2. 中国农业大学动物科技学院, 动物营养学国家重点实验室, 北京市生鲜乳质量安全工程技术研究中心, 北京 100193;
3. 内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司, 呼和浩特 011500
2. Beijing Engineering Technology Research Center of Raw Milk Quality and Safety Control, State Key Laboratory of Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China;
3. Inner Mongolia Mengniu Dairy(Group) Co., Ltd., Hohhot 011500, China
维生素D3是与机体钙磷代谢密切相关的一种维生素，它对维持机体血液钙、磷沉积及骨骼的矿化起着十分重要的作用。但维生素D3的生物活性很低，必须先转化为25羟基D3，而后在肾脏中转化为最终活性形式1, 25-二羟维生素D3[1，25-(OH)2D3]。Horst等[1]和Gast等[2]报道，在奶牛饲粮中直接添加1，25-(OH)2D3能够有效提高血浆中钙含量和小肠对钙的吸收率。由于1，25-(OH)2D3的半衰期很短，那么作为具有较长半衰期的维生素D3和1，25-(OH)2D3中间产物25羟基D3就成为研究的热点[3]。廖波等[4]研究发现，饲粮添加25羟基D3能够显著提高仔猪的抗病能力。研究表明，围产期娟姗牛产犊前口服25羟基D3与口服维生素D3相比，血清中25羟基D3含量从77.50 ng/mL显著提高到119.00 ng/mL，缓解了奶牛产后瘫痪[5]。目前，25羟基D3已经商业化生产，并在肉鸡[6]、种鸭[7]、猪和围产期奶牛等方面应用，与普通的维生素D3相比，25羟基D3在吸收运转方面有突出的优势。但25羟基D3在泌乳奶牛中的研究较少，同时在满足奶牛饲粮钙需要量和钙磷合适比例的前提下，饲粮添加25羟基D3是否可以提高原奶中钙和磷的含量，国内还少有相关的研究报道。因此，本试验通过研究饲粮中添加维生素D3和25羟基D3对奶牛产奶性能、血液指标及钙磷代谢的影响，旨在为从养殖源头上提供高钙奶源、生产钙含量较高的奶制品提供试验数据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用的维生素D3和25羟基D3均由帝斯曼(中国)有限公司提供，含量分别为50万IU/g和1.25%。
1.2 试验设计试验选用产奶量、胎次、乳成分和泌乳天数相近的健康的荷斯坦奶牛45头，泌乳天数为150~220 d，随机分为3组，每组15个重复，每个重复1头牛。基础饲粮参照NRC(2001)配制，基础饲粮组成及营养水平见表 1。对照组饲喂不添加任何类型维生素D3的基础饲粮，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组分别饲喂在基础饲粮中添加25 000 IU/(头·d)维生素D3和60 mg/(头·d)25羟基D3的试验饲粮。维生素D3的添加量参照NRC(2001)与李新[8]、高道平等[9]的研究结果，25羟基D3添加量参照帝斯曼(中国)有限公司的推荐用量。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
试验在上海振华牛场进行。奶牛饲喂全混合日粮(total mixed ration, TMR)，拴系式饲喂管理。每日分别于03:30、11:00、19:30饲喂和挤奶。试验期间奶牛自由饮水。试验期70 d，其中预试期10 d，正试期60 d。
1.4 样品采集及处理 1.4.1 饲粮和剩料正试期内每15 d采集1次投喂饲粮和剩料，用于计算干物质采食量(DMI)。采集的饲粮样品置于65 ℃烘箱烘干48 h，回潮48 h后制成风干样，粉碎后保存待测。
1.4.2 粪样和尿样试验采用全收粪尿方法[10]。在舍饲栏内最后1次采集奶样和血样后连续3 d全收粪尿，混合1 d所收集的粪样，准确称取总粪重的4%，加入1/4粪重的10%酒石酸混合均匀，制备风干粪样以备分析。用尿袋24 h全收尿，在集尿桶中预加200 mL 10%的稀硫酸，每天采集总尿量的10%，-20 ℃保存待测。
