据不完全统计，鸡细菌性疾病占30%~40%，并且呈上升趋势，而在众多的细菌性疾病中，尤以大肠杆菌病和沙门氏菌病最为严重[1]，其发病率和死亡率高，造成的损失较大，被认为是危害养鸡业的主要细菌性疾病。目前，对鸡细菌性疾病的防治主要是依靠抗生素，但长期大量使用抗生素带来的耐药性问题和鸡肉食品安全问题日益突出。因此，有待开发抗菌活性高、低毒性、低残留、广谱的饲料添加剂以控制和预防肉鸡细菌多重感染性疾病的发生。植物提取物是以物理、化学和生物学手段从植物中提取的活性成分，其含量相对稳定、成分明确可测定，对动物和人类的毒副作用小。植物提取物具有抗微生物和抗氧化功能，能提高动物肠道健康和机体免疫功能，因其安全、高效、稳定和可控的特性，在动物生产中受到了广泛地关注[2]。目前，研究报道较多的天然植物提取物主要有皂甙、生物碱、多糖、茶多酚、黄酮类、挥发油(精油)等[3]。我国农业部允许在动物养殖中使用的植物提取物饲料添加剂包括：糖萜素、苜蓿提取物、杜仲叶提取物、大豆黄酮、紫苏籽提取物等。天然植物提取物除了可以通过调节机体的免疫功能起抗菌和抗病毒作用外，还对病原微生物有直接作用。研究表明，植物类挥发油、黄酮、多糖能体外抑制鸡源性病原菌[4-11]。已报道的具有较强抑菌作用的天然植物提取物主要有百里香精油、牛至精油、肉桂精油、大蒜油、黄芩黄酮、竹叶黄酮、黄芪多糖、小檗碱、苦参碱等。目前，关于不同植物提取物对不同病菌抑菌作用的研究报道较多，且具有抑菌效果的植物提取物较多。但由于试验条件不一致、植物提取物来源不同、供试菌菌种不同、研究方法不一致，得到的抑菌效果也有所不同。另外，关于植物提取物对鸡源致病菌体外抑菌效果的研究较少，且哪种植物提取物对鸡源致病菌的抑菌效果更好，还没有进行系统的研究。而且，关于植物提取物复合物的体外抑菌作用研究，目前国内外的报道还非常少。本研究选择已报道的具有较强体内和体外抑菌作用的10种植物提取物，研究其对鸡源致病菌(鸡大肠杆菌和鸡沙门氏菌)的抑菌作用，并从中分别筛选出对2种鸡源致病菌具有较强抑菌能力的3种植物提取物，将这些植物提取物进行复配，研究其复合物对2种鸡源致病菌的抑菌作用，进而获得比单一植物提取物抑菌能力更强的复合物，为下一步进行植物提取物对肉鸡的体内有效性评价试验和进而开发可替代抗生素的饲料添加剂以抑制致病菌生长、提高动物免疫力、预防鸡疾病发生提供科学试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料植物提取物：百里香精油(纯度为100%)，购自上海回恩国际贸易有限公司；牛至油(纯度为100%)，购自吉安盛海天然植物油有限公司；肉桂精油(纯度为100%)，购自吉安市盛海天然植物油有限公司；大蒜油(纯度为100%)，购自上海双源大蒜油有限公司；黄芩黄酮(纯度为80%)，由陕西弗森生物技术有限公司提供；竹叶黄酮(纯度为40%)，购自浙江圣氏生物科技有限公司；黄芪多糖(纯度为50%)，购自成都锦泰和医药化学技术有限公司；小檗碱(纯度为97%)，购自陕西森弗生物技术有限公司；苦参碱(纯度为98%)，购自陕西弗森生物技术有限公司；绿原酸(纯度为60%)，由山东禾本堂生物科技有限公司提供。
鸡源致病菌菌种：鸡大肠杆菌(CVCC 1569) 和鸡白痢沙门氏菌(CVCC 79301) 均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
主要试剂：蛋白胨(生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司)、牛肉膏(生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司)、琼脂粉(生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司)、氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、水解酪蛋白(MH)培养基(生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司)、盐酸金霉素[美国药典(USP)级，上海阿拉丁生化科技有限公司]。
