2. 西北农林科技大学, 杨凌 712100;
3. 天津农学院, 天津 300384
2. Northwest A & F University, Yangling 712100, China;
3. Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China
近年来抗生素用作饲料添加剂所引起的药物残留、细菌耐药性等问题已经引起公众的严重不安。联合国粮农组织(FAO)于1997年和1998年先后2次要求禁止和淘汰使用抗生素饲料添加剂，欧盟也于2006年全面停止使用抗生素生长促进剂。抗生素类饲料添加剂在全球范围内的禁用已成为必然趋势。因此，寻找抗生素替代物、完全替代或减少抗生素使用量已经成为当前研究的热点，而以乳酸菌为代表的益生素就是其中重要的一个研究对象。诸多研究发现，饲粮中添加乳酸菌制剂可调节肠道菌群[1]，维护肠道结构和功能的完整性[2-3]，调节免疫系统，预防和治疗肠道炎症[4-5]，改善和提高动物生产性能[6]，提高母猪所产仔猪窝重以及增加仔猪存活数[7]，提高仔猪抗氧化水平[8]。但乳酸菌在猪方面的研究主要集中在对仔猪生长性能和抗腹泻作用的影响，而关于其对肥育猪生长性能和肠道屏障功能方面的影响却鲜有报道。本试验在无抗饲粮中添加单一菌种——乳酸片球菌，研究其对肥育猪生长性能及肠道抗氧化能力、形态结构和菌群的影响，为乳酸片球菌在肥育猪上的应用提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 菌种来源乳酸片球菌由山东宝来利生物工程股份有限公司提供，活菌数≥1.0×1010 CFU/g。
1.2 试验设计选取体重为(62.46±1.20) kg的“杜×长×大”杂交肥育猪48头，按体重相近、性别比例一致原则，随机分为2组，每组4个重复，每个重复6头猪，公母各占1/2。对照组饲喂基础饲粮，基础饲粮为粉料，参照NRC(2012) 猪营养需要配制，其组成及营养水平见表 1。试验组饲喂在基础饲粮中添加了0.1 g/kg乳酸片球菌制剂(1.0×1010 CFU/g)的试验饲粮。试验期56 d。试验期间，每天喂料4次，自由采食和饮水。第56天每个重复选取1头体重接近平均值的肥育猪，停食、停水12 h后进行屠宰。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
在试验期开始和结束当天07：00分别对每栏猪逐头空腹称重，结算耗料量，以重复为单位，计算试验猪平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.3.2 肠道抗氧化能力样品前处理：称取适量肠道组织，置液氮预冷的研钵中研磨成粉末(期间不断加入液氮)，然后按质量(g):体积(mL)=1:9加入匀浆介质(冷生理盐水)，混匀，4 000 r/min离心10 min，吸取上清于1.5 mL EP管中。采用试剂盒测定上清中总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3.3 组织切片屠宰后，无菌剪取十二指肠、空肠、回肠段各0.5 cm，用生理盐水漂洗，4%多聚甲醛进行固定，常规制作石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色，用光学显微镜(RM2235 LEICA)对切片进行观察测量，每个样本观察2个非连续切片，从不同的视野中选取6根完整的绒毛进行长度测量，测定绒毛高度以及隐窝深度，绒毛高度是指从其顶端至根部的距离，隐窝深度是指从相邻2根绒毛根部至基底部的距离。
1.3.4 肠道菌群培养及计数试验结束时，将肥育猪禁食(自由饮水)12 h后，颈静脉放血致死，剖腹后，立即用棉线结扎空肠、回肠和盲肠中段约5 cm各1段，无菌剪下放入自封袋，4 ℃冰箱保存，待取样结束后，立即运回实验室进行肠道菌群培养及计数。在无菌操作台上称取0.5~1.0 g的食糜，按质量比为1:9加入已除氧的灭菌生理盐水，振荡摇匀后静置，此为10-1倍稀释液；直至稀释到10-7倍。将食糜样的10-5~10-7稀释液分别涂布于BL琼脂培养基计数双歧杆菌、MRS肉汤培养基计数乳酸菌。10-4~10-6稀释液涂布于伊红美蓝琼脂(EMB)培养基计数大肠杆菌。双歧杆菌和乳酸菌均37 ℃厌氧培养48 h，大肠杆菌于37 ℃有氧培养24 h。每个稀释梯度重复2次，最后取2次计数的平均值。粪便细菌的数量用lg(CFU/g)表示，即每克粪便中含菌落总数的自然对数[9]。