1.4.3 奶样正试期内每隔15 d记录1次产奶量。自正试期第1天起每间隔15 d采集1次奶样，按照早、中、晚4 : 3 : 3将奶样混合，共采集100 mL。其中50 mL奶样置于4 ℃冰箱冷藏，冷藏样品运送至蒙牛马鞍山事业部实验室检测常规指标；另外50 mL奶样-20 ℃保存，用于检测乳中钙、磷、镁和锌含量。
1.4.4 血样正试期自第1天起每间隔15 d采集1次血样。每组随机挑选5头牛，于晨饲前用普通真空采血管和肝素锂抗凝分别进行尾根静脉采血5 mL，分别将采集的血样置于4 000 r/min离心机，10 min后，将所得血清分装在1.5 mL离心管中-20 ℃保存待测，血浆分装在1.5 mL离心管-80 ℃保存待测。
1.5 检测指标及方法 1.5.1 饲粮、剩料和粪样的营养成分饲粮、剩料和粪样中的干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗灰分(Ash)、钙、磷含量的测定参照张丽英[11]描述的方法。
1.5.2 奶样检测奶样用于检测乳蛋白率、乳脂率、乳糖率和乳体细胞数(SCC)，采用乳成分分析仪(Foss FT120)和体细胞测定仪(Foss 5000)测定；乳中钙、镁和锌含量采用日立原子吸收分光光度计(ZA3000)测定，乳中磷含量的测定参照张丽英[11]描述的方法。
1.5.3 血液指标血清用于检测碱性磷酸酶(ALP)活性及钙、磷、镁、甲状旁腺激素(PTH)含量；血浆用于检测25羟基D3、骨吸收标志物(CTX)和骨钙素(OC)含量。血液样品均送至北京莱博泰瑞科技发展公司测定。
1.6 统计分析数据用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏多重比较法进行差异显著性检验，P＜0.05为差异显著，0.05≤P＜0.10为有显著趋势，结果以平均值±标准差表示。
2 结果 2.1 不同类型维生素D3对泌乳奶牛DMI、产奶量和乳成分的影响由表 2可知，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的乳蛋白、乳钙和乳锌含量显著高于对照组(P＜0.05)，而试验Ⅰ组和试验Ⅱ组之间显著无差异(P＞0.05)。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组SCC显著低于对照组(P＜0.05)，且试验Ⅱ组显著低于试验Ⅰ组(P＜0.05)。各组之间DMI、产奶量和其他乳成分含量无显著差异(P＞0.05)。
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表 2 不同类型维生素D3对泌乳奶牛DMI、产奶量和乳成分的影响 Table 2 Effects of different types of vitamin D3 on DMI, milk yield and milk composition of lactating dairy cows |
由表 3可知，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组血液OC含量显著高于对照组(P＜0.05)，血液CTX含量显著低于对照组(P＜0.05)，而试验Ⅰ组和试验Ⅱ组之间无显著差异(P＞0.05)。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组血液25羟基D3含量较对照组有提高的趋势(P=0.09)。各组间血液PTH、钙、磷和镁含量及ALP活性无显著差异(P＞0.05)。
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表 3 不同类型维生素D3对泌乳奶牛血液指标的影响 Table 3 Effects of different types of vitamin D3 on blood indices of lactating dairy cows |
