2. 中国农业大学动物科技学院, 北京 100193
2. College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
脂肪肝综合征(fatty liver syndrome，FLS)是由于肝脏内脂肪异常堆积代谢紊乱引起的一种代谢性疾病，常见于产蛋高峰期和后期蛋鸡[1-3]。Couch[4]于1954年首次在美国西南部的产蛋鸡上首次发现FLS。FLS主要发生于笼养产蛋鸡，会导致产蛋鸡产蛋率明显下降，死亡率升高，给养殖业带来极大的经济损失[5]。生产实践中发现，多数由于FLS死亡的母鸡，主要原因是肝脏脂肪积累过多，肝脏破裂导致出血和死亡。多数母鸡产蛋后或产蛋率达不到高峰时才被发现患有FLS，因此饲养过程中可以微生态制剂预防为主，以提高母鸡的抗氧化能力[6]。徐鹏[7]研究发现，地衣芽孢杆菌TS-01可以预防产蛋鸡FLS的发生；Pan等[8]研究发现，饲粮中添加益生菌可以增加产蛋鸡血清谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的活性。目前有关凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)对北京产蛋油鸡FLS的预防及其抗脂质过氧化能力的研究尚未见国内外报道。因此，本文以北京油鸡为试验对象，通过在基础饲粮中添加冻干菌粉形式的凝结芽孢杆菌Liu-g1，研究其对产蛋鸡脂质过氧化特征指标丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和抗脂质过氧化特征指标及血清甘油三酯(triglycerides, TG)含量的影响，并通过观察肝脏组织切片油红O染色和测定肝脏粗脂肪含量，研究凝结芽孢杆菌Liu-g1对FLS的预防作用和抗氧化活性，旨在为开发具有抗氧化能力的凝结芽孢杆菌Liu-g1微生态制剂提供科学的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验菌株凝结芽孢杆菌Liu-g1，筛选于传统干酪，经本课题组前期试验研究鉴定为产中性蛋白酶的菌株[9]。
1.1.2 微生态制剂于优化发酵条件下对凝结芽孢杆菌Liu-g1进行发酵，经离心浓缩和真空冷冻干燥，得到活菌数为7.35×1010 CFU/g的冻干菌粉活菌制剂微生态制剂。
1.1.3 培养基发酵培养基[9]：大豆粕1.0%、玉米淀粉4.0%、碳酸钙0.6%。
平板计数琼脂(PCA)培养基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，琼脂17.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。
1.1.4 仪器与设备BT2202S电子天平(Electronic Balance，Sartorius公司，德国)、真空冷冻干燥机(Vacuum Freeze Dryer，Labconco公司，美国)、TGL-20M型高速台式冷冻离心机(High Speed Refrigerated Centrifuge，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)、202-001电热恒温干燥箱(Electrothermal Constant-Temperature Dry Box，北京科伟永兴仪器有限公司)。
1.2 试验设计与饲粮选择120只体重差异不显著(P＞0.05)、健康的14周龄北京油鸡产蛋鸡，随机分为空白对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组4个组，每组3个重复，每个重复10只。空白对照组饲喂基础饲粮，试验组(低剂量组、中剂量组、高剂量组)分别饲喂在基础饲粮中添加10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1的试验饲粮，使各试验组摄入活菌数量分别为108、109、1010 CFU/kg。基础饲粮配制参考NRC(1994)标准，其组成及营养水平如表 1所示。凝结芽孢杆菌Liu-g1微生态制剂由本实验室自制。试验用北京油鸡由北京市农林科学院畜牧兽医研究所提供，采用3层阶梯式笼养鸡舍，光照时间16 h，饲养温度20~23 ℃，人工喂料捡蛋，自由采食和采水，并按常规程序免疫。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
血清采集：试验第10周，每组按重复取10只鸡用无菌注射器翅下静脉采血，每只采血2~3 mL，37 ℃凝血约2 h之后取出血清于2 mL离心管中，于4 000 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃冷冻保存备用。
肝脏组织：试验第10周，每组按重复随机宰杀5只油鸡，摘取肝脏并剪取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm大小的肝脏分组浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定备用。
1.3.2 测定方法及指标 1.3.2.1 肝脏组织显微镜观察肝脏组织油红O染色切片，显微镜下观察。
1.3.2.2 肝脏组织粗脂肪含量测定取各组新鲜肝脏，分别冷冻干燥48 h，经过40目筛，称取2.00~5.00 g，全部移入滤纸筒内，依据GB/T 5009.6—003《食品中脂肪的测定》的方法[10]测定肝脏粗脂肪含量。
1.3.2.3 血清抗氧化指标测定取1.3.1步骤冷冻的血清样品，送至北京中同蓝博临床检验所有限公司测定甘油三酯含量、总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、GSH-Px活性、MDA含量。