1.4 数据统计与分析所有试验数据先用Microsoft Office 2013中的Excel程序进行整理，运用SPSS 19.0中的独立样本t检验，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 乳酸片球菌对肥育猪生长性能的影响由表 2可知，与对照组相比，试验组平均日采食量、平均日增重及料重比均差异不显著(P＞0.05)。
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表 2 乳酸片球菌对肥育猪生长性能的影响 Table 2 Effects of Pediococcus acidilactici on growth performance of finishing pigs (n=8) |
由表 3可知，与对照组相比，试验组十二指肠GSH-Px活性显著增加(P < 0.05)，而T-AOC、T-SOD以及CAT活性均差异不显著(P > 0.05)；试验组空肠T-AOC、T-SOD活性显著提高(P < 0.05)，而GSH-Px以及CAT活性均差异不显著(P > 0.05)；试验组回肠CAT活性显著增高(P < 0.05)，而T-AOC、T-SOD以及GSH-Px活性均无显著差异(P > 0.05)。
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表 3 乳酸片球菌对肥育猪肠道抗氧化能力的影响 Table 3 Effects of Pediococcus acidilactici on intestinal antioxidant function of finishing pigs (n=8) |
由表 4可知，与对照组相比，试验组十二指肠中隐窝深度显著降低(P < 0.05)，黏膜厚度、肠壁厚度以及绒毛高度/隐窝深度显著增加(P < 0.05)，绒毛高度差异不显著(P > 0.05)；试验组空肠隐窝深度显著降低(P < 0.05)，绒毛高度/隐窝深度显著升高(P < 0.05)，绒毛高度、黏膜厚度以及肠壁厚度均差异不显著(P > 0.05)；在回肠中，试验组绒毛高度显著升高(P < 0.05)，但隐窝深度、黏膜厚度、肠壁厚度以及绒毛高度/隐窝深度均差异不显著(P > 0.05)。
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表 4 乳酸片球菌对肥育猪肠道形态结构的影响 Table 4 Effects of Pediococcus acidilactici on intestinal morphological structure of finishing pigs (n=8) |
由表 5可知，在肥育猪空肠中，试验组双歧杆菌数量与对照组相比没有显著差异(P > 0.05)，乳酸菌数量以及定植抗力显著增加(P < 0.05)，大肠杆菌数量显著降低(P < 0.05)。在回肠、盲肠中试验组双歧杆菌、乳酸菌、大肠杆菌以及定植抗力均与对照组相比没有显著差异(P > 0.05)。
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表 5 乳酸片球菌对肥育猪肠道菌群的影响 Table 5 Effects of Pediococcus acidilactici on intestinal microflora of finishing pigs (n=8) |
早在1947年就有研究人员证实，用乳酸乳杆菌饲喂仔猪可有效改善猪的健康状况，增加猪的体重[10]。何颖等[11]研究结果显示，NS复合乳酸菌对63~150日龄段肉猪的平均日增重具有一定调节作用并提高其饲料报酬。张天阳等[12]研究表明，饲喂乳酸菌可以促进生长肥育猪的生长发育，提高饲料转化率。李涛[13]研究表明，饲喂乳酸菌发酵的饲料后可显著提高仔猪平均日增重并降低料重比。曹玮娜等[14]研究表明，在饮水中添加植物乳酸菌能提高獭兔生长性能。本试验中，在饲粮中添加0.1 g/kg的乳酸片球菌后，试验组平均日增重提高了2.3%、料重比降低了1.8%，与上述研究结果基本一致。这可能是由于乳酸片球菌进入肠道后改善肥育猪肠道形态结构以及菌群结构，进而促进营养物质的消化吸收，促进其生长[8]。