主要仪器：YT-CJ-1N型超净工作台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司)、隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)、立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司)。
1.2 试验方法 1.2.1 植物提取物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用试验共设11个组，分别为百里香精油、牛至精油、肉桂精油、大蒜油、黄芩黄酮、竹叶黄酮、黄芪多糖、小檗碱、苦参碱、绿原酸和金霉素(阳性对照)组，每组6个重复。植物提取物的浓度根据其溶解度及在不同浓度下的抑菌能力大小来确定。
牛津杯法[7]测定植物提取物的抑菌圈直径：将已制备好的菌悬液用无菌生理盐水稀释到106 CFU/mL，取200 μL均匀涂布于MH琼脂平板培养基表面，再在培养基表面垂直摆放牛津杯(每个直径为9 cm的培养皿上放4个牛津杯)，轻轻按压，使其与培养基接触无空隙。然后往其中3个杯中加入100 μL的植物提取物溶液，即为3个平行，另外1个杯中加入生理盐水作为空白对照。然后置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。
1.2.2 植物提取物复配对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用植物提取物复配对大肠杆菌的抑菌作用：采用单因素完全随机试验设计。根据以上单一植物提取物对大肠杆菌的抑菌作用，选出对大肠杆菌抑菌效果较好的3种植物提取物(肉桂精油、苦参碱和绿原酸)进行复配试验。由于肉桂精油对大肠杆菌的抑菌效果明显好于苦参碱和绿原酸，因此将肉桂精油的复配浓度设为25 mg/mL(抑菌效果较好，且浓度较低)，并根据其他2种植物提取物的溶解度(苦参碱饱和溶液浓度为50 mg/mL，绿原酸饱和溶液浓度为200 mg/mL)及其在不同浓度下的抑菌效果(表 1)来设置它们的复配浓度。具体处理安排如下：设25 mg/mL的肉桂精油、25和50 mg/mL的苦参碱及50、100和200 mg/mL的绿原酸组作为对照组，将肉桂精油与苦参碱的复配比例设为1:1(浓度比25:25)、1:2(浓度比25:50)；肉桂精油与绿原酸的复配比例设为1:1(浓度比25:25)、1:2(浓度比25:50)、1:4(浓度比25:100)、1:8(浓度比25:200)；肉桂精油、苦参碱与绿原酸的复配比例设为1:1:1(浓度比25:25:25)、1:1:2(浓度比25:25:50)、1:1:4(浓度比25:25:100)、1:1:8(浓度比25:25:200)、1:2:1(浓度比25:50:25)、1:2:2(浓度比25:50:50)、1:2:4(浓度比25:50:100)、1:2:8(浓度比25:50:200)，共20个组，每组6个重复。
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表 1 植物提取物对大肠杆菌的抑菌圈直径 Table 1 Inhibition zone diameters of plant extracts on the Escherichia coli |
