, HE Mengchu, XIA Xiaodong, LI Manman, SHU Yingshuang, PENG Chenglu, FENG Shibin, WANG Xichun, LI Yu, WU Jinjie
目前，我国养殖场抗生素的使用导致细菌耐药性不断增加，造成养殖动物的抗病性降低、畜产品药物残留等问题，严重制约了养殖业的发展。因此，在畜禽生产中开发绿色安全、高效、无残留的抗生素替代品已成为研究热点和必然趋势。
微生态制剂，是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的。微生态制剂因其在动物体内无残留，并且可以改善动物健康，提高生产力和免疫力，逐步被广泛应用[1]。饲粮中添加富硒酵母可以提高育肥猪生长性能、养分表观消化率和抗氧化能力[2]。枯草芽孢杆菌能够改善动物肠道微生物的生存环境，促进营养物质的充分吸收，提高饲粮的利用率，降低成本[3]。枯草芽孢杆菌还可以提高动物机体抵抗力，为其他有益菌创造更好生长和繁殖的条件从而改善肠道菌群，通过抑制致病菌生长提高动物机体的免疫力[4]。
湖羊羔羊在断奶后，由于应激反应明显，不喜进食开食料和代乳品等，导致生长迟缓、腹泻等的发生。关于富硒酵母和枯草芽孢杆菌对湖羊羔羊的研究报道较少。因此，本试验拟以45日龄的湖羊断奶羔羊为试验动物，通过在饲粮中添加富硒酵母和枯草芽孢杆菌，探讨其对湖羊断奶羔羊生长性能、血清指标、养分表观消化率、胰腺消化酶活性和瘤胃发酵参数的影响，为微生态制剂在羊生产中的科学应用提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料和试验动物试验所用枯草芽孢杆菌制剂购自株洲智荟生物科技有限公司，有效活菌数为1×1010 CFU/g；富硒酵母购自安琪酵母有限公司，硒含量为2 000 mg/kg。试验动物为45日龄湖羊断奶羔羊。基础饲粮和试验动物皆由安徽省马鞍山市金农牧业有限公司提供。
1.2 试验设计选取21只45日龄体况良好、平均体重为(9.65±0.38) kg的湖羊断奶羔羊，随机分为3组，即对照组、富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组，每组7只。试验期28 d。参照《肉羊饲养标准》NY/T 816—2004配制饲粮，对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮的精料中分别添加100 g/t富硒酵母和100 g/t枯草芽孢杆菌制剂。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验在安徽省马鞍山市金农牧业有限公司羊场进行，在预饲时免疫注射三联四防疫苗，并注射伊维菌素溶液(0.2 mg/kg)进行驱虫处理。每7只羊为l圈饲养，保证有足够运动空间，每天定时投喂精料和粗料。每天根据前1天料盆内剩余料重新调整饲喂量，保证其自由采食和饮水，定期消毒。
1.4 样品采集与指标测定方法 1.4.1 生长性能每天准确记录每组羔羊采食量，观察羔羊生长情况，分别于试验期第1、7、14、21、28天称量每只羔羊体重，并计算精料平均日采食量、粗料平均日采食量、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.4.2 血清生化指标分别于试验期第1、14、28天08：00，对所有羔羊空腹进行颈静脉采血10 mL，静置30 min，以3 000 r/min离心，收集血清，置于-20 ℃保存待测。采用迈瑞BSL-220全自动生化分析仪进行血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)活性及总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素(UREA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量的测定。血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)的含量均采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测完成，试剂盒由南京森贝伽生物科技有限公司提供，具体步骤参照说明书。
1.4.3 养分表观消化率在试验期最后3 d，每组随机选取3只羔羊进行消化代谢试验，每组羔羊为同一料盆饲喂，根据剩料量，准确计算采食量。采用直肠取粪法收集粪样，所收集到的鲜粪准确称重，混匀，取总重量的20%作为样品，并按100 mL/kg加入10%的盐酸，置于-20 ℃保存。在65 ℃条件下烘干48 h，粉碎后置于室温下回潮24 h，装于样品袋中备用，饲粮和粪便样品中的干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量测定分别按照GB/T 6435—2006、GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 20806—2006、NY/T 1459—2007的方法进行。
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在试验期结束空腹称重后每组随机屠宰3只，按《家畜解剖及组织胚胎学》[6]方法采集胰腺，准确称量并记录重量。从头、体、尾3个部位取0.2 g左右的胰脏样本，加入1.8 mL生理盐水用高速匀浆机配成10%的组织匀浆，经2 500 r/min 4 ℃离心15 min，取上清液备用。胰腺淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均采用试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)进行测定，测定方法参照说明书进行。淀粉酶活性单位定义为：在37 ℃条件下，样品中每毫克组织蛋白质与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个活性单位(U/mg)；脂肪酶活性单位定义为:在37 ℃条件下，样品中每毫克组织蛋白质与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为1个活性单位(U/mg)；糜蛋白酶活性单位定义为:在37 ℃条件下，样品中每毫克组织蛋白质每分钟分解蛋白质生产1 μg氨基酸定义为1个活性单位(U/mg)。
1.4.5 瘤胃发酵参数在试验期结束后每组随机屠宰3只收集瘤胃液，用3层纱布过滤，1 500 r/min离心15 min，取上清液于-20 ℃保存待测。