1.4 数据统计分析试验数据用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan氏法多重比较检验。试验数据用平均值±标准差表示，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果与分析 2.1 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清甘油三酯含量的影响由图 1可见，与空白对照组相比，10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组的血清甘油三酯含量均显著下降(P < 0.05)，分别降低了18.91%、57.55%、56.05%。100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组血清甘油三酯含量显著低于10 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组(P < 0.05)，且100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组血清甘油三酯含量最低。
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数据柱形标注不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。图 3同。 Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05), and with different capital letters mean significant difference (P<0.01). The same as Fig. 3. 图 1 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清甘油三酯含量的影响 Figure 1 Effects of Bacillus coagulans Liu-g1 on serum triglyceride content of laying hens (n=10) |
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图 3 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡肝脏粗脂肪含量的影响 Figure 3 Effects of Bacillus coagulans Liu-g1 on liver fat content of laying hens (n=5) |
经油红O染色后，肝脏细胞内脂肪滴呈红色，细胞核呈蓝色。由图 2可见，空白对照组肝脏切片明显有大量的红色脂肪滴，而试验组肝脏组织切片中红色脂肪滴数量均明显少于空白对照组，100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组几乎没有。这说明饲粮添加100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组效果最好。
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A：空白对照组；B：10 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组；C：100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组；D：1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组。 A: blank control group; B: 10 mg/kg Bacillus coagulans Liu-g1 group; C: 100 mg/kg Bacillus coagulans Liu-g1 group; D: 1 000 mg/kg Bacillus coagulans Liu-g1 group. 图 2 肝脏组织油红O染色切片 Figure 2 Liver tissue sections with oil red O staining (400×) |
由图 3可见，与空白对照组相比，10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组蛋鸡肝脏粗脂肪含量均极显著降低(P < 0.01)，分别降低了56.45%、70.91%、66.78%。100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组肝脏粗脂肪含量极显著低于10 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组(P < 0.01)，降低了33.20%。这进一步验证了未饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1时肝脏可能有脂肪堆积现象，而试验组结果表明凝结芽孢杆菌Liu-g1可以显著改善这一现象，具有较强抑制脂肪肝的作用。其中，100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组效果最好。该结果与图 2中肝脏组织油红O染色切片结果一致。
2.4 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清抗氧化指标的影响由表 2可知，与空白对照组相比，10、100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组的血清T-AOC分别显著提高了19.81%、29.62%(P < 0.05)；10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组的血清GSH-Px活性分别显著提高了39.15%、48.15%、40.21%(P < 0.05)；10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组血清SOD活性均有一定程度的提高(P>0.05)，分别提高了1.38%、6.64%、10.45%；10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组的血清MDA含量均有一定程度的降低(P>0.05)，分别降低了13.58%、20.79%、19.64%。这说明凝结芽孢杆菌Liu-g1具有较好的脂质抗氧化能力。其中，100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组效果最佳。