植物提取物复配对沙门氏菌的抑菌作用：采用单因素完全随机试验设计。根据以上单一植物提取物对沙门氏菌的抑菌作用，选取竹叶黄酮、黄芩黄酮和肉桂精油3种植物提取物进行复配试验。由于竹叶黄酮对沙门氏菌的抑菌效果明显好于黄芩黄酮和肉桂精油，因此将竹叶黄酮的复配浓度设为25 mg/mL(抑菌效果较好，且浓度较低)，并依据黄芩黄酮的饱和溶液浓度(50 mg/mL)及3种植物提取物在不同浓度下的抑菌效果(表 2)来设置它们的复配浓度。具体处理安排如下：设25 mg/mL的竹叶黄酮、25和50 mg/mL黄芩黄酮及25、50和100 mg/mL肉桂精油组作为对照组，将竹叶黄酮与黄芩黄酮的复配比例设为1:1(浓度比25:25)、1:2(浓度比25:50)，竹叶黄酮与肉桂精油的复配比例设为1:1(浓度比25:25)、1:2(浓度比25:50)、1:4(浓度比25:100)，竹叶黄酮、黄芩黄酮与肉桂精油的复配比例设为1:1:1(浓度比25:25:25)、1:1:2(浓度比25:25:50)、1:1:4(浓度比25:25:100)、1:2:1(浓度比25:50:25)、1:2:2(浓度比25:50:50)、1:2:4(浓度比25:50:100)，共17个组，每组6个重复。另外，在随后探索竹叶黄酮与肉桂精油对沙门氏菌抑菌作用的最佳复配比例时，设25 mg/mL的竹叶黄酮及100、125、150、175、200、225和250 mg/mL肉桂精油组作为对照组，竹叶黄酮与肉桂精油的复配比例设为1:4(浓度比25:100)、1:5(浓度比25:125)、1:6(浓度比25:150)、1:7(浓度比25:175)、1:8(浓度比25:200)、1:9(浓度比25:225)、1:10(浓度比25:250)，共15个组，每组6个重复。
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表 2 植物提取物对沙门氏菌的抑菌圈直径 Table 2 Inhibition zone diameters of plant extracts on the Salmonella |
根据植物提取物和盐酸金霉素的有效成分含量，用吐温-80或无菌水稀释，百里香精油[12]、牛至油[13]、肉桂油[14]和大蒜油用2%吐温-80作稀释剂，黄芩黄酮[15]、竹叶黄酮[16]、黄芪多糖[17]、小檗碱[18]、绿原酸[19]、苦参碱[20]和盐酸金霉素用无菌水做稀释剂。
1.2.4 培养基的制备抗菌药物敏感性试验采用MH培养基[21-22]，细菌培养及计数采用营养肉汤培养基和营养肉汤琼脂培养基[23]。
1.2.5 供试菌液的制备菌悬液的制备参照程桂林等[4]的方法进行。
1.3 数据统计分析试验数据采用SAS 9.0软件进行统计分析。采用一般线性模型(GLM)程序进行方差分析，差异显著者，以最小显著差异(LSD)法比较各平均值间的差异显著性。以P < 0.05作为本研究中各项数据的差异显著性检验水平。
2 结果 2.1 植物提取物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用10种植物提取物对大肠杆菌的抑菌圈直径结果(表 1)表明，肉桂精油、苦参碱、绿原酸、百里香精油和牛至精油对大肠杆菌具有抑菌作用，随着植物提取物浓度的增加，抑菌圈直径逐渐增大，而大蒜油、竹叶黄酮、黄芩黄酮、小檗碱和黄芪多糖对大肠杆菌无抑菌作用。以同一浓度下比较抑菌圈直径大小为原则，发现这几种植物提取物的抑菌能力由大到小依次为肉桂精油、苦参碱、绿原酸、百里香精油、牛至精油。
10种植物提取物对沙门氏菌的抑菌圈直径结果(表 2)表明，竹叶黄酮、黄芩黄酮、肉桂精油、苦参碱、绿原酸、牛至精油、百里香精油和大蒜油对沙门氏菌有抑菌作用，随着植物提取物浓度的增加，抑菌圈直径逐渐增大，而小檗碱和黄芪多糖对沙门氏菌无抑菌作用。以同一浓度下比较抑菌圈直径大小为原则，将植物提取物对沙门氏菌的抑菌能力由大到小依次为竹叶黄酮、黄芩黄酮、肉桂精油、苦参碱、绿原酸、牛至精油、百里香精油、大蒜油。
2.2 植物提取物复配对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用肉桂精油、苦参碱和绿原酸3种植物提取物不同比例复配对大肠杆菌的抑菌作用结果(表 3)表明，3种植物提取物复合物的抑菌作用均显著高于苦参碱和绿原酸的不同浓度对照组(P＜0.05)。除肉桂精油和苦参碱复合物(25:50) 及肉桂精油、苦参碱和绿原酸复合物(25:50:50) 的抑菌作用与肉桂精油对照组无显著差异外(P＞0.05)，其他复合物的抑菌作用均显著低于肉桂精油对照组(P＜0.05)。
