作为哺乳动物的性腺，卵巢与母猪繁殖性能密切相关。后备母猪的卵巢发育、卵母细胞成熟和质量直接影响母猪排卵率及性腺激素的分泌，从而影响胚胎数和产仔数[1]。关于饲粮能量对母猪繁殖性能影响的研究有诸多报道，但结论不尽一致，多数研究者认为，通过对不同生长或繁殖周期母猪采用一定方式的限饲与补饲，可影响卵泡发育(总卵泡数、大卵泡数等)、排卵率、胚胎发育等[1-6]。但也有不同的报道，Almeida等[7]研究发现，母猪发情周期采取第1~7天限饲、第8~15天限饲及第1~15天饱饲3种饲喂方式，排卵率并没有显著差异。而营养因素对卵巢促性腺激素受体表达影响的报道较少，因此，关于后备母猪营养调控的机制仍有待于进一步完善。鉴于此，本试验以后备母猪为研究对象，研究不同饲粮能量水平对卵巢发育及卵巢促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)和促黄体素受体(luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor，LH/CGR)mRNA表达的影响，旨在为完善饲粮能量对动物繁殖性能作用的机制提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计选用健康、体况良好的(150±3) 日龄、体重为(61.0±3.1) kg的“长×大”二元后备母猪27头，随机分成3个组(每组3个重复，每个重复3头)，分别为：14.28 MJ/kg消化能组(中能组)，按NRC(1998) 设计的饲粮(能量摄入为猪营养消化能需要量的100%)饲喂；12.86 MJ/kg消化能组(低能组)，按标准饲粮能量降低10%的饲粮(能量摄入为猪营养消化能需要量的90%)饲喂；15.71 MJ/kg消化能组(高能组)，饲喂按标准饲粮能量增加10% (能量摄入为猪营养消化能需要量的110%)的饲粮。各组饲粮组成及营养水平见表 1。试验前将猪舍彻底清洗并消毒。参照NRC(1998) 后备母猪营养需要推荐量，在试验期内，试验猪体重在75 kg以内时，每头猪饲喂量为2.1 kg/d；体重达到75 kg后，每头猪饲喂量为2.4 kg/d。除能量以外的其他营养成分摄入量相同。每天08:00、15:00饲喂2次，2次饲喂量相同。试验母猪单圈饲养，自由饮水。在试验猪体重达到80 kg后，约26周龄开始，每天检测发情2次，以出现静立反射记为发情第1天。
|
表 1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) |
在第2次发情的第19天，屠宰取卵巢，用吸水纸吸去卵巢表面水分后称重，并统计大卵泡数(直径＞3 mm)和小卵泡数(直径＜3 mm)，然后将卵巢置于液氮中速冻后-80 ℃保存，用于分子生物学检测。
1.3 试验材料焦磷酸二乙酯(DEPC)(美国Sigma公司)、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)、反转录酶(M-MLV)(美国Promega公司)、dNTP(中国TaKaRa公司)、RNase抑制剂(中国TaKaRa公司)、Oligo(dT)18(中国TaKaRa公司)。
ABI System-7000型PCR仪(美国ABI公司)、GeneQuant-100核酸浓度测定仪(英国Pharmacia Biotech公司)、Sigma-3k15高速冷冻离心机(德国Sigma公司)。
1.4 卵巢FHSR和LH/CGR mRNA表达的检测 1.4.1 样品总RNA提取取样品50~100 mg，采用Trizol一步法提取总RNA。经电泳检测总RNA的完整性。用GeneQuant-100核酸浓度测定仪检测总RNA的浓度和纯度。
1.4.2 引物设计与合成引物使用Primer 5.0软件设计，由上海生物工程技术有限公司合成，如表 2所示。
|
|
表 2 试验所用目的基因引物和探针 Table 2 Objective gene primers and probe designed for this study |
采用常规PCR法扩增目的片段和内参，用FSHR、LH/CGR引物，以高能组、中能组和低能组卵巢的cDNA为模板，扩增目的片段，目的片段长度分别为103和145 bp。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸6 min；4 ℃保存。
1.4.4 纯化PCR产物的回收、连接、转化及序列测定采用V-gene Biotechnology Limited的DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因产物，与pMD 18-T载体连接后，利用蓝/白菌落筛选法进行阳性克隆的初步筛选，运用日常型质粒DNA快速制备试剂盒提取质粒。将PCR鉴定正确的重组质粒送到TaKaRa公司进行序列测定。将测序结果与互联网上已知的核酸序列进行比较，用DNAMAN软件将测序结果与GenBank上的序列进行同源性比较。
1.4.5 卵巢FSHR和LH/CGR mRNA表达量的测定使用实时荧光定量PCR仪，采用TaqMan探针法对FSHR和LH/CGR mRNA表达量进行检测。以连续稀释的重组质粒作为阳性质控标准品，制作标准曲线。PCR反应体系为25.0 μL，其中：cDNA 1.00 μL，10×Ex Taq Buffer 2.50 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.00 μL，10 pmol/L上下游引物各0.50 μL，10 pmol/L FAM-TAMRA探针0.25 μL，Ex Taq HS 0.15 μL，ddH2O 18.10 μL。反应条件为：95 ℃预变性6 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，48个循环。每份样品所含的拷贝数通过Ct值与相应的标准曲线比较而得到。
