2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 亚热带农业生态过程 重点实验室, 湖南省畜禽健康养殖工程技术中心, 长沙 410125;
3. 湖南农业大学, 湖南省植物功能成分利用协同创新中心, 长沙 410128;
4. 湖南美可达生物 资源有限公司, 长沙 410128;
5. 浏阳市畜牧兽医水产局, 浏阳 410300
, KANG Baoju1,2, ZENG Jianguo3, HU Haibo4, ZHAO Yurong1, CHEN Liu5, YAO Kang1,2
, FU Chenxing1,3
2. Hunan Provincial Engineering Research Center for Healthy Breeding of Livestock and Poultry, Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. Hunan Collaborative Innovation Center for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;
4. Hunan Micolt Bioresource Co., Ltd., Changsha 410128, China;
5. Bureau of Animal Husbandry and Veterinary and Aquaculture in Liuyang City, Liuyang 410300, China
在现代生猪生产中，为了提高母猪繁殖效率，降低母子间疾病传播几率等，早期断奶早已被采用。然而由于生理、营养和环境的突然改变，导致断奶仔猪采食量下降、肠道疾病频发、生长阻滞、死亡率提高，通常称之为断奶应激综合征[1]。尽管在断奶仔猪饲粮中添加抗生素能在一定程度上提高动物的生长性能和抗病能力，缓解断奶应激综合征[2]，但是抗生素类饲料添加剂的大量使用，甚至滥用，导致畜禽胃肠道内的细菌耐药性大幅提高，动物体内残留和环境污染等问题日渐加剧，从而影响动物源性的食品安全，并直接影响人类健康和环境安全[3-4]。因此，迫切需要开发新的无药物残留、无污染、无抗药性的绿色抗生素用于畜牧养殖业。血根碱是从博落回中分离出来的苯菲啶异喹啉类生物碱，具有使用后易降解，对环境污染小的优势，其成分特殊，作用机理独特[5-6]。血根碱及其衍生物具有较强的细胞渗透性，对一些病原菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等具有较强抑制作用[7]。血根碱还具有抗肿瘤[8-10]、增强免疫力[11]、抗炎[12]、抗氧化[13]等多种药理作用，由此可见，血根碱以其特有的药理学特性，具有开发成新型绿色饲料添加剂的潜力。随着血根碱在人类临床中的广泛应用，其在畜禽养殖业中的应用也备受关注。Kosina等[13]研究表明，在28日龄断奶仔猪饲料中添加含3.75 mg/kg血根碱的博落回生物碱，能够刺激仔猪食欲来增加采食量，保护肠道内必需氨基酸的降解，进而促进动物生长。Lee等[14]和刘靖[15]研究表明，肉鸡饲粮中血根碱与有机酸联用能够改善肠道结构及肠道菌群平衡而达到促生长效果。云龙[16]研究发现，饲粮中添加血根碱能显著提高黄羽肉鸡血清免疫球蛋白M(IgM)含量，并改善肠道形态结构，促进鸡的生长性能。目前，有关血根碱在畜禽中促生长效果的原因还不是很明确，但都提到可能与改善肠道健康有关，而其对断奶仔猪肠道形态结构及免疫功能的影响研究尚未见报道。基于此，本试验在断奶仔猪饲粮中添加血根碱，探讨其对断奶仔猪生长性能、肠道形态结构及小肠黏膜免疫功能的影响，旨在为开发安全、高效、环保的无抗仔猪饲粮提供理论依据和参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料血根碱制剂：血根碱有效浓度为1.5%，由湖南美可达生物资源有限公司提供；所用抗生素为金霉素，有效成分含量为15%，市售产品。
1.2 试验动物与试验设计试验选取23日龄平均体重为(6.55±0.18) kg的健康“杜×长×白”三元杂交断奶仔猪36头，按体重相近、性别比例相同原则随机分为3组，分别饲喂基础饲粮(对照组)、基础饲粮+75 mg/kg金霉素(抗生素组)、基础饲粮+50 mg/kg血根碱(血根碱组)，每组12个重复，每个重复1头猪，试验期21 d。
1.3 试验饲粮与饲养管理试验基础饲粮按照NRC(2012)[17]饲养标准配制，其组成及营养水平见表 1。本试验在中国科学院亚热带农业生态研究所动物楼饲养室进行，仔猪采用不锈钢单笼饲养。每天对仔猪进行喂食3次，时间分别为07:30、12:00和18:30，自由采食和饮水，粉料饲喂，以食槽无剩料为原则。试验期间每日准确记录每头猪的实际采食量，观察猪群的健康情况。室内消毒、清扫按常规程序进行，并保持猪舍通风、清洁。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (as fed-basis) |
