0.5 mg/kg),有超标风险,与原泽鸿等[5]、涂杰峰等[10]、王飞等[11]调查结果基本一致。Cr、Pb含量在四川、河北省蛋鸡配合饲料中均有不同程度超标,这可能与四川、河北省样品主要来自于中、小型养殖场,以及环境中土壤、水中重金属含量高有关[18-20]。
本次调查亦发现不同规模养殖场蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量由高到低大致趋势为小规模养殖场>中小规模养殖场>中规模养殖场>大规模养殖场,且大规模养殖场显著低于小规模养殖场。小、中小规模养殖场与大规模养殖场相比,饲料原料没有科学化、规模化的来源途径,导致配合饲料从源头上受到重金属污染严重。其次,由于中小型养殖场配合饲料多数为自配自给,矿物质添加剂的过量添加也会造成重金属污染。而整个配合饲料加工、运输、保管过程中机械、器皿的使用不当也是造成重金属污染的原因之一。
3.2 蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb可能污染来源蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb污染来源广泛,动、植物性饲料原料和矿物质添加剂为主要来源。动物性饲料原料包括骨粉、皮革蛋白粉和鱼粉中都含有过量的Cd、Cr、Pb,特别是掺杂使假的鱼粉[21-22]。植物性饲料原料主要包括玉米、玉米副产物、小麦、干酒糟及其可溶物(DDGS)、棉籽粕等能量饲料和蛋白质饲料,陈甫等[23]和柏雪等[24]分别对山东省肉鸡饲料原料和全国各地区饲料原料中微量元素进行调查,结果表明:不同饲料原料中Cd、Cr、Pb含量均有不同程度超标,且Cr和Pb含量在部分饲料原料中超标严重,特别是玉米和麦麸等饲料原料。矿物质添加剂添加过量,亦会造成饲料中Cd、Cr、Pb的污染[25],如饲料级磷酸盐是配合饲料中Cr的主要来源,饲料级脱氟磷酸盐和磷酸二氢钙的平均Cr含量分别达到110和83 mg/kg[1],而饲料级硫酸铜中的Pb含量可达640 mg/kg[2]。同时,随着现代工农业发展,特别是采矿和冶炼重工业地区肆意排放未经处理的废气[26]、废水[27]、废渣,以及农业生产中农药、化肥的滥用[27-28]都会造成饲料原料中Cd、Cr、Pb污染。此外,饲料原料加工过程中机械、器皿使用不当也是饲料中Cd、Cr、Pb污染的主要来源之一[28]。
3.3 蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb污染的危害Cd、Cr、Pb对人和动物毒害作用呈多系统和多器官性,具有致癌、致畸、致突变的作用[29]。Cd进入动物体内缓慢蓄积而引起慢性中毒,主要损害动物肾小管的重吸收功能,引起蛋白尿、氨基酸尿和糖尿,同时Cd中毒也可降低蛋鸡的生产性能、免疫能力以及蛋品质[29-31]。Cr在动物体内以Cr3+和Cr6+形式存在,Cr3+可协助胰岛素发挥作用,为糖和胆固醇代谢所必需,但Cr6+对动物有毒害作用,可影响动物体内氧化、还原、水解过程,沉淀核酸、核蛋白,干扰酶系统等[32]。操继越[33]研究发现,低剂量的Cr(<10 mg/kg)可促进产蛋,提升蛋品质(提高蛋品厚度和强度),高剂量的Cr(>600 mg/kg)可显著降低孵化率,且造成肝脏、肾脏受损。Pb中毒主要损害动物造血器官和肾脏,对呼吸、免疫和胚胎发育也有一定的毒害作用[34]。Pb是蛋鸡体内非必需元素,具有较强的蓄积性和毒性,高剂量的Pb(100 mg/kg)可降低蛋鸡活体重、胴体重、净膛新鲜胴体重以及抗氧化能力和蛋品质,影响肝脏和血清中脂肪酸的形成[35-36]。Jeng等[37]研究发现,蛋鸡饮用1.3 mg/kg Cd、6.7 mg/kg Pb的水,其体重、产蛋量、蛋重均显著降低。饲料中Cd、Cr、Pb含量蓄积于鸡蛋被人类食用之后,会导致婴儿及青少年智力发育迟缓,听力退化,损伤其肾功能和心血管系统[38-39]。本次调查研究发现,四川、山东、河北省蛋鸡配合饲料中Cd含量虽未超标,但已接近限量值,长期摄入蓄积量大,危害严重。四川、河北省蛋鸡配合饲料中Cr、Pb含量均有不同程度超标,超标率分别为四川:9.38%、17.19%;河北:6.73%、14.42%。同时亦发现,小规模养殖场蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量显著高于大规模养殖场。因此,蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb的污染应引起3省饲料厂商和监管部门的高度重视,定期抽检蛋鸡配合饲料及鸡蛋中Cd、Cr、Pb含量势在必行。此外,配合饲料原料来源比较复杂,不同批次的蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量可能存在一定差异,因此,需进一步采集并分析不同批次3省的蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量,进一步明确3省蛋鸡配合饲料中3种重金属的动态污染及分布规律。
4 结论① 四川省蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量最大检出值所在城市分别为成都、乐山、乐山,最大检出值分别为0.48、15.94、14.12 mg/kg,Cr、Pb含量最高超标率所在城市分别为乐山、崇州,超标率分别为30%、50%。山东省Cd、Cr、Pb含量最大检出值所在城市分别为青岛和日照、菏泽、日照,最大检出值分别为0.45、5.88、4.11 mg/kg。河北省Cd、Cr、Pb含量最大检出值所在城市分别为张家口、张家口、保定,最大检出值分别为0.45、15.38、8.38 mg/kg,Cr、Pb含量最高超标率所在城市分别为张家口和保定,超标率均为20%。
② 3省蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb平均含量分别为,四川:0.24、5.01、3.67 mg/kg;山东:0.26、4.19、2.61 mg/kg;河北:0.25、5.66、3.25 mg/kg。参照我国《饲料卫生标准》,3省蛋鸡配合饲料中Cd含量及山东省Cd、Cr、Pb含量均未超标;四川、河北省Cr、Pb含量超标率分别为,四川:9.38%、17.19%;河北:6.73%、14.42%。河北省蛋鸡配合饲料中Cr、Pb平均含量显著高于山东省。山东省蛋鸡配合饲料污染较轻,受检样品中Cd、Cr、Pb含量均未超标,四川、河北省蛋鸡配合饲料中Cd含量未超标,但有超标风险,Cr、Pb含量均有不同程度超标,Pb含量超标最为严重,应引起重视。
③ 不同规模养殖场蛋鸡配合饲料中Cd、Cr、Pb含量差异较大,大规模养殖场显著低于小规模养殖场。
致谢: 感谢四川农业大学动物营养研究所万建美和万海峰博士、山东中慧饲料有限公司王亮、河北金朝生物科技有限公司亓宏伟博士在蛋鸡养殖场采样中给予的帮助。[1] | SULLIVAN T W, DOUGLAS J H, GONZALEZ N J. Levels of various elements of concern in feed phosphates of domestic and foreign origin[J]. Poultry Science, 1994, 73(4): 520–528. DOI: 10.3382/ps.0730520 |
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