1.5 数据处理试验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 15.0软件进行方差分析和LSD法进行多重比较，P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 饲粮能量水平对后备母猪卵巢发育的影响由表 3可知，饲粮能量水平显著影响后备母猪大卵泡数及卵巢重(P < 0.05)，对小卵泡数无显著影响(P＞0.05)。随着饲粮能量水平的提高，大卵泡数增多，卵巢重增加。其中高能组大卵泡数、卵泡重均显著高于低能组(P < 0.05)，与中能组均差异不显著(P＞0.05)；低能组与中能组间大卵泡数量、卵泡重均无显著差异(P＞0.05)。
|
|
表 3 饲粮能量水平对后备母猪卵巢发育的影响 Table 3 Effects of dietary energy level on ovary development of prepubertal gilts |
提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳分析，见图 1，有明显的完整3条带，分别为28S、18S和5S，RNA没有降解，完全符合反转录要求。吸光度(OD)260/OD280值均达到1.8~2.0，达到试验纯度要求。
|
图 1 卵巢组织总RNA电泳图 Figure 1 The electrophoresis result of total RNA from ovary |
以重组质粒为模板，采用FSHR、LH/CGR引物进行常规PCR鉴定，见图 2，电泳可见103和145 bp处有特异的条带，与预计的片段大小相符。基因序列分析结果表明，测序结果与GenBank中公布的FSHR和LH/CGR基因序列的同源性均为100%。
|
1：促黄体素受体LH/CGR；2：DL-2000 DNA Marker；3：促卵泡素受体FSHR。 图 2 FSHR和LH/CGR重组质粒片段的PCR鉴定结果 Figure 2 Identification of FSHR and LH/CGR recombinant plasmid by PCR |
由表 4可知，饲粮能量水平显著影响卵巢FSHR和LH/CGR mRNA的表达量(P < 0.05)。随着饲粮能量水平的提高，卵巢FSHR和LH/CGR mRNA表达量均显著增加(P < 0.05)。高能组卵巢FSHR mRNA表达量均显著高于低能组和中能组(P < 0.05)；而中能组和低能组间FSHR mRNA表达量差异不显著(P＞0.05)。高能组卵巢LH/CGR mRNA表达量显著高于低能组(P < 0.05)，但与中能组差异不显著(P＞0.05)；中能组和低能组间LH/CGR mRNA表达量差异不显著(P＞0.05)。
|
|
表 4 饲粮能量水平对后背母猪卵巢FSHR和LH/CGR mRNA表达量的影响 Table 4 Effects of dietary energy level on expression levels of FSHR and LH/CGR mRNA in ovary of prepubertal gilts |
卵泡的成熟是后备母猪初情期启动的标志之一。卵泡发育经历征集、选择、优势化和排卵等过程，期间受内分泌、旁分泌及自分泌等因素的影响。多个研究证实，能量可影响不同繁殖时期母猪的卵泡发育。本研究中，饲粮能量水平影响后备母猪大卵泡数及卵巢重，高能量水平显著增加大卵泡数及卵巢重，这与王延忠[8]、周东胜[9]在对59 kg体重后备母猪饲喂混合油脂(油脂占消化能29%，猪油:菜籽油=1:1) 的研究结果相一致。初情期前母猪在75 kg之后限饲至85 kg，Booth等[1]发现卵泡数量显著低于自由采食母猪。Zak等[5]、Van Den Brand等[6]和Hazeleger等[10]在初产泌乳母猪中均得到了相近的结论。卵巢重量与母猪繁殖性能密切相关，卵巢重增加，可促进性腺激素的分泌，也利于更多的小卵泡继续发育。而排卵前大卵泡数的多少代表着可能的排卵率[8]。高能饲粮母猪卵巢重及大卵泡数的增加，可能引起排卵率、配种后胚胎数和产仔数的相应提高。另外，本研究中，不同能量水平对小卵泡数无显著影响，这与王延忠[8]、周东胜[9]的结论有所不同，可能是由于饲粮中添加油脂的种类差异所致。
3.2 饲粮能量水平对后备母猪卵巢FSHR和LH/CGR mRNA表达的影响关于饲粮能量水平对后备母猪卵巢FSHR和LH/CGR mRNA表达影响的研究较少，本研究中，饲粮能量水平引起卵巢FSHR和LH/CGR mRNA表达量的显著变化，高能可促进卵巢FSHR和LH/CGR mRNA的表达，且高能组FSHR和LH/CGR mRNA表达量最高，均显著高于低能组，这与王延忠[8]的结论一致。这种显著性差异同样表现在50日龄初情期前小母猪的卵巢FSHR和LH/CGR mRNA表达量上[11]。由此表明，饲粮能量水平对卵巢FSHR和LH/CGR mRNA表达量的差异影响具有长期效应，可能贯穿初情期前母猪的整个生长期内。
众所周知，促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)是调控母畜繁殖系统的重要激素，FSH可启动卵泡征集，促进卵泡发育、成熟至排卵前阶段；LH与FSH协同促进卵泡生长成熟，并可诱发排卵。FSH、LH的生理作用是通过分别与FSHR和LH/CGR特异性结合所介导。能量因素影响卵巢上FSHR和LH/CGR表达的分子机制，目前还不是十分明了，可能通过调节卵巢FSHR和LH/CGR的表达而改变卵泡对FSH、LH的敏感性，从而达到刺激卵泡发育、提高排卵率和产仔数的目的[11]，具体机制尚有待于进一步研究揭示。
4 结论① 提高饲粮能量水平可增加后备母猪卵巢重量，增加大卵泡数。
② 提高饲粮能量水平有利于促进后备母猪卵巢FSHR和LH/CGR mRNA的表达。
| [1] |
