长久以来，抗生素被作为饲料添加剂用于反刍动物生产，其目的是预防能量代谢疾病，调节瘤胃发酵，提高动物生产性能。但随着生活品质的提高，人们越来越关注抗生素药物残留所引起的问题，如致癌、致畸以及致突变等。2006年，欧盟明确禁止在饲料中添加抗生素。因此，寻求抗生素的替代品成为了国内外学者越来越关注的研究方向。传统中草药富含蛋白质、碳水化合物、脂肪和微量元素等，可作为添加剂用于动物生产，而且与其他添加剂相比，传统中草药还具有无毒、无耐药性以及无残留等特点，可以确保动物产品的安全性^[1]。但目前研究的可以作为饲料添加剂用于动物生产的中草药并不是很多^[2]。因此，可以有效调节瘤胃微生态、提高动物生产性能的新型中草药添加剂备受期待^[3]。

金银花又名忍冬花，是忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunh)的干燥花蕾，它作为一味名贵中草药，被广泛用于制药以及保健食品制作等。金银花中含有有机酸、黄酮、皂苷、挥发油及微量元素等成分，其主要活性成分为绿原酸^[4]。研究表明，金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗炎、增强免疫力、保肝利胆等作用^[5]。目前，金银花及其提取物已经逐渐应用于畜禽生产。有研究显示，金银花提取物可以改善肉牛抗氧化性能，缓解肉牛热应激反应^[6-8]。还有研究显示，金银花不仅可以改善肉鸡生长性能和肠道微生物菌群^[9]，而且可以作为微生态调节剂，调整大鼠肠道菌群失调^[10-11]。因此，本试验通过瘤胃体外发酵试验，探究金银花提取物对奶牛瘤胃微生物发酵的调控作用，以期为金银花提取物作为饲料添加剂应用于动物生产提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

本试验所用的金银花提取物选购自陕西中鑫生物技术有限公司，其中绿原酸含量为10%。

1.2 试验动物及饲养管理

在北京市诚远盛隆牛场选取4头体况良好、体重相近、安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体。奶牛饲喂该场全混合日粮(TMR)(主要成分为玉米青贮、苜蓿、压片玉米、豆粕、棉籽粕、干酒糟及其可溶物等，精粗比为60 : 40)，每天07:00和19:30分2次饲喂，自由饮水，自由采食。

1.3 瘤胃体外发酵试验方法 1.3.1 人工唾液盐配制

人工唾液盐各组分参照Menke等^[12]方法于试验前1 d配制，组成见表 1。各溶液配制好后，按顺序依次加入400 mL蒸馏水、100 μL A溶液、200 mL B溶液、200 mL C溶液、1 mL指示剂和40 mL还原液。充分混匀后持续通入CO₂，直至溶液颜色由粉红变为无色透明，pH调整至6.80为止。使用前39 ℃预热。

1.3.2 体外发酵液配制

于晨饲前2.0 h进行瘤胃液采集，4头瘘管奶牛分别采集500 mL，瘤胃液采集后，用4层纱布过滤，并迅速移入预热达39 ℃并通CO₂的保温瓶内，每头牛收集适量食糜置于保温瓶内，用于微生物接种，收集完毕后迅速带回实验室。在实验室内取4头牛瘤胃液各250 mL，将食糜用2 L人工唾液盐冲洗3次，并用4层纱布过滤后与瘤胃液混匀，即完成发酵液的制备，将发酵液置于39 ℃水浴锅中，持续通入CO₂待用。

1.3.3 发酵底物配制

发酵底物组成及营养水平见表 2。

1.3.4 试验设计

瘤胃体外发酵试验参照Cherdthong等^[13]的方法，将发酵底物原料配制成TMR形式，65 ℃烘干后粉碎，样品经过1 mm筛过滤。准确称取约0.2 g培养底于100 mL玻璃注射器中(涂抹凡士林以保证其气密性)，按照随机试验设计，将玻璃注射器分为5组，分别向其中添加金银花提取物0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/g(底物干物质基础)，每组包含6个重复。在每个玻璃注射器中加入预先混匀并在水浴锅中加热达39 ℃的体外发酵液，将玻璃注射器的空气排尽，于39 ℃摇床连续培养24.0 h，试验共重复3个批次。

1.3.5 发酵液样本采集及测定

分别于发酵1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h记录产气量，发酵24.0 h结束后将样品从水浴摇床中取出后置于冰水中，停止培育，然后用便携式pH计(STARTER-300)立即测定pH。将发酵液过4层纱布，分装于4支离心管中，其中3支按发酵液体积10%添加25%的偏磷酸溶液，混匀后于-20 ℃冷冻保存，用于挥发性脂肪酸(VFA)、氨态氮(NH₃-N)以及乳酸浓度的测定，余下1支150×g离心15 min，采集上清液用于微生物蛋白(MCP)浓度的测定。

