2. 兽医学(中医药)北京市重点实验室, 北京 102206
2. Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine, Beijing 102206, China
氧化应激是指在内源或外源因素的刺激下,机体自由基产生过多,超出其清除能力,致使氧化还原状态失衡而引起的氧化损伤过程[1]。目前,在高密度集约化饲养模式下,环境、营养、运输等因素均可引起氧化应激,降低动物的生产性能、免疫功能和畜产品品质等。因此,探索开发安全有效的天然抗氧化剂显得尤为重要。
近年来,国内外学者已从多种动植物蛋白酶解液中分离出具有抗氧化活性的多肽,其可清除体内多余的氧自由基,抑制脂质过氧化,且易被机体吸收[2]。研究证明,多肽在调节免疫功能、降低胆固醇含量、抗菌和抗氧化等方面均有良好功效[3]。如牛膝多肽可显著降低大鼠因心肌缺血再灌注引起的氧化应激,保护心肌细胞的正常功能[4];大米蛋白肽对热应激引起的蛋鸡生产性能的下降和血液中葡萄糖、醛固酮等含量的升高有良好的缓解作用[5]。
地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker,ESW)具有调脂降脂、抗肿瘤、免疫调节和抗氧化等药理作用[6]。研究发现地鳖肽(Eupolyphaga sinensis Walker polypeptides,ESWPs)具有一定的抗氧化作用,但有关地鳖肽抗氧化作用的研究仅局限于简单的提取分离、活性分析和小鼠的体内试验,尚未见有关地鳖肽对氧化应激状态下禽类影响的报道。
本试验通过在饮水中添加氢化可的松构建肉仔鸡氧化应激模型,探究不同水平地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡生长性能、肉品质、脏器指数和抗氧化能力的影响,为地鳖肽在肉鸡生产中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料氢化可的松购自山西科龙兽药有限公司,为白色粉末,纯度≥99%,在水中的溶解度为100 mg/mL。地鳖肽由本实验室提取制备。采用蛋白酶水解法从地鳖虫粉中提取获得地鳖肽溶液,通过三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)法测定酶解液中地鳖肽的分子质量为8~9 ku,通过双缩脲法测定地鳖肽溶液浓度为45 mg/mL。
1.2 试验设计与试验饲粮选用180只1日龄健康爱拔益加(AA)肉仔鸡公雏,随机分为5组,分别为对照组、模型组(25 mg/L氢化可的松)和3个地鳖肽组[0.4、0.8和1.6 g/kg BW,每组6个重复,每个重复6只鸡。从第4天开始,3个地鳖肽组在饮水中加地鳖肽至第21天;从第8天开始,除对照组外,其余各组均在饮水中加氢化可的松,连续5 d。试验期21 d。自由饮食,观察肉仔鸡的精神状态、食欲和粪便状况,记录死亡鸡只数。基础饲粮参照NRC(1994)和《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004),结合肉仔鸡饲养手册配制,为玉米-豆粕型粉状饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) |
分别于第14天和第21天,每组随机选取18只鸡称重(空腹12 h),心脏采血,离心制备血清,分装于-20 ℃保存备用。处死鸡后取左侧胸肌、腿肌称重,立即取一部分用于肉品质检测,剩余部分与采集的新鲜肝脏样品于-20 ℃保存备用;取胰腺、胸腺、脾脏和法氏囊称重,计算脏器指数。称取1 g组织(肝脏、胸肌)于匀浆管中,加9 mL预冷生理盐水制成10%组织匀浆液,3 500 r/min离心15 min,取上清液于-20 ℃保存备用。
1.4 检测指标 1.4.1 生长性能分别于1、14和21日龄时以重复为单位称量肉仔鸡和余料重,计算平均日增重(ADG,g/d)、平均日采食量(ADFI,g/d)和料重比(F/G)。
1.4.2 脏器指数按照以下公式计算脏器指数:
脏器指数(mg/g)=脏器重量(mg)/鸡活体重(g)。
1.4.3 肉品质pH:分别于屠宰后45 min和24 h时,取2 g胸肌、腿肌剪碎,加入10倍体积超纯水,搅拌均匀后,室温静置30 min,用酸度计测胸肌、腿肌的pH。
肉色:取同一部位胸肌、腿肌,用测色色差计测肌肉亮度(lightness,L*)值、红度(redness,a*)值和黄度(yellowness,b*)值。
滴水损失:取胸肌、腿肌的中间部分,修整成35 cm×15 cm×10 mm长方体,称重(W1),然后用铁丝钓住肉样的一端,使肌纤维垂直,装入充气的塑料袋中封口,4 ℃保存24 h后取出称重(W2),按照以下公式计算滴水损失:
滴水损失(%)=(W1-W2)/W1×100。
1.4.4 血清皮质酮含量按照试剂盒说明检测血清皮质酮含量。
1.4.5 组织抗氧化酶活性和过氧化物含量根据试剂盒说明检测肝脏和胸肌的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。
