相对于动物蛋白质，植物性蛋白质原料(如豆粕等)因其价廉、易得、储运方便等优点在饲料配方中的比例日渐增多。但植物性蛋白质原料中也存在大量的抗营养因子，如胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白等，极易造成动物(尤其是幼龄动物)的营养性腹泻。外源蛋白酶不仅可以补充动物内源蛋白酶的不足，降解大豆抗营养因子^[1]，防治营养性腹泻，还可以提高营养物质的消化利用率，因此关于饲用蛋白酶的研究备受关注^[2]。研究结果表明，添加蛋白酶可以提高断奶仔猪的日增重，降低料重比(F/G)，提高营养物质的表观消化率^[3]。但目前的研究多以复合酶为主，未见有单一蛋白酶使用效果对比的报道。因此，本研究旨在对比酸性、中性和碱性蛋白酶对苏淮断奶仔猪的生长性能、营养物质表观消化率以及血清生化指标的影响，集中探讨不同蛋白酶对营养性腹泻情况改善的效果，为饲料配方中蛋白酶的合理使用提供科学依据，也为苏淮猪的健康养殖提供科学指导。

1 材料与方法 1.1 试验材料

酸性、中性和碱性蛋白酶均购自山东隆科特酶制剂有限公司。酸性蛋白酶：产自黑曲霉，活性100 000 U/g，有效pH为2.0~6.0，最适pH为2.5~3.5；中性蛋白酶：产自枯草芽孢杆菌，活性100 000 U/g，有效pH为5.5~8.5，最适pH为6.8~7.0；碱性蛋白酶：产自地衣芽孢杆菌，活性200 000 U/g，有效pH为6.0~11.0，最适pH为9.5~10.5。

1.2 试验饲粮与营养水平

试验所用的饲粮配方参照NRC(1998)并结合苏淮猪的营养特点设计而成，试验料为机配粉状料。基础饲粮组成及营养水平见表 1。

1.3 试验动物与饲养管理

试验采用单因素随机区组设计，选择健康、平均体重为(9.24±0.84) kg的苏淮断奶仔猪120头，按体重、性别基本一致的原则随机分为4组，每组6个重复，每个重复5头猪。对照组饲喂基础饲粮，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂在基础饲粮中添加0.2 g/kg酸性蛋白酶、0.2 g/kg中性蛋白酶和0.1 g/kg碱性蛋白酶的饲粮。试验预试期5 d，正试期45 d。试验猪舍为封闭式猪舍，猪栏为半漏缝地板式。饲养管理方式采用常规方式(每天喂料3次，分别为07:00、14:00和17:00)，定期消毒、免疫、驱除蚊虫，试验猪自由采食和饮水。

1.4 样品采集与指标测定 1.4.1 生长性能

于正试期第1天和最后1天08:00空腹称重，得到平均初重和平均末重，计算出每头猪的平均日增重(ADG)；每周准确记录每组饲粮的投放量和剩余量，计算出每头猪的平均日采食量(ADFI)；根据ADG和ADFI计算F/G。

1.4.2 血清生化指标

于试验最后1天晨饲前进行采血，每个重复随机选取2头仔猪(公母各1头)从颈静脉采血10 mL，采血后立即3 000 r/min离心20 min，取血清装入1.5 mL EP管内，-20 ℃冷冻保存，待测。血清生化指标测定方法：采用双缩脲终点法检测总蛋白(TP)含量；采用溴甲酚绿比色法检测白蛋白(ALB)含量；采用分光光度法检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性；采用酶剂法检测甘油三酯(TG)含量；采用脲酶法检测尿素氮(UN)含量。上述指标测定所用试剂盒均购自北京金海科隅生物科技发展有限公司。

1.4.3 腹泻率与粪便指数

试验开始后以每个重复为单位，每天观察记录每栏仔猪的腹泻情况并进行粪便评分，评分标准：外观条形或粒状为正常，评分记0；软粪，能成形为轻度腹泻，评分记1；稠状，不成形，粪水无分离现象为中度，评分记2；液状，不成形，粪水有分离现象为严重，评分记3。当仔猪粪便评分≥2时，开始使用抗生素或止泻药进行治疗。试验结束时计算腹泻率与粪便指数，用腹泻率、粪便指数等指标反映腹泻程度。腹泻相关计算公式：