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表 2 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清抗氧化指标影响 Table 2 Effects of Bacillus coagulans Liu-g1 on serum antioxidant indices of laying hens (n=10) |
甘油三酯是脂肪酸和甘油合成的脂肪分子[11]。血液中高水平的甘油三酯与动脉粥样硬化和心脏病有关[12-15]，同时也是引发脂肪肝的可能原因。蛋鸡脂肪合成主要在肝脏中进行[16]。研究表明，肝脏脂质合成和分泌之间的平衡是调节蛋鸡肝脏内脂肪沉积的关键[17]。产蛋前期，肝脏大量合成脂肪以满足蛋黄沉积脂质的需要，当合成脂肪的速度大于向外转运的速度时，过量的脂肪就会沉积到肝脏中，最后导致肝脏脂质代谢紊乱，严重者导致肝内出血而死亡[11]。若血清甘油三酯含量高，可导致肝脏摄入的游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)过多，促使肝脏合成甘油三酯过多，进而可能导致肝脏脂质代谢紊乱和脂肪肝的形成[18]。曹友德等[19]研究了高脂血症、FFA和脂肪肝的相关性发现，高甘油三酯组高脂血症、脂肪肝发病率和FFA含量均显著高于正常血脂组，且脂肪肝组甘油三酯、FFA含量显著高于非脂肪肝组，因此甘油三酯含量高可能导致脂肪肝的形成。本试验选取北京油鸡产蛋鸡为研究对象，检测产蛋鸡血清甘油三酯的含量，结果发现未饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1的空白对照组血清甘油三酯含量偏高，有可能形成脂肪肝；而试验组血清甘油三酯含量显著降低，说明该菌有可能抑制脂肪肝形成，但需要进一步通过测定肝脏脂肪含量和血清抗氧化指标，证明凝结芽孢杆菌Liu-g1具有预防脂肪肝的作用和抗氧化活性。由图 2和图 3可知，进一步通过测定肝脏粗脂肪含量和观察肝脏组织油红O染色切片，发现未饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1的空白对照组产蛋鸡肝脏组织中粗脂肪含量偏高，且油红O染色切片脂肪滴数量最多，且随着饲粮凝结芽孢杆菌Liu-g1添加水平的增加，肝脏组织中粗脂肪含量降低，同时油红O染色脂肪堆积现象明显减少。这说明凝结芽孢杆菌Liu-g1能调节肝脏脂质合成和分泌之间的平衡，显著改善肝脏脂肪堆积，有效抑制蛋鸡脂肪肝的形成。其抑制机理可能与凝结芽孢杆菌Liu-g1具有脂质抗氧化活性有关。
3.2 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清抗氧化指标的影响Day等[20]提出脂肪肝发病机制“二次打击”假说。该假说认为第一次打击即肝脏脂肪变性，第二次打击则是由氧化应激引发的脂质过氧化。研究表明，脂肪肝的形成与体内抗氧化系统损伤及脂质过氧化有关[21]。机体在能量代谢过程中发生氧化还原反应所产生的电子传递过程中，氧不可避免的会发生不完全还原反应而产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)[22]。ROS可能会引发脂质过氧化，破坏DNA链，损伤生物膜和组织等[23]。正常情况下，机体可以通过抗氧化防御系统来保护自身免受ROS带来的伤害。其中，SOD和GSH-Px是机体抗氧化系统中重要的2种酶。SOD能有效将超氧阴离子转化为过氧化氢，然后通过GSH-Px降解成水[24-25]。抗氧化系统不能消除的过量ROS会攻击生物膜的不饱和脂肪酸，并引发脂质过氧化而产生氧化应激的标志性产物——MDA[26]。T-AOC表示清除机体过剩的ROS而使其在细胞内保持一定水平，其水平高低代表了机体的抗氧化能力[27]。
本试验研究表明，与空白对照组相比，100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组蛋鸡血清T-AOC显著提高，3个试验组血清GSH-Px活性均显著提高，血清SOD活性和MDA含量分别有一定程度的提高和降低。宫秀燕等[28]研究发现，凝结芽孢杆菌显著提高了肉鸡血清T-AOC，极显著提高了血清SOD活性，显著降低了血清MDA含量，并且显著提高了血清GSH-Px活性，这与本试验结果相似。Kodali等[29-30]从凝结芽孢杆菌RK-02发酵液中提取到了具有明显清除自由基和抗氧化活性的胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)；袁建锋等[31]筛选到1株芽孢杆菌，发现其产生的EPS具有强抗氧化活性，并且对脂质过氧化有抑制作用；梅秀明等[32]研究表明，乳酸菌EPS能极显著提高血清SOD活性，极显著降低血清MDA含量，说明EPS能够增强机体抗氧化能力；李景艳[33]体外试验表明，EPS能显著提高血清T-AOC、SOD活性，显著降低血清MDA含量，能清除自由基，增强抗氧化能力。本研究凝结芽孢杆菌Liu-g1提高蛋鸡脂质抗氧化能力是否由产生的EPS的作用，有待后期试验研究。
4 结论饲粮添加10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1能降低蛋鸡血清甘油三酯含量，肝脏粗脂肪含量，并提高血清T-AOC、GSH-Px、SOD活性，降低血清MDA含量；综合考虑，凝结芽孢杆菌Liu-g1添加水平为100 mg/kg时效果最好。
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