2. 华南农业大学, 动物科学学院, 广州 510642;
3. 赢创德固赛(中国)投资有限公司, 北京 100600
2. College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;
3. Evonik Degussa(China) Co., Ltd., Beijing 100600, China
随着我国居民生活水平的提高，消费者对猪肉品质的要求越来越高，优质猪肉更易受到消费者的青睐。脂肪是影响胴体品质和肉品风味的关键因素，腹部和皮下脂肪沉积过多会降低胴体品质，肌内脂肪含量增加则可提高肉的嫩度和风味；脂肪酸组成也是影响肉品质的关键因素，其不仅决定肉的嫩度和多汁性，还与肉的营养价值密切相关[1]。育种手段提高瘦肉率的同时又会引起肌内脂肪含量降低等问题[2]，而饲粮营养调控机体脂肪代谢效果显著，这使其成为优质猪肉生产的一个重要调控手段。近年来的研究表明，亮氨酸不仅可以调节哺乳动物骨骼肌蛋白质的代谢[3]，还可加速体内脂肪氧化分解，减少脂肪在体内的沉积以及脂肪细胞中甘油三酯的含量[4-5]。另外，亮氨酸还可显著增加肥育猪肌内脂肪的含量[6]。饲粮添加谷氨酸可降低肥育猪背膘厚[7]，提高肌内脂肪含量[8]，改善肌肉中脂肪酸的组成[9]。不过也有研究表明，饲粮添加谷氨酸可增加脂肪在体内的沉积，引起肥胖[10]。笔者前期研究表明，饲粮添加1.00%亮氨酸可提高背最长肌和股二头肌中肌内脂肪含量，且不影响肥育猪的生长性能；添加1.00%谷氨酸后，肥育猪背膘厚降低了34.3%；而添加1.00%亮氨酸+1.00%谷氨酸提高了股二头肌肌内脂肪含量，且不影响肥育猪的生长性能[11]。由上可见，亮氨酸和谷氨酸在调控动物机体脂质代谢方面均具有一定作用，且其作用靶点不尽相同，但其具体作用机制尚不明确。脂肪的沉积取决于脂肪合成和分解2个动态过程，该过程受到多个基因的调控。因此，本试验进一步探讨饲粮添加亮氨酸和谷氨酸对肌肉脂肪酸组成和脂质代谢相关基因表达的影响，旨在揭示其调控脂质代谢的分子机制，为功能性氨基酸用于优质猪肉的生产提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物、分组与饲养管理试验选取平均体重为77 kg左右的杜×长×大肥育猪60头，随机分为5组，每组12头，公母各占1/2，饲喂于HHIS-02A型全自动饲喂系统(河南河顺自动化设备有限公司产品)中。对照组饲喂基础饲粮，在基础饲粮中添加2.05% L-丙氨酸(L-丙氨酸可被机体多个组织分解代谢，因而可调节饲粮氮平衡[12])作为等氮对照组，试验组在基础饲粮中分别添加1.00%亮氨酸+1.37% L-丙氨酸(亮氨酸组)、1.00%谷氨酸+1.44% L-丙氨酸(谷氨酸组)、1.00%亮氨酸+1.00%谷氨酸(亮氨酸+谷氨酸组)。参照NRC(2012)猪营养需要推荐量配制玉米-豆粕型基础饲粮，其组成及营养水平见表 1。饲养试验在位于湖南新五丰股份有限公司永安分公司的中国科学院亚热带农业生态研究所动物试验基地开展，试验期为60 d。饲养试验期间自由采食和饮水。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
饲养试验结束后，颈动脉放血处死试验猪，采集背最长肌和股二头肌，液氮速冻后-80 ℃保存，用于分子生物学分析；另外各取100 g肌肉样品于-20 ℃保存，用于脂肪酸含量测定。
1.3 脂肪酸含量测定取肌肉冻干样品，用石油醚-乙醚(1 : 1，体积比)提取脂肪后，用1 mL氢氧化钾-甲醇溶液(0.4 mol/L)酯化30 min，然后热水浴浓缩，加水分层，取500 μL上层液用气相色谱-质谱联用仪(Agilent Technologies，美国)测定，由微机按面积归一化法计算脂肪酸各组分的含量，各脂肪酸含量以占总脂肪酸的百分比表示。
1.4 脂质代谢相关基因表达测定采用Trizol试剂盒(TaKaRa，大连)提取肌肉样品中的总RNA，经紫外可见分光光度计(NanoDrop ND-1000，Thermo Fisher, 美国)测定其在260和280 nm处吸光度的比值在1.80~2.10，琼脂糖凝胶电泳法检测其RNA质量。将RNA浓度调整为1 000 ng/μL，参照TaKaRa反转录试剂盒说明书，分别准确吸取1.0 μL总RNA样品进行逆转录，合成cDNA。采用Primer 5.0软件设计引物，PCR引物序列见表 2。以cDNA为模板，采用荧光定量PCR技术检测肌肉中脂质代谢相关基因mRNA的相对表达量。10 μL反应体系包括：5 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，2 μL cDNA，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，3.2 μL ddH2O。反应条件为：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。根据目的基因和内参基因的阈值循环(Ct)，采用2-△△Ct法计算样品中各目的基因mRNA的相对表达量。
