2. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 兰州 730070;
3. 北京市畜牧总站, 北京 100107;
4. 厦门泓禾谷生物科技有限公司, 厦门 361000
, QI Guanghai1, WANG Xiaocui1, WU Shugeng1
, ZHANG Haijun1, WANG Jing1, SHI Zhaoguo2, WANG Liang3, WANG Hui4
2. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
3. Beijing General Station of Animal Husbandry, Beijing 100107, China;
4. Xiamen Honghegu Biotechnology Co., Ltd., Xiamen 361000, China
肉鸡养殖业是我国畜牧业中发展速度最快、规模化水平最高的产业[1]。饲用抗生素广泛、大量地应用于畜牧养殖业中[2]，在预防疾病促生长的同时，导致细菌耐药性增强[3-4]，世界上的“禁抗”始于1986年，当今越来越多的国家推出了自己的“禁抗”和“限抗”行动。因此，通过营养调控肉鸡健康状况成为当今的研究热点。
乳酸菌(Lactobacillus)和酵母菌(Saccharomycetes)可促进肉仔鸡脾脏、胸腺和法氏囊等免疫器官发育[5-9]，显著增加泪液、器官液、肠液和胆汁中免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)的含量[10]，进而提高免疫力。乳酸菌和酵母菌通过代谢产物的互补和群体感应作用相互促进生长，本课题组前期研究已证实饲粮添加0.1%乳酸菌和酵母菌复合制剂可通过调控肠道健康，改善肉仔鸡的生长性能[11]。目前，关于乳酸菌和酵母菌复合制剂替代抗生素及与抗生素联合使用对肉鸡抗氧化能力和免疫功能影响的研究还不充分，不能较好地解释乳酸菌和酵母菌复合制剂改善生长性能[11]的机理。因此，本试验通过研究饲粮中添加乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清生化指标、抗氧化能力和免疫功能的影响，以期为该微生态制剂在肉仔鸡养殖生产中的合理应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料乳酸菌和酵母菌复合制剂由厦门泓禾谷生物科技有限公司提供，其中乳酸菌(BCRC 16092)的活菌数为2.5×109 CFU/g，酵母菌(BCRC 20262)的活菌数为1.3×109 CFU/g。维吉尼亚霉素购自美国辉宝有限公司，有效成分含量为50%。
1.2 试验设计与饲养管理随机选取400只1日龄的健康爱拔益加(AA)肉仔鸡公雏，根据体重相近的原则分为4组，分别饲喂基础饲粮(对照组)，基础饲粮+30 mg/kg维吉尼亚霉素(VM组)、基础饲粮+15 mg/kg维吉尼亚霉素+0.1%乳酸菌和酵母菌复合制剂(饲粮中乳酸菌活菌数实测值为2.3×106 CFU/g、酵母菌活菌数实测值为1.3×106 CFU/g，VM+LS组)、0.1%乳酸菌和酵母菌复合制剂(饲粮中乳酸菌活菌数实测值为2.3×106 CFU/g、酵母菌活菌数实测值为1.3×106 CFU/g，LS组)，每组5个重复，每个重复20只鸡。采用4层立体网上笼养，试验期42 d，分为前期(1~21日龄)和后期(22~42日龄)。基础饲粮参照NRC(1994)和我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)，结合《AA肉仔鸡饲养手册》配制，其组成及营养水平见表 1。各组饲粮经冷压制粒(制粒过程中最高温度65 ℃)，迅速冷却。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
试验期间，自然光照加人工补光，试验前7天每天24 h光照，之后每天23 h光照，全期自由采食、饮水。试验前3天室温维持在33 ℃，此后每周降低2 ℃，直至将至24 ℃后维持不变。按照《AA肉仔鸡饲养管理手册》操作，对雏鸡常规免疫、消毒。试验期内，每天24 h记录鸡舍温度和湿度，清扫卫生，记录死淘鸡数。
1.3 测定指标与方法 1.3.1 免疫器官指数分别于试验第21天(21日龄)和第42天(42日龄)，每个重复选取2只体重与该重复平均值接近的试验鸡，颈静脉放血致死，分离完整的脾脏、法氏囊和胸腺，称重并计算器官指数。免疫器官指数计算公式如下：
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分别于试验第21天(21日龄)和第42天(42日龄)，每个重复选取2只与该重复平均体重接近的试验鸡，翅静脉采血5 mL，抗凝管存放，3 000 r/min离心10 min，取上清液分装于1.5 mL Eppendorf管中，-20 ℃保存，待分析血清生化指标、抗氧化指标和免疫球蛋白含量。
1.3.2.1 血清生化指标血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性及总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、肌酐(CRE)、总胆红素(TBILI)、葡萄糖(GLU)含量采用试剂盒通过半自动生化分析仪(CHEM-5型)测定，所用试剂盒均购自上海科华生物技术有限公司。