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表 3 植物提取物复配对大肠杆菌的抑菌作用 Table 3 Bacteriostatic effects of plant extract compounds on Escherichia coli (n=6) |
竹叶黄酮、黄芩黄酮和肉桂精油3种植物提取物不同比例复配对沙门氏菌的抑菌作用结果(表 4)表明，竹叶黄酮和黄芩黄酮的不同浓度复合物的抑菌作用均显著低于相应浓度竹叶黄酮和黄芩黄酮对照组(P＜0.05)；除竹叶黄酮和肉桂精油的复合物(25:25) 及竹叶黄酮、黄芩黄酮和肉桂精油的复合物(25:25:25和25:50:25) 的抑菌作用与25 mg/mL竹叶黄酮和100 mg/mL肉桂精油对照组无显著差异外(P＞0.05)，竹叶黄酮和肉桂精油其他比例的复合物及3种植物提取物其他比例的复合物的抑菌作用均显著高于3种植物提取物的不同浓度对照组(P＜0.05)，并以竹叶黄酮和肉桂精油的复合物(25:100) 的抑菌效果最好，显著高于其他复合物(P＜0.05)。
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表 4 植物提取物复配对沙门氏菌的抑菌作用 Table 4 Bacteriostatic effects of plant extract compounds on Salmonella (n=6) |
根据竹叶黄酮和肉桂精油不同比例复配对沙门氏菌的抑菌效果，筛选出最佳复配比例，结果见表 5。由表可见，竹叶黄酮和肉桂精油的复合物中，随着肉桂精油所占比例的增加，复合物对沙门氏菌的抑菌作用增强，以竹叶黄酮和肉桂精油的复合物(25:150) 的抑菌效果最好，虽与竹叶黄酮和肉桂精油的复合物(25:200) 无显著差异(P＞0.05)，但显著高于其他复合物(P＜0.05)。结果表明，竹叶黄酮和肉桂精油的复配比例为1:6时，对沙门氏菌的抑菌作用最强。
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表 5 竹叶黄酮和肉桂精油复配对沙门氏菌的抑菌作用 Table 5 Bacteriostatic effects of bamboo leaf flavonoids and skullcapflavone compounds on Salmonella (n=6) |
本研究发现，肉桂精油、苦参碱、绿原酸、百里香精油和牛至精油对大肠杆菌具有抑菌作用，而大蒜油、竹叶黄酮、黄芩黄酮、小檗碱和黄芪多糖对大肠杆菌无抑菌作用。大量研究表明，肉桂精油、苦参碱、绿原酸、百里香精油和牛至精油对大肠杆菌均具有抑菌作用。肉桂精油内的肉桂醛对大肠杆菌有较强的抑菌作用[24]，肉桂精油作用于大肠杆菌时，能破坏大肠杆菌的细胞膜，使细胞内部的多种酶不能正常合成，影响其新陈代谢，从而抑制了大肠杆菌的生长[25]。苦参碱可使鸡大肠杆菌菌体变形，细胞质固缩，质壁分离，菌体中央出现空腔，使细菌死亡[26]。1.0 g/L的金银花中绿原酸的抑菌效果明显，其对大肠杆菌的抑菌圈直径为25.95 mm[27]。百里香精油也对大肠杆菌有抑菌作用，其对大肠杆菌的抑菌圈直径为15.6 mm[28]，最小抑菌浓度(MIC)为1.12 mg/mL[12]。王新伟等[29]研究表明，牛至精油对大肠杆菌有明显的抑菌作用，其MIC为0.125 μL/mL。这些结果与本试验研究结果基本一致。另外，研究发现，黄芪多糖对大肠杆菌无抑菌作用[30]或抑菌效果较差[31]。赵志刚等[18]研究表明，小檗碱对革兰氏阴性菌的抑菌作用较差。李凤清[32]也发现大蒜油对大肠杆菌并无抑菌作用。这些结果也与本试验研究结果相一致。也有研究表明，竹叶黄酮[33]和黄芩黄酮[15]对大肠杆菌有不同程度的抑菌作用，而本试验中并未发现相似的结果，这可能是由于不同试验所使用的菌株及植物提取物产品的不同造成的。陆志科等[34]在研究不同竹叶提取物的抑菌效果时发现，不同的产地和采摘时间会影响抑菌效果。