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表 2 PCR引物序列 Table 2 Sequences of primers for PCR |
采用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行Duncan氏法多重比较，结果以“平均值±标准误”表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 饲粮添加亮氨酸和谷氨酸对肥育猪背最长肌中脂肪酸组成的影响由表 3可知，与对照组相比，亮氨酸组背最长肌中C18 : 0含量显著降低(P < 0.05)，C18 : 2n-6和C20 : 1含量显著增加(P < 0.05)；谷氨酸组背最长肌中C14 : 0和C16 : 0含量显著降低(P < 0.05)，C17 : 0、C18 : 2n-6和C20 : 1含量显著增加(P < 0.05)。
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表 3 饲粮添加亮氨酸和谷氨酸对肥育猪背最长肌中脂肪酸组成的影响(占总脂肪酸的百分比) Table 3 Effects of dietary Leu and Glu on fatty acid composition in longissimus dorsi muscle of finishing pigs (percentage of total fatty acids) |
由表 4可知，与对照组相比，亮氨酸组股二头肌中C16 : 0含量显著降低(P < 0.05)，谷氨酸组股二头肌中C18 : 2n-6含量显著增加(P < 0.05)。
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表 4 饲粮添加亮氨酸和谷氨酸对肥育猪股二头肌中脂肪酸组成的影响(占总脂肪酸的百分比) Table 4 Effects of dietary Leu and Glu on fatty acid composition in biceps femoris muscle of finishing pigs (percentage of total fatty acids) |
由表 5可知，与对照组相比，亮氨酸组背最长肌中脂肪酸转运蛋白1(FATP-1)mRNA的相对表达量显著上调(P < 0.05)，脂蛋白脂酶(LPL)mRNA的相对表达量显著下调(P < 0.05)；亮氨酸+谷氨酸组背最长肌中脂肪酸转运蛋白4(FATP-4)mRNA的相对表达量显著下调(P < 0.05)。与等氮对照组相比，亮氨酸组背最长肌中FATP-1和FATP-4 mRNA的相对表达量显著上调(P < 0.05)，谷氨酸组和亮氨酸+谷氨酸组LPL mRNA的相对表达量显著上调(P < 0.05)。
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表 5 饲粮添加亮氨酸和谷氨酸对肥育猪背最长肌中脂质代谢相关基因表达的影响 Table 5 Effects of dietary Leu and Glu on expression of genes related to lipid metabolism in longissimus dorsi muscle of finishing pigs |
由表 6可知，与对照组相比，谷氨酸组和亮氨酸+谷氨酸组股二头肌中FATP-4 mRNA的相对表达量显著下调(P < 0.05)。
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表 6 饲粮添加亮氨酸和谷氨酸对肥育猪股二头肌中脂质代谢相关基因表达的影响 Table 6 Effects of dietary Leu and Glu on expression of genes related to lipid metabolism in biceps femoris muscle of finishing pigs |