1.3.2.2 血清抗氧化指标血清中总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性采用比色法测定，血清中丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定，血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，上述指标测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.3.2.3 血清免疫球蛋白含量血清中IgG、IgA和IgM含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定，所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.4 统计分析数据用SPSS 16.0软件的one-way ANOVA程序进行方差分析，当方差分析具显著性差异时进行Duncan氏法多重比较，P＜0.05为差异显著性标准。结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析 2.1 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清抗氧化指标的影响乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清抗氧化指标的影响见表 2。21日龄时，饲粮添加乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用显著影响了血清MDA含量(P＜0.001)和GSH-Px活性(P＝0.049)；与对照组相比，VM组、VM+LS组和LS组的血清MDA含量显著降低(P＜0.05)；VM+LS组和LS组的血清GSH-Px活性显著高于对照组和VM组(P＜0.05)，VM+LS组与LS组之间无显著差异(P＞0.05)。
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表 2 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of Lactobacillus and Saccharomycetes compound preparation and its combination with virginiamycin on serum antioxidant indexes of broilers |
42日龄时，饲粮添加乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用显著影响了血清T-AOC(P=0.035)、MDA含量(P=0.004)以及T-SOD(P＜0.001)和GSH-Px活性(P=0.004)；与对照组相比，VM+LS组的血清T-AOC显著提高(P＜0.05)，LS组与VM+LS组之间无显著差异(P＞0.05)；VM+LS组和LS组的血清MDA含量显著低于对照组(P＜0.05)，VM组与其他3组无显著差异(P＞0.05)；VM+LS组和LS组的血清T-SOD和GSH-Px活性显著高于对照组和VM组(P＜0.05)，且LS组的血清T-SOD活性显著高于VM+LS组(P＜0.05)。
上述结果表明，0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与15 mg/kg的维吉尼亚霉素联用均能提高肉仔鸡血清T-SOD和GSH-Px活性，降低血清MDA含量，改善机体的氧化还原状态。
2.2 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡免疫器官指数的影响乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡免疫器官指数的影响见表 3。饲粮添加乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对21和42日龄肉仔鸡的免疫器官指数均未产生显著影响(P＞0.05)，但是在数值上VM+LS组和LS组均高于对照组和VM组，且42日龄脾脏指数有提高的趋势(P=0.062)。
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表 3 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡免疫器官指数的影响 Table 3 Effects of Lactobacillus and Saccharomycetes compound preparation and its combination with virginiamycin on immune organ indexes of broilers |
上述结果表明，0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与15 mg/kg的维吉尼亚霉素联合使用有提高脾脏指数的趋势。
2.3 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清免疫球蛋白含量的影响乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清免疫球蛋白含量的影响见表 4。饲粮添加乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用显著影响21日龄肉仔鸡的血清IgG(P＜0.001)和IgA含量(P=0.001)。与对照组相比，VM+LS组和LS组21日龄肉仔鸡的血清IgG含量显著高于对照组和VM组(P＜0.05)，且LS组显著高于VM+LS组(P＜0.05)；LS组21日龄肉仔鸡的血清IgA含量显著高于其他各组(P＜0.05)。