腹泻率=100×腹泻头数/总头数(单个重复的总头数)；

粪便指数=粪便评分之和/总头数。

1.4.4 营养物质表观消化率

于试验结束前1周进行消化试验，为期7 d，其中3 d适应期，4 d试验期。每个重复选取1头进行全收粪，记录每日采食量、每日产粪总重。每天收集100 g粪便，加入10 mL 10%硫酸溶液混匀冷冻保存，结束后再将4 d的粪样混匀，-20 ℃冷冻保存，待测。测定饲粮中和粪样中的干物质(DM)、有机物(OM)、粗蛋白质(CP)和粗脂肪(EE)含量。营养物质表观消化率计算公式：

营养物质表观消化率(%)=100×[食入的营养物质含量(g)-粪中该物质含量(g)]/食入的营养物质含量(g)。

1.5 数据处理

试验数据通过Excel 2003进行初步处理后，采用SPSS 22.0统计软件的ANOVA过程进行单因素方差分析，差异显著则用Duncan氏法进行多重比较，结果表示为平均值±标准差，P＜0.05作为差异显著的判断标准。

2 结果与分析 2.1 3种蛋白酶对断奶仔猪生长性能的影响

由表 2可知，酸性蛋白酶组(Ⅰ组)的ADG和ADFI均显著高于对照组(P＜0.05)，F/G低于对照组，但差异不显著(P＞0.05)；碱性蛋白酶组(Ⅲ组)的ADG显著高于对照组(P＜0.05)，F/G显著低于对照组(P＜0.05)；中性蛋白酶组(Ⅱ组)的ADG高于对照组，F/G低于对照组，但差异均不显著(P＞0.05)。

2.2 3种蛋白酶对断奶仔猪营养物质表观消化率的影响

由表 3可知，试验组的DM表观消化率和OM表观消化率均显著高于对照组(P＜0.05)，Ⅰ组和Ⅲ组的DM消化率和OM表观消化率显著高于Ⅱ组(P＜0.05)；Ⅰ组的CP表观消化率显著高于对照组、Ⅱ组和Ⅲ组(P＜0.05)。

2.3 3种蛋白酶对断奶仔猪腹泻情况的影响

由表 4可知，各试验组的腹泻率和粪便指数均低于对照组。在试验第31~45天这一时期，各试验组的腹泻率和粪便指数均显著低于对照组(P＜0.05)，Ⅲ组的腹泻率和粪便指数最低。

2.4 3种蛋白酶对断奶仔猪血清生化指标的影响

由表 5可知，Ⅱ组血清AST活性显著高于Ⅰ组、Ⅲ组和对照组(P＜0.05)；各试验组血清中UN含量都低于对照组，但只有Ⅰ组与对照组差异显著(P＜0.05)。

3 讨论 3.1 3种蛋白酶对断奶仔猪生长性能的影响

幼龄动物的胃肠道发育不完善，哺乳仔猪断奶后，体内消化酶活性大幅度降低，如胃蛋白酶^[4]等，故在饲粮中添加外源蛋白酶尤为重要。Han等^[5]研究发现，将含有酸性蛋白酶的饲用复合酶添加到保育猪饲粮中，增强了肠道相关消化酶的活性，提高了保育猪的生长性能。本试验中，各试验组的生长性能均优于对照组，这与Zuo等^[6]的结果一致，其中Ⅰ组的末重、ADG和ADFI都显著高于对照组，F/G降低了4.78%；Ⅱ组的末重、ADG和ADFI较对照组分别提高5.81%、8.80%和4.27%，F/G较对照组降低4.07%；Ⅲ组的ADG显著高于对照组，末重和ADFI较对照组分别提高3.63%和2.56%，F/G显著低于对照组。本试验中，Ⅰ组的末重较Ⅱ组和Ⅲ组分别提高了2.63%和4.80%，ADG较Ⅱ组和Ⅲ组分别提高了4.35%和1.94%，ADFI较Ⅱ组和Ⅲ组分别提高了3.28%和5.00%，可见酸性蛋白酶在生长性能方面的效果优于中性蛋白酶和碱性蛋白酶，这与卢晨等^[7]的试验中中性蛋白酶优于酸性蛋白酶的研究结果不一致。原因可能是本试验采用的蛋白酶均为普通粉剂，未做任何包被处理，只有酸性蛋白酶可以适应胃液的酸性条件，能优先发挥作用，使饲粮中CP在胃中初步消化分解的作用增强，促进营养物质在小肠内的消化吸收；而中性和碱性蛋白酶不能适应胃部酸性环境，被部分破坏分解，酶活降低，使得效果低于酸性蛋白酶。且本试验酶活水平较卢晨等^[7]试验酶活水平高一个数量级，极大地补充了胃蛋白酶的不足，增强了胃消化功能。在自由采食条件下，仔猪未完善的消化系统难以充分消化摄入的营养物质，酸性蛋白酶可增强胃的消化功能，降低小肠的消化负担，提高生长性能。