表 4可知，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组乳钙排出量显著高于对照组(P＜0.05)，粪钙排出量显著低于对照组(P＜0.05)，而试验Ⅰ组和试验Ⅱ组之间无显著差异(P＞0.05)。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的钙、磷沉积量也显著高于对照组(P＜0.05)，且试验Ⅱ组的钙沉积量显著高于试验Ⅰ组(P＜0.05)；试验Ⅰ组和试验Ⅱ组钙、磷表观消化率显著高于对照组(P＜0.05)。
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表 4 不同类型维生素D3对泌乳奶牛钙磷代谢的影响 Table 4 Effects of different types of vitamin D3 on Ca and P metabolism of lactating dairy cows |
Martinez等[12]在不同饲粮阴阳离子差(DCAD)的饲粮中补充维生素D3和钙后发现，正和负DCAD的饲粮添加维生素D3和钙对产后奶牛的DMI和产奶量均没有显著影响。本试验的饲粮是按照NRC(2001)对钠、钾和氯的推荐值为0.19%、1.02%和0.25%进行配制的，折合算成DCAD为270 mEq/kg。本试验结果与上述试验结果一致，在正DCAD的饲粮中是否添加外源维生素D3对奶牛的DMI和产奶量并无显著影响。
本试验中，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组乳钙、乳锌和乳蛋白率均显著高于对照组，各组之间乳脂、乳糖、乳磷和乳镁的含量无显著差异。产生此结果的主要原因为乳钙、乳蛋白、乳锌的分泌是一致的。饲粮添加维生素D3可促进钙在肠黏膜细胞中形成钙结合蛋白，从而促进钙的主动吸收和提高机体中钙的沉积[2, 13]，同时提高了乳钙含量。另外，2/3的乳钙是和蛋白质相结合，且乳钙含量和乳蛋白含量呈显著正相关，相关系数为0.725[14]。Rodríguez等[15]研究报道，牛奶中乳钙含量和乳锌含量呈显著正相关。
SCC是每毫升牛奶中的体细胞数，主要包括白细胞(嗜中性白细胞、淋巴细胞)和巨噬细胞等[16]。Mathieu等[17]指出，维生素D3主要是其活性形式1，25-(OH)2D3在调节动物机体的免疫反应中起着重要作用。维生素D主要调解T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞的分化、成熟，分泌细胞因子和免疫球蛋白[18-20]。廖波等[4]报道指出，在断奶仔猪饲粮中添加25羟基D3，可以抑制炎症反应，减少白细胞数。在本试验中，2种外源维生素D3的添加都显著降低了SCC，其中饲粮添加25羟基D3效果更显著。这可能是因为维生素D3有参与机体免疫反应的功能，提高了乳腺的防御机能，降低了淋巴细胞等白细胞数，从而降低了SCC。
3.2 不同类型维生素D3对泌乳奶牛血液指标的影响血液中钙、磷和镁含量的高低均可反映出奶牛机体内相应离子代谢平衡的状态。血液中钙含量过低引起的低血钙症可导致奶牛患乳房炎和产乳热等疾病[21-22]。杨玉菊[23]研究指出，奶牛通过注射维生素D和口服维生素D胶囊，均可提高血液中钙含量，但差异不显著。本试验结果与上述结果一致，通过外源添加维生素D3和25羟基D3均可略提高血清中钙含量，但差异不显著。Goff[24]研究表明，血液中镁含量低下也是引起产乳热病的一个重要因素，且一定程度的低血镁症还可影响奶牛维持钙稳态，造成低血钙症。李大刚[25]研究发现，将阴离子盐和维生素D3添加在围产期奶牛饲粮当中后，奶牛在分娩时血液中镁含量显著上升。在本试验中，各组间血清镁含量并无显著差异，造成与他人结果不同的原因可能是试验动物的生理阶段不同。杨玉菊[23]还指出，同时使用维生素D3和高磷饲粮，血液中磷含量在试验进行到第60天时显著高于对照组。而本试验组的饲粮中的磷含量不变，仅外源添加维生素D3，所以试验组血清磷含量较对照组有提高，但未形成显著差异。以上结果说明，饲粮中添加维生素D3的可有效维持奶牛机体离子稳态。