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表 4 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清免疫球蛋白含量的影响 Table 4 Effects of Lactobacillus and Saccharomycetes compound preparation and its combination with virginiamycin on serum immunoglobulin contents of broilers |
饲粮添加乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用显著影响42日龄肉仔鸡的血清IgG(P＜0.001)、IgA(P=0.038)和IgM含量(P=0.011)。VM+LS组和LS组21日龄肉仔鸡的血清IgG含量显著高于对照组和VM组(P＜0.05)，且LS组显著高于VM+LS组(P＜0.05)；LS组21日龄肉仔鸡的血清IgA和IgM含量显著高于对照组和VM组(P＜0.05)，对照组和VM组之间无显著差异(P＞0.05)。
上述结果表明，0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与15 mg/kg的维吉尼亚霉素联合使用均能提高肉仔鸡的血清免疫球蛋白含量，且以单独添加乳酸菌和酵母菌复合制剂时作用效果更明显。
2.4 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清生化指标的影响乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清生化指标的影响见表 5。21日龄时，饲粮添加乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清AST、ALT和ALP活性以及TBILI、ALB、UA、GLU、TP和CRE含量均未产生显著影响(P＞0.05)。42日龄时，血清AST、ALT和ALP活性以及TBILI、UA、GLU、ALB和CRE含量各组间均无显著差异(P＞0.05)；相对于对照组，VM+LS组和LS组的血清TP含量分别提高11.07%和5.91%，差异均达到显著水平(P＜0.05)。
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表 5 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清生化指标的影响 Table 5 Effects of Lactobacillus and Saccharomycetes compound preparation and its combination with virginiamycin on serum biochemical indices of broilers |
上述结果表明，0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与15 mg/kg的维吉尼亚霉素联合使用均能提高肉仔鸡的血清TP含量，提示乳酸菌和酵母菌复合制剂促进了肉仔鸡的机体蛋白质合成。
3 讨论 3.1 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡血清生化指标的影响血清AST、ALT和ALP等酶类的活性能反映肝脏细胞受损情况及严重程度[12]。血清TP包括ALB和球蛋白，TP和ALB的含量反映机体蛋白质的吸收和代谢状况，TP含量升高不仅表明氨基酸、蛋白质的吸收利用率提高，也是维持机体体液免疫的重要基础[13]。研究发现，饲粮中添加0.1%~0.2%的乳酸菌未见显著影响肉仔鸡血清中ALP的活性[14]；饲粮中添加乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌复合微生态制剂后肉鸡血清TP含量显著增加[15]；饲粮中添加0.2%的植物乳杆菌显著提高了肉仔鸡血清中TP的含量[16]。本研究结果与上述报道相似，与对照组和30 mg/kg维吉尼亚霉素组相比，0.1%乳酸菌和酵母菌复合制剂提高了42日龄肉仔鸡血清中TP含量，但血清中ALB含量变化不显著，可能TP含量的升高与免疫球蛋白含量的升高有关，这与本试验中添加0.1%乳酸菌和酵母菌复合制剂后肉仔鸡血清免疫球蛋白含量升高的测定结果相一致。此外，当前关于乳酸菌或酵母菌与抗生素联合使用的研究较少，本研究中用乳酸菌和酵母菌复合制剂替代部分维吉尼亚霉素，结果表明0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂与15 mg/kg的维吉尼亚霉素联合使用组肉仔鸡42日龄的血清TP含量显著高于30 mg/kg维吉尼亚霉素组，且与0.1%乳酸菌和酵母菌复合制剂组无显著差异。这与本课题组前期发现的0.1%乳酸菌和酵母菌复合制剂与15 mg/kg维吉尼亚霉素联合使用具有更好的促生长效果[11]是一致的，说明0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂与15 mg/kg的维吉尼亚霉素联合使用提高机体蛋白质代谢的效果更明显，二者之间可能存在协同作用。