1.5 统计分析试验数据采用Graphpad Prism 6.0软件,单因素方差分析(one-way ANOVA)程序进行组间差异分析,LSD进行多重比较,结果用“平均值±标准差(mean±SD)”表示。P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡皮质酮分泌的影响由表 2可见,14日龄时,模型组肉仔鸡的血清皮质酮含量显著高于对照组和地鳖肽组(P < 0.05);与对照组比,地鳖肽组的血清皮质酮含量也有不同程度的增加,但差异不显著(P>0.05);地鳖肽组中以1.6 g/kg BW地鳖肽组的血清皮质酮含量为最低。21日龄时,模型组的血清皮质酮含量高于其他各组,但差异不显著(P>0.05)。
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表 2 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡血清皮质酮含量的影响 Table 2 Effects of Eupolyphaga sinensis Walker polypeptides on serum corticosterone content of broilers under oxidative stress |
由表 3可见,1~14日龄时,与对照组相比,模型组肉仔鸡的ADG显著降低(P < 0.05),ADFI有降低趋势(P>0.05),F/G显著增加(P < 0.05);与模型组相比,地鳖肽组的ADG有升高趋势,ADFI有降低趋势,但差异均不显著(P>0.05),F/G显著降低(P < 0.05)。15~21日龄时,模型组的ADG和ADFI显著低于对照组(P < 0.05);地鳖肽组的ADG和ADFI高于模型组,但差异不显著(P>0.05);各组的F/G无显著差异(P>0.05)。1~21日龄时,模型组的ADG和ADFI显著低于对照组(P < 0.05),F/G显著高于对照组(P < 0.05);与模型组相比,地鳖肽组的ADG有升高趋势(P>0.05),0.4 g/kg BW地鳖肽组的ADFI有升高趋势(P>0.05),而0.8和1.6 g/kg BW地鳖肽组的ADFI则有降低趋势(P>0.05);0.4和1.6 g/kg BW地鳖肽组的F/G显著低于模型组(P < 0.05)。
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表 3 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡生长性能的影响 Table 3 Effects of Eupolyphaga sinensis Walker polypeptides on growth performance of broilers under oxidative stress |
由表 4可见,14日龄时,各组肉仔鸡的胸肌相对重无显著差异(P>0.05);模型组的胸肌pH45 min显著低于对照组和0.4、0.8 g/kg BW地鳖肽组(P < 0.05);各组的胸肌pH24 h无显著差异(P>0.05);与对照组相比,模型组的胸肌a*值显著降低(P < 0.05),L*值和b*值有升高趋势,但差异不显著(P>0.05);与对照组相比,模型组的胸肌滴水损失显著升高(P < 0.05),而与模型组相比,地鳖肽组的滴水损失有降低趋势,其中0.8 g/kg BW地鳖肽组的滴水损失显著降低(P < 0.05)。21日龄时,模型组的胸肌相对重低于对照组和地鳖肽组,但差异不显著(P>0.05);各组的胸肌pH45 min、pH24 h、L*值和b*值均无显著差异(P>0.05);0.4 g/kg BW地鳖肽组的胸肌a*值显著高于除对照组外的其他各组(P < 0.05);0.4 g/kg BW地鳖肽组的胸肌滴水损失显著低于模型组(P < 0.05)。
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表 4 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡胸肌肉品质的影响 Table 4 Effects of Eupolyphaga sinensis Walker polypeptides on the breast muscle quality of broilers under oxidative stress |
由表 5可见,14日龄时,各组肉仔鸡的腿肌相对重无显著差异(P>0.05);与对照组相比,模型组的腿肌L*值、a*值有升高趋势,但差异不显著(P>0.05);模型组的腿肌滴水损失显著高于对照组(P < 0.05),地鳖肽组的腿肌滴水损失均低于模型组,其中0.4和1.6 g/kg BW地鳖肽组的腿肌滴水损失显著低于模型组(P < 0.05)。21日龄时,模型组的腿肌相对重低于对照组和地鳖肽组,但无显著差异(P>0.05);各组的腿肌L*值、a*值、b*值、滴水损失均无显著差异(P>0.05)。