NH₃-N浓度利用靛酚比色法^[14]测定。主要测定步骤如下：在试管中加入0.05 mL样品，边混合边加入2.5 mL苯酚溶液；加入2.0 mL次氯酸钠溶液并摇匀；将试管置于95 ℃水浴5 min，60 ℃水浴10 min；取出冷却后使用天美UV-2600紫外分光光度计于630 nm下比色。

乳酸浓度采用对羟基联苯比色法^[15]测定。主要测定步骤如下：将发酵液(或乳酸标准液，制作标曲)4 000 r/min离心10 min，取上清液5 mL于试管中，加入0.5 mL 20%硫酸铜并混匀；取上述溶液0.5 mL，缓慢加入6 mL预冷的浓硫酸，混匀后置于沸水浴中5 min，取出后迅速置于冰水浴中；加入0.125 mL 1.5%对羟基联苯溶液，并迅速摇匀，置于30 ℃水浴中保温30 min后置于沸水浴90 s，取出置于冰水浴中冷却至室温，以蒸馏水为空白使用天美UV-2600紫外分光光度计于565 nm中比色。

VFA浓度以外标法^[16]测定。使用Agilent-7890B气相色谱仪，色谱条件：火焰氢离子检测器，PEG-20M+H3PO4玻璃填充柱，柱温120 ℃，检测器温度220 ℃，以氩气作为载气，流速30 mL/min，由氢气发生器提供氢气，流速30 mL/min，空气流速300 mL/min，进样量2 μL。

MCP浓度利用嘌呤法^[17]测定。主要测定步骤如下。

标准曲线的制作：1)分别称取5、15、25、35、45及55 mg酵母RNA加入10 mL离心管中，加入2 mL 0.6 mol/L HClO₄，95 ℃水浴1.0 h，冷却; 2)加入6 mL 28.5 mmol/L的NH₄H₂PO₄，95 ℃水浴15 min，冷却后在3 000×g，4 ℃条件下离心10 min; 3)取1.6 mL上清液，加入6 mL 0.2 mol/L的NH₄H₂PO₄，用85%磷酸调整溶液pH至2~3；4)取3.8 mL调整pH后的溶液，加入0.2 mL 0.4 mol/L的AgNO₃溶液，混合后于4 ℃避光过夜; 5)第2天于3 000×g，4 ℃条件下离心10 min，弃上清液; 用5 mL pH为2的蒸馏水冲洗沉淀; 再于3 000×g，4 ℃条件下离心10 min，弃上清液; 6)向沉淀中加入5 mL 0.5 mol/L的HCl，混匀，95 ℃水浴30 min后，3 000×g离心10 min; 7)上清液用0.5 mol/L HCl稀释40倍后，以0.5 mol/L HCl作参比，在260 nm进行比色(使用天美UV-2600紫外分光光度计)。

发酵液MCP浓度测定：1)取8 mL发酵液于10 mL离心管中，在20 000×g，4 ℃条件下离心20 min; 弃上清液后加入2.104 mL 0.6 mol/L HClO₄，于95 ℃水浴1.0 h后冷却; 2)按照标准曲线制作的步骤2~6操作; 3)以0.5 mol/L HCl作参比，在260 nm下比色，根据吸光度值和标准曲线求出样品中RNA测定值; 4)根据以下公式计算MCP浓度。

微生物蛋白氮(mg/mL)=[RNA测定值(mg/mL)×17.83%/10%]×稀释倍数；

MCP(mg/mL)=微生物蛋白氮(mg/mL)×6.25。

饲粮和发酵底物干物质、粗蛋白质、粗脂肪、钙、磷含量测定使用实验室常规分析方法进行分析^[18]，应用Van Soest等^[19]的方法测定中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量。泌乳净能依据《奶牛饲养标准》(NY/T 34—2004)计算^[20], 计算公式如下：

泌乳净能=0.550 1×消化能(MJ/kg)-0.395 8。

1.4 数据统计分析

试验数据经Excel 2016进行初步整理后，采用SAS 9.4中Mixed模型进行进一步分析，并以P < 0.05为差异显著性判断的标准。

2 结果 2.1 发酵液pH及乳酸、NH₃-N、MCP浓度

由表 3可知，1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物组的发酵液pH显著低于对照组(P＜0.05)，发酵液NH₃-N及乳酸浓度均显著高于对照组，且3个组之间无显著差异(P＞0.05)，0.5 mg/g金银花提取物组的发酵液pH及乳酸、NH₃-N浓度与对照组以及其他3个试验组均无显著差异(P＞0.05)。试验组发酵液MCP浓度均显著高于对照组(P＜0.05)，且2.0、4.0 mg/g金银花提取物组显著高于0.5、1.0 mg/g金银花提取物组(P＜0.05)。