3.2 3种蛋白酶对断奶仔猪营养物质表观消化率的影响

李同洲等^[8]研究发现，在断奶仔猪饲粮中添加含有蛋白酶的复合酶，可以提高CP的消化率，最佳可提高1.52%，并且指出蛋白酶是断奶仔猪酶制剂配方的首选成分。本试验中，Ⅰ组的CP表观消化率较对照组提高5.32%，较Ⅱ组和Ⅲ组分别提高4.99%和3.72%。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组DM表观消化率分别较对照组提高6.14%、3.22%和5.79%，Ⅰ组和Ⅲ组又显著高于Ⅱ组；Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组OM表观消化率较对照组提高4.81%、2.22%和4.38%，Ⅰ组和Ⅲ组也显著高于Ⅱ组；从数据可以看出，Ⅰ组的DM表观消化率、OM表观消化率和CP表观消化率都高于Ⅱ组和Ⅲ组。本试验中各试验组的CP表观消化率较对照组均有提高，这与Yu等^[9]的结果一致。有研究表明，蛋白酶使用可提高CP和氨基酸在回肠的消化率^[10]，在Zuo等^[6]的试验中，营养物质消化率也获得提高。外源添加蛋白酶也可能因作用位点等方面的不同，将一些动物内源蛋白酶难以消化的蛋白质水解为肽和氨基酸，进而提高动物对饲粮CP的消化率。单一蛋白酶制剂在畜禽行业内的使用较少，但单一酶的使用可以更好地对比酶的作用效果，还可探究单一酶在动物不同的生长时期的添加水平，更详细地分析不同时期的消化代谢特点。育肥猪比仔猪具有完善的消化功能，可以很好地消化营养物质^[11]，使得蛋白酶在仔猪上的使用效果优于育肥猪。