本研究表明，竹叶黄酮、黄芩黄酮、肉桂精油、苦参碱、绿原酸、牛至精油、百里香精油和大蒜油对沙门氏菌均有抑菌作用，而小檗碱和黄芪多糖对沙门氏菌无抑菌作用。有关竹叶黄酮对沙门氏菌抑菌作用的研究还较少。研究发现，竹叶黄酮对沙门氏菌有抑菌作用，其对乙型副伤寒沙门氏菌的抑菌圈为11.78 mm[35]；黄芩黄酮对伤寒沙门氏菌的MIC为1.88 mg/mL[36]；肉桂精油对沙门氏菌也表现出抑菌作用，其MIC为400 mg/L[37]。韩铁索[38]研究发现，苦参碱对沙门氏菌表现出抑菌作用，其MIC为0.003 1 g/mL。徐跃成[19]报道，金银花中提取的绿原酸对沙门氏菌有抑菌效果，其MIC为0.125 mg/mL。研究认为，百里香精油对沙门氏菌有一定的抑菌作用，其抑菌圈直径为16 mm[39]；大蒜油对沙门氏菌有较强的抗菌作用[40]。林清华等[13]也报道，牛至油对10株沙门氏菌有抑菌作用，其MIC为111~400 mg/mL。这些前人研究结果与本研究结果相似，说明这些植物提取物对沙门氏菌具有不同程度的抑菌作用。研究表明，小檗碱对革兰氏阴性菌的抑菌效果较差[18]；黄芪多糖对沙门氏菌并无抑菌作用[30]或抑菌效果较差[31]。这些研究与本试验研究结果也基本一致。
3.2 植物提取物复配对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用研究发现，植物提取物复配可以增强其抑菌效果。张瑾[41]研究表明，大蒜、丁香和肉桂以质量比8:8:1复配时，苦参、大黄和金银花以质量比5:4:8复配时，均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有更强的抑菌作用。莫小路等[42]报道，肉桂、香茅和广藿香精油等量混合对大肠杆菌有较强的抑菌作用。Lu等[43]也证实，肉桂精油和百里香精油复配可以增强对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果；但肉桂精油和丁香油复配可降低对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用。也有研究认为，肉桂精油和丁香油对大肠杆菌的抑菌作用表现出拮抗作用，而对沙门氏菌的抑菌作用表现出协同作用[44]。可见，植物提取物复配是否增强其抑菌效果，与参与复配植物提取物的种类和比例以及供试菌种均有很大关系。目前为止，关于肉桂精油、苦参碱和绿原酸复配以及肉桂精油、竹叶黄酮和黄芩黄酮复配对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌作用的研究，尚未见报道。本研究表明，将肉桂精油、苦参碱和绿原酸两两或3种植物提取物按不同比例复配时，其复合物对大肠杆菌的抑菌作用并未大于单一肉桂精油，但竹叶黄酮和肉桂精油两两复配增强了对沙门氏菌的抑菌作用，且竹叶黄酮和肉桂精油以1:6复配时，其抑菌作用达到最大。产生这一结果的原因有待进一步研究。
4 结论① 10种植物提取物中有5种对大肠杆菌有抑菌作用，其抑菌作用从大到小依次为肉桂精油、苦参碱、
绿原酸、百里香精油、牛至精油，而大蒜油、竹叶黄酮、黄芩黄酮、小檗碱和黄芪多糖对大肠杆菌无抑菌作用；8种植物提取物对沙门氏菌具有抑菌作用，其抑菌作用从大到小依次为竹叶黄酮、黄芩黄酮、肉桂精油、苦参碱、绿原酸、牛至精油、百里香精油、大蒜油，而小檗碱和黄芪多糖对沙门氏菌无抑菌作用。
② 肉桂精油、苦参碱和绿原酸两两或3种植物提取物复配对大肠杆菌的抑菌作用并未大于单一肉桂精油；竹叶黄酮和肉桂精油复配可增强对沙门氏菌的抑菌作用，且在复配比例为1:6时抑菌作用达到最大。
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