2.2 发酵液VFA浓度

由表 4可知，1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物组的发酵液总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度显著高于对照组(P < 0.05)，0.5 mg/g金银花提取物组与对照组和其他3个试验组均无显著差异(P＞0.05)。试验组的发酵液乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸浓度以及乙酸/丙酸与对照组均无显著差异(P＞0.05)。

2.3 体外发酵产气量动态变化

由表 5可知，1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物组在1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h的产气量均显著高于对照组(P＜0.05)，且这3组在1.5、6.0、12.0、24.0 h几个时间点总产气量无显著差异(P＞0.05)。0.5 mg/g金银花提取物组在24.0 h产气量显著高于对照组(P＜0.05)，而1.5、3.0、6.0、12.0 h与对照组无显著差异(P＞0.05)。

3 讨论 3.1 金银花提取物对发酵液pH及乳酸、NH₃-N、MCP浓度的影响

反刍动物瘤胃液pH受众多因素影响，如唾液分泌量、瘤胃缓冲物质以及有机酸生成、吸收和排出速率等^[21]。然而体外发酵系统不受唾液分泌量以及有机酸的吸收、排出速率影响，因此，发酵液内碱性物质(如NH₃-N)和有机酸的产生成为影响发酵液pH的主要因素。1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物组的发酵液pH显著低于对照组，可能是因为这3组乳酸及TVFA浓度高于对照组。杨春佳等^[10]给大鼠灌服金银花提取物发现，大鼠肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌数量均较对照组显著提高。杨丽梅等^[9]在肉鸡饮水中添加双黄连蜂胶口服液，其主要成分为金银花、黄芩、连翘以及蜂胶，结果显示，肉鸡肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌数量较对照组显著增加。本试验中，1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物组的发酵液乳酸浓度显著高于对照组，可能就是因为金银花提取物促进了乳酸产生菌的生长，从而增加乳酸浓度。杨春佳等^[10]和杨丽梅等^[9]的研究结果显示，金银花及其提取物可以作为益生源调节动物肠道微生物菌群，促进有益菌的增殖，抑制有害菌的生长，也就是说金银花提取物可以促进部分微生物的生长。本试验中，试验组发酵液MCP浓度显著高于对照组，可能正是由于金银花提取物促进了微生物的生长，且促进作用强于抑制作用。NH₃-N浓度是瘤胃内饲料含氮物质降解及微生物对NH₃-N利用的综合反映^[22]。本试验中，1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物组发酵液NH₃-N浓度显著高于对照组，而这3组的发酵液MCP浓度也显著高于对照组，说明这3组NH₃-N浓度的升高不是由于微生物对NH₃-N利用程度不够，而是因为金银花提取物提高了微生物对发酵底物含氮物质的降解效率。

3.2 金银花提取物对发酵液VFA浓度的影响

瘤胃发酵所产生的VFA占反刍动物吸收能量的70%~80%^[23]，其中乙酸、丙酸、丁酸等VFA是瘤胃碳水化合物发酵的主要产物，约占TVFA的95%，VFA的主要作用是为动物生产提供能量以及维持瘤胃环境^[24]。本试验中，1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物组的发酵液TVFA浓度显著高于对照组，说明添加金银花提取物可以促使微生物发酵产生更多VFA，这有利于为动物生产提供更多能量，而这3组发酵液TVFA浓度的显著提高，可能是因为金银花提取物促进了部分微生物繁殖，从而产生更多VFA^[10-11]。本试验结果也显示，1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物组发酵液MCP浓度显著高于对照组。

3.3 金银花提取物对体外发酵产气量动态变化的影响

产气量作为体外发酵体系中评定反刍动物瘤胃微生物发酵的重要指标，它综合性地反映了发酵底物的可发酵程度，表明了瘤胃微生物发酵活动的总体趋势，是反映发酵底物可利用性的综合指标之一^[25]。本试验中，1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物组在1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h的产气量均显著高于对照组，表明添加金银花提取物可以提高瘤胃微生物对发酵底物的利用效率；1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物组发酵液MCP浓度显著高于对照组，说明添加金银花提取物可以促进瘤胃微生物生长，这可能解释了为什么添加金银花提取物可以提高发酵产气量。

4 结论

在体外培养条件下，添加1.0、2.0、4.0 mg/g金银花提取物可以使24.0 h后发酵液pH及NH₃-N浓度显著降低，并且使发酵液乳酸、MCP、TVFA浓度以及产气量显著增加，综合经济效益考虑，添加1.0 mg/g金银花提取物最适宜。