3.3 3种蛋白酶对断奶仔猪腹泻情况的影响

断奶仔猪由于应激导致消化系统紊乱，消化酶分泌的不足进一步影响断奶仔猪的消化能力，从而降低仔猪健康状况^[12]。添加酶制剂可弥补内源消化酶分泌的不足，帮助消化肠道内营养物质，减少过敏反应的发生，降低腹泻率^[13]。郭建来等^[14]在探究酸性蛋白酶对仔猪生长性能和养分表观消化率的影响时对仔猪的腹泻情况也进行了记录，酸性蛋白酶组的腹泻率较对照组降低了65.47%，减少腹泻效果明显。本试验中，试验组的腹泻率和粪便指数均低于对照组，在试验第31~45天时期试验组的腹泻率和粪便指数与对照组有最明显差异。其中，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的腹泻率分别比对照组低70.44%、76.67%和77.78%，粪便指数分别比对照组低56.00%、66.73%和75.82%；而Ⅱ组的腹泻率和粪便指数分别比Ⅰ组降低了21.05%和24.81%；Ⅲ组的腹泻率和粪便指数分别比Ⅱ组降低了4.76%和27.32%。可以看出中性蛋白酶和碱性蛋白酶的防治腹泻效果优于酸性蛋白酶，推测是由于中性蛋白酶和碱性蛋白酶在肠道中发挥的作用更明显。断奶仔猪饲粮为高蛋白质饲粮，断奶早期的仔猪消化系统和免疫系统的发育均不完善，肠道微生物区系平衡尚未建立，会对饲粮中的CP产生消化障碍，未消化的蛋白质进入肠道后段被细菌降解成胺类等有害物质，造成仔猪营养性腹泻^[15]。同时肠道对饲粮抗原产生免疫反应，引起肠道形态结构的损伤性变化，破坏仔猪肠道的免疫功能，引起肠道局部过敏反应，加剧仔猪营养性腹泻的爆发^[16]。中性蛋白酶的最适pH为6.8~7.0，更适应小肠内的pH条件^[17]。中性蛋白酶进入小肠后补充了胰蛋白酶分泌的不足，促进胰蛋白酶对肠道内蛋白质的分解，减少抗原引起的免疫应激，有效降低营养性腹泻的发生。据报道，大豆副产品中抗营养因子的残留量很高，如豆粕、膨化豆粕，而膨化大豆经高温虽然可以去除热敏性的抗营养因子，但无法去除豆粕中热稳定性的大豆抗原蛋白等抗营养因子^[18-19]，使其成为造成仔猪营养性腹泻的一大因素。有研究发现碱性蛋白酶不仅可以改善豆粕中大豆蛋白的溶解性，也能快速地将大部分大豆抗原蛋白降解为21 ku以下的肽，很好地改善了豆粕的使用安全性^[20]。亦有报道认为枯草芽孢杆菌分泌的中性蛋白酶可以降解大豆蛋白，提高CP消化率，是枯草芽孢杆菌益生作用的机理之一^[21]。碱性蛋白酶在肠道内虽不能达到最适酶活条件，但弱碱性环境处于其能发挥酶活条件内。碱性蛋白酶能更好地降解饲粮中的抗营养因子，如抗原蛋白等^[1]，大分子、难降解的蛋白质经碱性蛋白酶的降解变成小分子的肽进入组织内，减少了饲粮中抗营养因子引起的仔猪肠道免疫反应，从而达到防治营养性腹泻的效果。

3.4 3种蛋白酶对断奶仔猪血清生化指标的影响

李元凤等^[22]在研究角蛋白酶对仔猪生长性能、血清生化指标及抗氧化指标影响时发现外源添加角蛋白酶可显著降低血清中ALT的活性。ALT和AST主要存在于细胞液中，在心脏和肝脏组织中含量较高。转氨酶活性可反映肝脏结构和功能完整性^[23]，当肝脏受损时，大量的转氨酶进入血中导致血清中转氨酶含量偏高。本试验中，Ⅱ组血清AST活性显著高于对照组、Ⅰ组和Ⅲ组，与相关试验结果不一致，原因尚不清楚。本试验Ⅰ组血清UN含量显著低于对照组，血液中的尿素是通过鸟氨酸循环合成的，是蛋白质分解的最终产物，可以反映蛋白质的代谢。单胃动物血清UN含量与饲粮的氮利用率成反比，可以衡量饲粮蛋白质的生物学价值，UN含量越低表明饲粮蛋白质的利用率越高^[24]。本试验中，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组中血清TP含量较对照组分别提高了1.69%、2.78%、2.42%，但差异不显著。而TP有运输营养物质、维持渗透压，参与体液免疫的功能，TP含量升高可增强营养物质的运输，维持内环境稳态平衡。

4 结论

此试验中，在饲粮中添加酸性、中性和碱性蛋白酶提高了苏淮断奶仔猪的生长性能和营养物质表观消化率，也使得腹泻率得到降低。其中Ⅰ组的末重、ADG、ADFI、DM表观消化率、OM表观消化率和CP表观消化率较Ⅱ组和Ⅲ组都有所提高，而Ⅱ组和Ⅲ组在腹泻率和腹泻指数方面要低于Ⅰ组。可见酸性蛋白酶在提高生长性能和提高营养物质表观消化率方面效果好，中性蛋白酶和碱性蛋白酶在降低营养性腹泻方面的效果好。