于试验结束后，禁食12 h，所有试验猪静脉注射150.00 mg/kg BW戊巴比妥钠，待其麻醉后，按常规程序进行屠宰，并采集小肠各段[包括十二指肠(距幽门约10 cm处)、空肠(小肠中段)及回肠(距回盲肠结远端约5 cm处)]各2.5 cm，固定于10%中性甲醛溶液中，用于制作石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色以检测肠道形态。各肠段剩余部分用剪刀轻轻剖开10 cm左右的十二指肠、空肠和回肠肠段，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻冲洗肠壁内容物，并用滤纸吸干肠段表面的水分，而后用玻璃载玻片刮取肠黏膜，使用锡箔纸将样品进行包裹，立即放入液氮中速冻，然后转移至-80 ℃冰箱中保存待测。
1.5 测定指标及方法 1.5.1 生长性能饲养试验开始第1天早晨对每头仔猪进行空腹称重，为初始体重，饲养试验结束后再次称重，记录仔猪的体重，并计算出每组仔猪的平均日增重(ADG)；记录每头仔猪每天的给料量和剩料量，计算每组仔猪的平均日采食量(ADFI)以及料重比(F/G)。计算公式如下：
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每天08:00观察断奶仔猪粪便情况，记录每组仔猪日腹泻头数及腹泻天数，计算腹泻率：
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取出10%甲醛溶液中固定的肠道组织，经常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色后，利用Motic Images Advanced 3.2软件，测量十二指肠、空肠、回肠隐窝深度和绒毛高度，每张切片观察10个视野，并计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)值[18]。
1.5.3 小肠黏膜免疫球蛋白含量参考王斌星等[2]的方法，将十二指肠、空肠和回肠黏膜溶于2 mL PBS(pH＝7.4)中，于3 500 ×g离心5 min，收集上清液。小肠黏膜免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和IgM含量均采用猪酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定，具体测定方法见ELISA Kit(南京森贝伽生物科技有限公司)说明书。
1.6 统计分析试验数据用Excel 2013进行初步处理，用软件SPSS 20.0进行统计分析，采用Duncan氏法进行多重比较和差异显著性检验，腹泻率采用非参数Kruskal-Wallis检验，数据以平均值±标准误表示。以P＜0.01作为差异极显著的判断标准，P＜0.05作为差异显著的判断标准，0.05≤P＜0.10作为呈升高或降低趋势的判断标准。
2 结果与分析 2.1 血根碱对断奶仔猪生长性能的影响由表 2可知，与对照组相比，血根碱组和抗生素组的ADG和ADFI显著提高(P＜0.05)，F/G和腹泻率显著降低(P＜0.05)；但血根碱组与抗生素组间以上生长性能指标均无显著性差异(P＞0.05)。由此推断，饲粮中添加血根碱可以提高断奶仔猪的生长性能，且效果与添加抗生素相当。
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表 2 血根碱对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of sanguinarine on growth performance of weaned piglets |
由图 1和表 3可知，与对照组相比，血根碱组和抗生素组的十二指肠绒毛高度、V/C值显著升高(P＜0.05)，空肠绒毛高度、V/C值极显著升高(P＜0.01)，但血根碱组和抗生素组间以上指标均无显著差异(P＞0.05)；而血根碱组回肠绒毛高度、V/C值显著高于其他2组(P＜0.05)。由此推断，饲粮中添加血根碱可以增加断奶仔猪肠道黏膜表面积，从而提高营养物质的吸收效率。
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图 1 断奶仔猪小肠形态学检测 Figure 1 Detection of small intestine morphology of weaned piglets (100×) |
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表 3 血根碱对断奶仔猪小肠形态的影响 Table 3 Effects of sanguinarine on small intestinal morphology of weaned piglets |
由表 4可知，与对照组相比，血根碱组和抗生素组十二指肠黏膜IgA含量显著升高(P＜0.05)，IgM含量极显著升高(P＜0.01)；空肠黏膜IgA和IgG含量显著升高(P＜0.05)；回肠黏膜IgG和IgM含量显著升高(P＜0.05)，IgA含量极显著升高(P＜0.01)。但血根碱组和抗生素组间以上指标均无显著差异(P＞0.05)。由此推断，饲粮中添加血根碱可以提高断奶仔猪的肠道免疫功能。