BOOTH P J, COSGROVE J R, FOXCROFT G R. Endodrine and metabolic responses to realimentation in feed-restricted prepubertal gilts:associations among gonadotropins, metabolic hormones, glucose, and uteroovarian development[J]. Journal of Animal Science, 1996, 74(4): 840-848. DOI:10.2527/1996.744840x |
| [2] |
BOOTH P J, CRAIGON J, FOXCROFT G R. Nutritional manipulation of growth and metabolic and reproductive status in prebupertal gilts[J]. Journal of Animal Science, 1994, 72(9): 2415-2424. DOI:10.2527/1994.7292415x |
| [3] |
ARMSTRONG J D, BRITT J H. Nutritionally-induced anestrus in gilts:metabolic and endocrine changes associated with cessation and resumption of estrous cycles[J]. Journal of Animal Science, 1987, 65(2): 508-523. DOI:10.2527/jas1987.652508x |
| [4] |
ZAK L J, COSGROVE J R, AHERNE F X, et al. Pattern of feed intake and associated metabolic and endocrine changes differentially affect postweaning fertility in primiparous lactating sows[J]. Journal of Animal Science, 1997, 75(1): 208-216. DOI:10.2527/1997.751208x |
| [5] |
ZAK L J, XU X, HARDIN R T, et al. Impact of different patterns of feed intake during lactation in the primiparous sow on follicular development and oocyte maturation[J]. Reproduction, 1997, 110(1): 99-106. DOI:10.1530/jrf.0.1100099 |
| [6] |
VAN DEN BRAND H, DIELEMAN S J, SOEDE N M, et al. Dietary energy source at two feeding levels during lactation of primiparous sows:Ⅰ.Effects on glucose, insulin, and luteinizing hormone and on follicle development, weaning-to-estrus interval, and ovulation rate[J]. Journal of Animal Science, 2000, 78(2): 396-404. DOI:10.2527/2000.782396x |
| [7] |
ALMEIDA F R, KIRKWOOD R N, AHERNE F X, et al. Consequences of different patterns of feed intake during the estrous cycle in gilts on subsequent fertility[J]. Journal of Animal Science, 2000, 78(6): 1556-1563. DOI:10.2527/2000.7861556x |
| [8] |
王延忠. 能量来源和水平对后备母猪卵母细胞质量及相关基因表达的影响[D]. 硕士学位论文. 雅安: 四川农业大学, 2007: 32-34. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10335-2005086665.htm
|
| [9] |
周东胜. 日粮能量水平和来源对后备母猪初情期启动、卵泡质量影响及机理研究[D]. 博士学位论文. 雅安: 四川农业大学, 2013: 39-44. http://www.doc88.com/p-1876591926554.html
|
| [10] |
HAZELEGER W, SOEDE N M, KERNP B. The effect of feeding strategy during the pre-folliculr phase on subsequent follicular development in the pig[J]. Domestic Animal Endocrinology, 2005, 29(2): 362-370. DOI:10.1016/j.domaniend.2005.03.007 |
| [11] |
于淼瑛. 不同日粮能量水平对初情期前母猪卵巢及子宫LH受体和FSH受体mRNA表达的影响[D]. 硕士学位论文. 长春: 吉林大学, 2006: 58. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-NMKJ2004S1051.htm
|