3.2 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡抗氧化能力的影响正常状态下，机体的自由基生成和消除处于动态平衡之中，但当动物遭受应激时，体内自由基产生过量而致氧化损伤。T-AOC是用于衡量动物机体抗氧化能力的重要指标，可反映机体非酶系统和氧化酶系统对机体内自由基代谢的状况，以及对外来刺激的代偿能力。MDA是脂质过氧化终产物，反映氧自由基介导的脂质过氧化程度；T-SOD和GSH-Px是生物机体内重要的抗氧化酶，影响机体线粒体内关键酶活性及线粒体呼吸链复合物活性。研究发现，饮水中添加乳杆菌和屎肠球菌可显著提高肉仔鸡的抗氧化水平[17]；饲粮中添加0.2%的植物乳酸菌显著提高了肉仔鸡血清T-AOC，可保护肉仔鸡免受氧化损伤，维持机体的健康状态[8]；饲粮中添加0.20%酵母培养物能显著降低肉仔鸡血清中MDA含量，维持机体健康状况[18]。本试验结果表明，饲粮中添加0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂显著提高了肉仔鸡的血清T-AOC，增强了机体防御体系的抗氧化能力；0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂显著提高了肉仔鸡的血清T-SOD活性，通过提高机体清除超氧阴离子自由基的能力，保护细胞免损伤；0.1%乳酸菌和酵母菌复合制剂显著提高了肉仔鸡血清GSH-Px活性，能够保护细胞膜的结构完整性，有效抵抗过氧化物的干扰及损害；0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂显著降低了血清MDA含量，说明机体内脂质过氧化程度降低；且随肉仔鸡日龄的增加，乳酸菌和酵母菌复合制剂的作用效果明显优于抗生素。由此表明，乳酸菌和酵母菌复合制剂通过改善肉仔鸡的氧化还原状态，维持更好的健康状况，从而改善生长性能[11]。
维吉尼亚霉素能不可逆地抑制细菌蛋白质的合成，导致细菌死亡，通常用于预防和治疗革兰氏阳性菌的感染。饲料中添加抗生素可提高24日龄肉仔鸡的血清T-AOC[8]，表明抗生素可能通过提高动物抗氧化能力，改善动物健康状况，这与本试验结果一致。本试验中，30 mg/kg维吉尼亚霉素组肉仔鸡的21日龄血清T-SOD活性高于对照组，且血清MDA含量较对照组显著降低，表明抗生素可提高机体清除超氧自由基的能力，提高抗氧化能力。此外，与对照组相比，LS组和VM+LS组肉仔鸡血清T-AOC以及SOD和GSH-Px活性均显著提高，血清MDA含量显著降低，体内脂质过氧化程度降低，且前期LS组效果明显，后期LS组和VM+LS组的效果相当，表明乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用可通过增强机体防御抗氧化能力体系，提高机体清除超氧阴离子自由基的能力，提高血清中GSH-Px活性来保护细胞膜的结构完整性，提高肉仔鸡的抗氧化能力，改善机体健康状况。
3.3 乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用对肉仔鸡免疫功能的影响胸腺和法氏囊是动物的中枢免疫器官，是禽类体液免疫的主要场所；脾脏是外周免疫器官，参与全身免疫，其相对重量增加说明机体免疫水平提高[19]。研究发现，与抗生素相比，0.2%的植物乳酸菌可使肉仔鸡脾脏指数和法氏囊指数分别提高40.6%和47.7%[8]，表明乳酸菌通过提高免疫器官指数增强外周和体液免疫力。本试验中，饲粮中添加0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与15 mg/kg的维吉尼亚霉素联合使用后，肉仔鸡的脾脏指数均有升高趋势，说明乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与维吉尼亚霉素联合使用有促进肉仔鸡免疫器官发育的作用。同时，本研究结果还显示，虽然免疫器官指数各组间差异不显著，但VM+LS组肉仔鸡的脾脏指数和法氏囊指数均有最大值，说明0.1%的乳酸菌和酵母菌复合剂与15 mg/kg的维吉尼亚霉素可能具有协同作用，需进一步试验证明。
免疫球蛋白是具抗体活性的动物蛋白质，具有抗菌、抗病毒和抗外毒素等多种功能，家禽体内主要有3种：IgA、IgG和IgM。IgG能激活补体、中和毒素；IgA进入黏膜表面、中和感染因子[6]，其含量直接反映了机体免疫力。研究发现，微生态制剂可促进机体产生非特异性免疫的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)[6]；饲粮中添加0.2%的植物乳酸菌后肉仔鸡血清IgG含量比抗生素组和对照组分别提高24.3%和16.2%[8]；饲粮中添加1%的草乳杆菌和格氏乳杆菌复合制剂能显著提高肉仔鸡血清IgA和IgG含量[20]；通过饮水摄入鸡源乳酸菌液后肉仔鸡血清IgG和IgA含量显著提高[21]。上述研究表明，乳酸菌无论是单独添加还是与其他菌复合添加，均可显著提高肉仔鸡机体的免疫功能。本试验中，与对照组相比，饲粮中添加0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂显著提高了肉仔鸡42日龄时血清IgG、IgA和IgM含量，说明乳酸菌和酵母菌复合制剂可显著提高肉仔鸡机体的免疫功能。
研究表明，饲粮中添加50 mg/kg的维吉尼亚霉素可显著提高肉鸡21日龄时血清中IgG的含量[22]，与本试验结果并不一致，产生差异的原因可能是2个试验中维吉尼亚霉素的添加剂量不同所致。此外，0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂与15 mg/kg的维吉尼亚霉素联合使用可使肉仔鸡42日龄时血清IgG含量高于显著对照组，说明乳酸菌和酵母菌复合制剂与维吉尼亚霉素可协同提高机体的免疫力。0.1%乳酸菌和酵母菌复合剂组肉仔鸡42日龄时血清IgG和IgM含量显著高于0.1%的乳酸菌和酵母菌复合剂与15 mg/kg的维吉尼亚霉素联合使用组，说明单独使用0.1%的乳酸菌和酵母菌复合剂比其与15 mg/kg维吉尼亚霉素联合使用有更好地提高机体免疫力的作用，从而改善肉仔鸡的健康状况，进而提高生长性能，这本课题组前期得出的生长性能的结果[11]是相一致的。
4 结论饲粮中单独添加0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂及其与15 mg/kg的维吉尼亚霉素联合使用均能提高肉仔鸡的抗氧化能力和免疫功能，改善健康状况，且以单独添加0.1%的乳酸菌和酵母菌复合制剂效果更明显。
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