3.2 乳酸片球菌对肥育猪肠道抗氧化能力的影响在正常情况下，机体内自由基的产生和清除是处于动态平衡的状态。但由于各种原因导致机体自由基产生增多或机体清除自由基的能力下降时，机体就会出现氧化应激[15]。尽管机体的各个部位都有可能发生氧化应激，但由于肠道是机体消化吸收食物中营养物质的主要场所，消化酶将食物分解成小分子物质的同时也会产生铁、铜、醛以及脂质过氧化物等多种致氧化因子，使得肠道成为最易受到自由基攻击的部位[16-17]。目前，关于乳酸菌的抗氧化机制主要有2种观点：1) 乳酸菌在肠道中裂解并释放出胞内物质，而乳酸菌胞内含有超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px，当乳酸菌裂解后，这些抗氧化酶向周围环境释放并发挥抗氧化功能[18-20]。2) 过氧化氢可与铜铁离子作用产生有毒性的羟自由基，而乳酸菌具有清除过渡族金属离子的作用，从而阻断氧化反应的发生[21-22]。
SOD、CAT和GSH-Px是生物机体内重要的抗氧化酶，发挥着活性氧自由基清除剂的作用，T-AOC可作为衡量动物机体抗氧化能力的综合指标。李涛[13]研究表明，饲喂乳酸杆菌可显著提高仔猪血清中SOD以及GSH-Px活性，显著降低MDA含量。胡晓丽[23]给饲喂高铁饲粮的小鼠灌服乳酸菌后可提高小鼠结肠T-AOC、CAT、SOD和GSH-Px活性。本试验表明，添加乳酸片球菌可增加十二指肠GSH-Px活性、空肠T-AOC和T-SOD活性以及回肠CAT活性, 与李涛[13]、胡晓丽[23]研究的试验结果基本一致，说明添加乳酸片球菌可提高肥育猪肠道的抗氧化能力。
3.3 乳酸片球菌对肥育猪肠道形态的影响小肠是动物机体消化吸收的主要场所，对营养物质的消化、吸收和转运起着重要的作用[24]。肠道黏膜由黏膜上皮、固有膜和黏膜肌层共同构成[25]。肠道绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度是衡量肠道消化吸收的重要指标[26]。绒毛增长，其与营养物质的接触面积增大，有利于营养物质的吸收；隐窝深度则反映了肠上皮细胞的更新速度，隐窝变浅则说明肠上皮细胞生成率降低，更新减慢；绒毛高度/隐窝深度则综合反映了小肠的功能状态，比值增大说明肠内膜面积大，单位面积绒毛细胞数增多，消化吸收的功能增强[27-29]。
崔志文[30]研究表明，给断奶仔猪饲喂鼠李糖乳杆菌后其空肠绒毛高度/隐窝深度、绒毛高度分别极显著增加了34.93%和13.92%，隐窝深度降低了14.53%。庞敏等[31]研究表明，唾液乳酸菌主要通过降低肠隐窝深度、增加肠绒毛高度/隐窝深度来抵御大鼠急性腹泻。侯改凤等[32]报道，在饲粮中添加0.1%德氏乳杆菌后肥育猪小肠绒毛高度增加，十二指肠和回肠的隐窝深度降低，小肠的绒毛高度/隐窝深度增加。本试验中，添加0.1 g/kg乳酸片球菌可提高十二指肠、空肠、回肠绒毛高度，其中显著提高回肠绒毛高度；显著降低十二指肠和空肠的隐窝深度；十二指肠、空肠和回肠绒毛高度/隐窝深度增加，其中十二指肠、空肠绒毛高度/隐窝深度增加显著。这说明乳酸菌具有改善肥育猪肠道黏膜形态以及维护肠道结构完整性的作用。
3.4 乳酸片球菌对肥育猪肠道菌群的影响肠道微生物通过参与动物机体多种生理功能而对宿主产生影响。肠道致病菌大量繁殖可能会对肠道造成一系列的损伤，因此，防止致病菌和条件致病菌在肠道的定植，形成定植抗力非常重要[33]，且大肠杆菌和乳酸菌被认为是指示肠道健康的主要菌群[34]。研究表明，乳酸杆菌在肠道中可产生乳酸、过氧化氢和细菌素等抗菌物质，通过竞争营养物质以及黏附位点来抑制致病菌，诱导黏附素分泌来增强肠道屏障作用，进而保护机体肠道[35]。何冬梅等[36]研究发现，在饮用活性乳酸菌饮料后可显著提高人体肠道内双歧杆菌以及乳酸菌的数量，降低产气荚膜梭菌的数量，具有调节肠道菌群的作用。李涛[13]研究表明，添加乳酸菌后可提高猪肠道菌群的多样性，维持肠道微生物区系稳态。刘辉等[37]研究表明，乳酸菌可降低生长猪粪便中大肠杆菌的数量，提高乳酸菌数量。楚青惠等[38]研究表明，在水中添加300 mL的乳酸菌液可使母猪粪便中的大肠杆菌、沙门氏菌的数量显著减少。王四新等[39]研究表明，猪源发酵乳酸杆菌可降低保育猪粪便中大肠杆菌的数量。本试验结果表明，添加乳酸片球菌可以增加空肠和回肠乳酸菌和双歧杆菌的数量及空肠的定植抗力、降低空肠中大肠杆菌数量，这与何冬梅等[36]的试验结果类似，表明添加乳酸片球菌可以促进肠道有益菌生长，抑制有害菌生长，调节肠道菌群平衡，继而改善肠道微生态环境。
4 结论饲粮添加0.1 g/kg乳酸片球菌(1.0×1010 CFU/g)能改善肥育猪肠道微生物区系和肠道形态结构，增强肠道抗氧化能力，进而促进肥育猪的肠道健康。
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