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表 5 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡腿肌肉品质的影响 Table 5 Effects of Eupolyphaga sinensis Walker polypeptides on the leg muscle quality of broilers under oxidative stress |
由表 6可见,14日龄时,各组肉仔鸡的胰腺指数无显著差异(P>0.05);模型组的脾脏指数显著低于0.4、0.8 g/kg BW地鳖肽组和对照组(P < 0.05);模型组的胸腺指数显著低于对照组和1.6 g/kg BW地鳖肽组(P < 0.05);模型组的法氏囊指数显著低于对照组和0.4 g/kg BW地鳖肽组(P < 0.05),地鳖肽各组的法氏囊指数无显著差异(P>0.05)。21日龄时,胰腺、脾脏和胸腺指数的变化趋势与14日龄时相似,但各组间无显著差异(P>0.05);与对照组相比,模型组的法氏囊指数显著降低(P < 0.05),而1.6 g/kg BW地鳖肽组显著高于模型组(P < 0.05)。
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表 6 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡脏器指数的影响 Table 6 Effects of Eupolyphaga sinensis Walker polypeptides on the organ indexes of broilers under oxidative stress |
由表 7可见,14日龄时,模型组肉仔鸡的肝脏SOD活性显著低于对照组(P < 0.05),1.6 g/kg BW地鳖肽组的肝脏SOD活性显著高于模型组(P < 0.05),但地鳖肽各组的肝脏SOD活性无显著差异(P>0.05);模型组的肝脏GSH-Px活性显著低于对照组和0.4、0.8 g/kg BW地鳖肽组(P < 0.05);对照组和0.8和1.6 g/kg BW地鳖肽组的肝脏CAT活性显著高于模型组(P < 0.05);模型组的肝脏MDA含量显著高于对照组(P < 0.05),0.8、1.6 g/kg BW地鳖肽组的肝脏MDA含量显著低于模型组(P < 0.05)。21日龄时,模型组的肝脏抗氧化酶活性低于对照组和0.4、0.8 g/kg BW地鳖肽组,但无显著差异(P>0.05);对照组和1.6 g/kg BW地鳖肽组的肝脏MDA含量显著低于模型组(P < 0.05)。
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表 7 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡肝脏抗氧化能力的影响 Table 7 Effects of Eupolyphaga sinensis Walker polypeptides on liver antioxidant capacity of broilers under oxidative stress |
由表 8可见,14日龄时,模型组肉仔鸡的胸肌SOD活性显著低于对照组和0.4 g/kg BW地鳖肽组(P < 0.05),且低于0.8和1.6 g/kg BW地鳖肽组(P>0.05);模型组的胸肌GSH-Px活性显著低于对照组和0.4、1.6 g/kg BW地鳖肽组(P < 0.05),地鳖肽各组的胸肌GSH-Px活性无显著差异(P>0.05);模型组的胸肌CAT活性显著低于对照组和地鳖肽组(P < 0.05);与对照组相比,模型组的胸肌MDA含量显著升高(P < 0.05),而0.4 g/kg BW地鳖肽组的胸肌MDA含量显著低于模型组(P < 0.05)。21日龄时,各组的肌肉SOD和GSH-Px活性无显著差异(P>0.05);模型组的胸肌CAT活性低于对照组(P>0.05),显著低于0.8 g/kg BW地鳖肽组(P < 0.05);模型组的胸肌MDA含量显著高于对照组(P < 0.05),0.4、1.6 g/kg BW地鳖肽组的胸肌MDA含量低于模型组,但无显著差异(P>0.05)。
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表 8 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡胸肌抗氧化能力的影 Table 8 Effects of Eupolyphaga sinensis Walker polypeptides on breast muscle antioxidant capacity of broilers under oxidative stress |