奶牛体内钙稳态是由多种机制共同调节完成，各个机制又由各种激素和酶共同作用。血液中PTH和25羟基D3有共同调节血钙稳定的作用[26]。PTH是调节骨转换及骨骼钙磷代谢的最为重要的肽类激素之一。郑家三等[26]试验中发现，在围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃维生素D3后，血液中PTH和25羟基D3含量呈产前逐渐升高、至分娩时最高、产后逐渐降低的变化规律。Goff等[27]和Weiss等[28]的试验表明，在围产期奶牛饲粮中添加25羟基D3可以影响血液PTH含量。Mc Dermott等[29]报道，在围产期奶牛饲粮中维生素D3添加量达到250 000 IU/d时，可显著增加血液中25羟基D3的含量。Horst等[1]报道，奶牛产犊后2 d内，口服25羟基D3可以线性增加血液中25羟基D3的含量。Weiss等[28]研究表明，在围产期奶牛产犊前15 d开始饲喂维生素D3和25羟基D3，至产犊后7 d，25羟基D3组比维生素D3组中血浆中25羟基D3的含量提高3倍以上。本试验在基础饲粮上添加了不同类型的维生素D3，血液中PTH含量均略有上升，但差异不显著；血液中25羟基D3的含量均提高，但差异不显著。与其他研究者研究结论的不一致的原因主要是因为其他研究对象多为围产期奶牛，而奶牛在围产期间因大量的钙流失以导致骨钙动员和肠钙吸收，体内的钙和激素分泌处于紊乱状态，机体自身调节作用会刺激血液中大量PTH和25羟基D3生成，满足奶牛泌乳的钙需求。
血液中ALP在机体钙的消化、吸收、分泌和骨化过程中有着重要的作用[30]。CTX存在于成熟的骨胶原，当破骨细胞活性增强时骨胶原溶解释放Ⅰ型胶原蛋白，骨吸收增强时CTX含量升高。OC是骨转换标志物，是骨基质中最重要的一种特异性非胶原蛋白。血液中OC含量可反映出奶牛机体中骨钙的流转速度。李大刚[25]报道，饲粮中添加维生素D3没有对血液中ALP活性造成显著影响。赵真等[31]报道，通过对246例老年人的血液指标监测，随着血液中25羟基D3含量降低，血液中OC含量呈下降趋势，其中维生素D严重缺乏组血液中OC含量明显低于维生素D3组。本试验中，饲粮添加维生素D3和25羟基D3对血液ALP活性无显著影响，但显著提高了血液OC含量，降低了血液CTX含量，这说明说明外源维生素D3的添加有利于提高机体骨转化效率，加强骨形成和缓解骨代谢障碍。
3.3 不同类型维生素D3对泌乳奶牛钙磷代谢的影响钙和磷在骨骼生长和代谢过程中发挥中重要作用，是动物骨骼生长发育和维持骨骼健康不可缺少的重要矿物元素[32]。而维生素D3在奶牛钙磷代谢的过程中起着重要的作用，能够促进钙盐在骨中的沉积和钙化[23, 33]。研究表明，25羟基D3较维生素D3吸收更有效，生物学活性更强[34]。目前的研究表明，饲粮中直接补充25羟基D3，不仅缩短了维生素D3在机体内的代谢过程，而且避免了因肠道损伤及肝脏、肾脏功能障碍时在吸收利用方面的影响[35]。叶慧等[6]报道指出，在黄羽肉鸡饲粮中添加25羟基D3能够有效地替代维生素D3，当25羟基D3添加量达到70、90 μg/kg时可以显著提高钙的表观消化率和真消化率。由于肉鸡的快速成长，对于钙和磷在骨骼中的沉积要求较高，而关于维生素D3和25羟基D3在泌乳期奶牛的骨钙沉积的相关报道较少。本试验在奶牛基础饲粮中添加不同类型的维生素D3，试验组钙、磷表观消化率和钙、磷沉积显著高于对照组，说明维生素D3的添加可有效提高钙、磷的利用率，增加钙、磷在骨骼中的沉积，满足泌乳期间对于钙的需求。
4 结论① 饲粮中添加维生素D3和25羟基D3可显著提高乳钙、乳锌和乳蛋白的含量，显著降低SCC，对DMI和产奶量无显著影响。
② 饲粮中添加维生素D3和25羟基D3可显著提高血液OC含量，显著降低血液CTX含量；血液钙、磷和羟基D3的含量均有提高，但差异不显著。
③ 饲粮中添加维生素D3和25羟基D3可显著提高钙、磷沉积量和表观消化率，其中添加25羟基D3效果更佳。
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