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表 4 血根碱对断奶仔猪小肠黏膜免疫球蛋白含量的影响 Table 4 Effects of sanguinarine on immunoglobulin contents in small intestinal mucosa of weaned piglets |
血根碱是一种新型待开发的植物性生物碱，其作为一种饲料添加剂在动物营养和饲料中的应用，主要是基于作为抗生素的替代物来进行的[19]。长期大量使用抗生素会引起病原菌耐药性增强、肠道正常菌群结构被破坏以及药物残留等一系列的问题，给人类健康造成潜在的威胁。大鼠的安全评估研究表明，高剂量的血根碱及其衍生物长期饲喂大鼠90 d，不引起机体损伤，且其原形物或代谢产物不在体内残留[20]。同时国内外一些研究表明，血根碱在畜禽应用中有显著的促生长和降低腹泻效果。饶华等[21]研究发现，饲粮中添加血根碱能显著提高断奶仔猪ADG和ADFI，降低腹泻率和缓解仔猪断奶应激，同时与添加金霉素相比，ADG和ADFI差异不显著。戴波[22]研究也发现，在饲粮中添加血根碱能够降低断奶仔猪腹泻率。Kantas等[23]研究表明，饲粮中添加50 mg/kg血根碱能够增加断奶仔猪的体重和ADG。Vieira等[24]研究报道，在火鸡饲粮中添加50 mg/kg血根碱，提高了火鸡的生长性能。本研究发现，饲粮中添加50 mg/kg血根碱显著提高了断奶仔猪的ADG和ADFI，显著降低了腹泻率，并达到与抗生素相当的效果，这与上述研究结果基本一致，其促生长作用机理可能是：1)血根碱与色氨酸结构相似，具有类似的含氮环状结构，可以抑制肠道内芳香族氨基酸脱羧酶活性，减少芳香族氨基酸降解，提高仔猪对色氨酸、苯丙氨酸在小肠中的利用效率，增加蛋白质的沉积[25]；2)也可能是由于血根碱具有抗氧化功能，降低了肌肉的抗氧化反应，减少氧化应激[13]；3)还可能是因为饲粮中添加血根碱增加了空肠和回肠相对长度[14]，改变了肠道形态，进而促进了有效的营养吸收，提高了饲粮消化率，从而促进仔猪生长。
小肠作为动物消化、吸收的主要场所，常作为衡量动物消化吸收功能的重要指标。小肠黏膜形态结构的完整性与否是保证动物消化吸收功能的关键。而小肠绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度及V/C值是反映小肠黏膜形态结构及功能完整性最直接的指标[26]。小肠绒毛高度越大，小肠吸收面积就越大；肠绒毛宽度越大、隐窝越深，消化吸收功能就越低；V/C值越大，消化吸收能力就越强[27]。Lee等[14]研究发现，饲粮中添加血根碱增加了肉鸡空肠和回肠相对长度。贺喜等[28]研究表明，饲粮中添加博落回生物碱可以显著提高黄羽肉鸡V/C值。本试验结果发现，饲粮中添加血根碱显著提高了绒毛高度和V/C值，且有降低空肠隐窝深度的趋势，这与血根碱促进断奶仔猪生长性能的结果相一致[29]。上述结果说明血根碱可以改善断奶仔猪肠道黏膜形态结构的发育，从而提高对营养物质的消化吸收能力，进而提高动物的生长性能。李杰等[30]利用体外培养猪肠道上皮细胞(intestinal porcine epithelial cells，IPEC-1)研究表明，血根碱浓度在0.006 25~0.1 μg/mL对IPEC-1的增殖有显著的促进作用。这说明血根碱可能通过促进小肠细胞增殖分化更新，从而增强小肠消化、吸收、免疫屏障和应激反应等。此外，血根碱改善小肠黏膜组织结构还可能与血根碱作为抗菌物质，能够抑制大肠杆菌等病原菌在肠道上定植，增加肠道乳酸杆菌的数量[31]，从而对肠道黏膜起到保护作用有关。本试验中，血根碱与抗生素对断奶仔猪小肠生长发育的影响无显著差异。抗生素可有效抑制病原菌的增殖，但会破坏胃肠道微生物菌群结构，血根碱能够通过竞争性抑制有害病原菌的繁殖[32-34]，从而对肠道菌群结构起到保护作用[14]。同时，这也在一定程度解释了血根碱降低断奶仔猪腹泻的原因。对于血根碱对断奶仔猪肠道菌群结构和肠道发育的影响，还需进一步深入研究。
动物试验证明博落回具有较好的免疫增强作用，可提高血清白蛋白/球蛋白值，对T淋巴细胞和B淋巴细胞功能均有刺激作用[35-36]。血根碱作为博落回中主要有效成分，近几年，中国一些兽药公司把血根碱作为免疫增强剂添加到饲料中，用于提高动物的免疫力。满意等[37]研究表明，饲粮中添加博落回提取物能够提高断奶仔猪血清IgG含量，显著改善免疫功能，明显增强断奶仔猪抗病能力，从而改善生长性能，且其效果优于土霉素。本试验结果显示，饲粮中添加血根碱可显著提高断奶仔猪小肠黏膜IgA、IgG和IgM含量，达到与抗生素相当的效果，这与云龙[16]和何夏阳[29]的研究结果相一致。
4 结论饲粮中添加血根碱可以改善肠黏膜形态，提高小肠黏膜免疫功能，从而提高断奶仔猪的生长性能，达到与添加抗生素相当的效果。结果提示，血根碱可有效缓解断奶应激，用于减少或替代抗生素在断奶仔猪饲粮中的使用。
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