氧化应激是目前规模化养殖生产中普遍存在的问题之一,严重影响养殖业的经济效益。氧化应激状态下,机体细胞内产生大量自由基,攻击细胞膜的多不饱和脂肪酸,导致细胞膜结构和功能的完整性受损,蛋白质和核酸氧化损伤,酶活性发生改变,组织功能异常,机体抗病力下降,进而诱导各种疾病的发生[7]。自1980年二丁基羟基甲苯(BHT)和丁基羟基茴香醚(BHA)等人工合成抗氧化剂被发现有一定的毒性和低致癌性后,天然抗氧化剂的开发就具有十分重要的意义。
机体处于氧化应激状态时,下丘脑通过释放促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)促使垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素(ACTH),而ACTH的释放促进肾上腺皮质分泌糖皮质激素[8]。皮质酮作为调节代谢速率的重要激素,对机体的糖、脂肪和蛋白质代谢均有重要影响,血液皮质酮含量升高正是动物体应对应激反应的生理过程。韩慕俊等[9]研究表明,免疫和脂多糖(LPS)刺激均导致雏鸡血浆皮质酮含量急剧升高,添加维生素E可有效缓解。于文会等[10]对雏鸡注射新城疫疫苗造成免疫应激,发现免疫应激能显著提高血清ACTH和皮质酮含量及下丘脑CRH的mRNA表达水平。本研究结果表明,在饮水中添加氢化可的松可使肉仔鸡的血清皮质酮含量显著增加,成功诱导肉仔鸡处于氧化应激状态。
3.2 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡生长性能的影响研究表明,地塞米松(DEX)诱导的氧化应激可显著降低肉仔鸡的ADFI和ADG,抑制肉仔鸡的生长[11-12]。在产蛋鸡饲粮中添加不同水平的氧化大豆油,随着大豆油氧化程度的加深,蛋鸡的饲料转化效率显著降低,产蛋率呈下降趋势[13],与Eid等[14]的研究结果相一致。本研究结果表明,氧化应激模型组肉仔鸡的ADG和ADFI低于对照组,F/G高于对照组,但饮水中添加不同水平地鳖肽后肉仔鸡的ADG和ADFI升高,F/G降低。上述研究结果提示,地鳖肽可有效缓解氧化应激对肉仔鸡生长性能的不利影响。
3.3 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡肉品质的影响研究表明,应激可降低肉仔鸡体内蛋白质的沉积,减少胸肌、腿肌重量,降低肌肉率,促进脂肪合成,显著提高腹脂率,减少胴体可食用部分[15]。应激过程中活性氧(ROS)对脂质和蛋白质的氧化作用会加快糖酵解进程,使肌肉pH迅速降低,增加肌肉滴水损失率,导致肌肉蛋白质变性,使肌肉水分渗出,颜色灰白[16-18]。本研究结果表明,氧化应激降低肉仔鸡肌肉pH,导致L*值增加、a*值降低、滴水损失增加,而添加地鳖肽可有效改善氧化应激对仔鸡肉品质的不利影响。
3.4 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡脏器指数的影响氧化应激对机体具有广泛影响,肌肉和主要脏器都会产生不同程度的氧化损伤。脏器指数是体内试验重要的观测指标,通过脏器指数可判断药物的毒性作用和免疫作用。关于地鳖肽对肉仔鸡脏器指数的报道较少,本研究结果表明,氧化应激模型组肉仔鸡的脏器指数低于对照组,添加地鳖肽后可提高脏器指数,改善器官发育,说明地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡的生长发育有一定促进作用,改善不良影响。
3.5 地鳖肽对氧化应激状态下肉仔鸡肝脏和胸肌抗氧化能力的影响研究报道,氧化应激可严重破坏肉鸡体内氧化系统和抗氧化系统之间的平衡状态[19-20]。家禽体内沉积过量的MDA会抑制抗氧化酶的活性,加剧机体DNA和蛋白质的氧化损伤,而应激可使肉鸡胸肌和骨骼肌的MDA含量增加2~4倍[21]。闵育娜等[22]通过腹腔注射地塞米松诱导肉鸡氧化应激模型,结果发现地塞米松显著降低血清GSH-Px活性和T-AOC。注射敌草快(diquat)诱导仔猪氧化应激导致血液SOD、GSH-Px和CAT活性显著下降,MDA含量呈上升趋势[23]。本试验通过测定氧化应激状态下肉仔鸡胸肌和肝脏抗氧化酶活性和MDA含量,评价肉仔鸡的氧化应激状态,结果显示,氢化可的松可成功诱导氧化应激,致使机体产生氧化损伤,而在饮水中添加地鳖肽后,胸肌和肝脏抗氧化酶活性增加,MDA含量降低,说明地鳖肽对氢化可的松诱导的氧化应激有较好的缓解作用,可改善肉仔鸡肝脏和胸肌抗氧化酶的活性,提高抗氧化能力。
4 结论地鳖肽可通过增加肉仔鸡的肝脏和肌肉抗氧化酶活性,减少脂质过氧化物的产生,缓解氢化可的松诱导的氧化损伤,从而改善肉仔鸡的脏器发育和肉品质,促进氧化损伤后的修复。在本试验条件下,肉仔鸡饮水中地鳖肽的适宜添加量为0.4~0.8 g/kg BW。
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