肌肉中脂肪的含量及脂肪酸的组成对猪肉品质具有重要影响，深入了解营养素调控肌肉中脂质代谢的分子机制，将有助于提高动物的胴体性状和肉品质，为消费者提供优质的肉类产品。脂肪酸组成是影猪肉风味、营养价值及氧化稳定性的一个重要因素。本试验结果发现，饲粮添加亮氨酸可显著降低肥育猪背最长肌中C18 : 0[属于饱和脂肪酸(SFA)]，显著增加C18 : 2n-6[属于多不饱和脂肪酸(PUFA)]的含量；添加谷氨酸可显著降低肥育猪背最长肌中C14 : 0和C16 : 0(属于SFA)，显著增加背最长肌和股二头肌中C18 : 2n-6(属于PUFA)的含量；而同时添加亮氨酸和谷氨酸对肥育猪肌肉中脂肪酸组成未产生显著影响。SFA摄入过多不但会增加消费者患心血管疾病的风险[13]，还易引起肌肉组织胰岛素抵抗[14]，而PUFA则可预防心血管疾病[13]。C18 : 2n-6，即亚麻油酸，是一种必需脂肪酸，具有抗炎和免疫调节等作用[15-16]。上述结果提示，饲粮添加亮氨酸或谷氨酸可通过降低肌肉中SFA含量来改善肌肉中脂肪酸的组成，进而提高猪肉的营养价值。然而Kong等[17]研究表明，饲粮添加谷氨酸提高了生长猪背最长肌中C16 : 0的含量，上述差异可能是由于基础饲粮和肥育猪的生长阶段不同造成的。
笔者前期研究发现，饲粮添加1.00%亮氨酸和1.00%谷氨酸显著提高了肥育猪背最长肌和股二头肌中肌内脂肪的含量[11]，因此本研究进一步检测了肌肉中与脂质代谢相关基因的表达情况，进一步探讨亮氨酸和谷氨酸影响肌内脂肪代谢的机制。本研究发现，饲粮添加亮氨酸可显著上调肥育猪背最长肌中FATP-1和FATP-4基因的表达。FATP-1和FATP-4是脂肪酸转运蛋白家族的2个成员，在脂肪酸转运过程中发挥着重要作用。敲除FATP-1基因可减少肌肉细胞对长链脂肪酸(LCFA)的摄取、降低肌肉中甘油三酯的沉积[18]，过表达FATP-1基因可提高肌肉细胞对葡萄糖的氧化[19]；而FATP-4基因的表达量则与肥胖有关[20]。上述结果提示，饲粮添加亮氨酸可能通过促进肌肉细胞对LCFA的摄取，进而促进脂肪在肌肉中的沉积。笔者前期研究发现饲粮同时添加亮氨酸和谷氨酸组合可显著提高背最长肌肌内脂肪含量[11]，然而本试验中饲粮同时添加亮氨酸和谷氨酸则显著下调了背最长肌中FATP-1和FATP-4基因表达，其具体机制还有待进一步研究。
乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶(FAS)是合成脂肪酸的2个关键酶[21]，FAS基因表达量上升可显著促进甘油三酯的沉积，进而引起肥胖[22]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是调节脂肪分化的核心调控因子，具有脂肪组织特异性，除了直接参与脂肪分化外，还可调节FAS、ACC、LPL和激素敏感脂酶(HSL)等基因的表达[23]，间接影响脂质代谢。可见，ACC、FAS和PPARγ基因均与脂肪合成代谢有关。在本试验中，饲粮添加亮氨酸、谷氨酸和亮氨酸+谷氨酸均未对育肥猪肌肉中ACC、FAS和PPARγ的表达产生显著影响，提示亮氨酸和谷氨酸增加肌内脂肪含量可能不是通过上调脂肪合成基因表达实现的。本研究结果与Madeira等[24]的结果一致，即饲粮添加亮氨酸不显著影响背最长肌中ACC和FAS基因的表达；而Kong等[17]研究发现，饲粮添加谷氨酸可提高背最长肌中肌内脂肪含量，上调ACC基因的表达。结果不一致的原因可能是因为基础饲粮不同，Kong等[17]是在高脂饲粮中添加谷氨酸。
FAS可催化乙酰辅酶A生成C16 : 0[25]。在本研究中，饲粮添加谷氨酸显著降低了肥育猪背最长肌中C16 : 0的含量，饲粮添加亮氨酸显著降低了股二头肌中C16 : 0的含量，但未对肌肉中FAS mRNA的相对表达量产生显著影响，提示亮氨酸和谷氨酸可能不影响C16 : 0的合成代谢，但可上调与C16 : 0分解相关基因的表达。LPL的主要功能是催化水解乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯，动物体内LPL活性是决定外周组织从血浆中摄取甘油三酯的重要因素，其表达量增加能够显著增加脂肪在皮下和肌肉中的沉积[25-26]。本试验结果表明，饲粮添加谷氨酸和亮氨酸+谷氨酸可显著上调肥育猪背最长肌中LPL基因的表达，提示其可通过调控LPL基因的表达影响肌肉中脂肪的沉积。
4 结论饲粮添加亮氨酸可显著降低肥育猪背最长肌中C18 : 0含量，显著增加C18 : 2n-6含量；饲粮添加谷氨酸可显著降低肥育猪背最长肌中C14 : 0和C16 : 0含量，显著增加C18 : 2n-6含量；饲粮同时添加亮氨酸和谷氨酸对肥育猪肌肉中脂肪酸的组成未产生显著影响，但可显著上调背最长肌中LPL基因的表达。
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