瘤胃液氨态氮(NH3-N)的含量的测定采用改进的比色法[7]测定。瘤胃液挥发性脂肪酸(VFA)含量采用气相色谱仪-质谱仪(GCMS ISQ LT)检测[色谱柱(TG WAX，30 m×0.25 mm，0.25 μm)；自动进样器TriPlus RSH；检测器MS isq。标准品包括：乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸标准品]。
色谱条件:载气氦气(恒流模式、总流量0.8 mL/min)；进样口温度200 ℃；离子源温度200 ℃；连接线温度250 ℃；采用程序升温，初始温度120 ℃，6 min，以5 ℃/min的速率升温至150 ℃，运行2 min；进样量为1 μL; 分流比75 : 1;质谱：EI源；轰击电压：70 eV；单离子扫描模式：定量离子60、73。
1.5 数据统计与分析试验数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用LSD法进行多重比较，试验数据表示为平均值±标准差，分别以P＜0.05和P＜0.01作为差异显著和极显著的判断标准。
2 结果 2.1 富硒酵母和枯草芽孢杆菌对湖羊羔羊生长性能的影响由表 2可以看出，各组始重差异不显著(P＞0.05)。与对照组相比，富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组羔羊的末重极显著提高(P＜0.01)，平均日增重显著提高(P＜0.05)，精料和粗料平均日采食量变化均不显著(P＞0.05)，但是精料和粗料的料重比显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
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表 2 富硒酵母和枯草芽孢杆菌对羔羊生长性能的影响 Table 2 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on growth performance of lambs |
由表 3和表 4可以看出，第28天，与对照组相比，富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组的血清ALB、GLB、TP、TC、TG、UREA含量及ALT、AST、ALP、LDH活性无显著变化(P＞0.05)；富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组血清IgA、IgG、IgM、IL-6的含量显著提高(P＜0.05)，血清GSH-Px活性极显著提高(P＜0.01)；富硒酵母组血清MDA含量显著降低(P＜0.05)，血清IL-1含量显著升高(P＜0.05)，血清SOD活性极显著提高(P＜0.01)；枯草芽孢杆菌组的血清IL-2含量极显著提高(P＜0.01)，血清IFN-γ含量显著提高(P＜0.05)。
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表 3 富硒酵母和枯草芽孢杆菌对羔羊血清生化指标的影响 Table 3 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on serum biochemical indices of lambs |
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表 4 富硒酵母和枯草芽孢杆菌对羔羊血清免疫和抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on serum immunological and antioxidant indices of lambs |
由表 5可知，相比对照组，富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组的粗蛋白质、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维表观消化率显著提高(P＜0.05)，干物质的表观消化率极显著提高(P＜0.01)；枯草芽孢杆菌组的粗脂肪表观消化率显著提高(P＜0.05)。
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表 5 富硒酵母和枯草芽孢杆菌对羔羊养分表观消化率的影响 Table 5 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on nutrient apparent digestibility of lambs |
由表 6可知，与对照组相比，枯草芽孢杆菌组胰腺脂肪酶活性和富硒酵母组胰腺胰蛋白酶活性均显著提高(P＜0.05)，富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组胰腺淀粉酶活性变化不显著(P＞0.05)，但在数值上略有升高。
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表 6 富硒酵母和枯草芽孢杆菌对羔羊胰腺消化酶活性的影响 Table 6 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on digestive enzyme activities in pancreas of lambs |
由表 7可知，与对照组相比，富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组羔羊瘤胃液NH3-N、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸含量显著提高(P＜0.05)；富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组瘤胃液的异戊酸、正戊酸含量变化不显著(P＞0.05)，但在数值上略有提高。
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表 7 富硒酵母和枯草芽孢杆菌对羔羊瘤胃发酵参数的影响 Table 7 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on rumen fermentation parameters of lambs |
微生态制剂可以促进多种在肠道消化吸收中占主导地位的厌氧菌的生长繁殖，从而促进肠道对营养物质的代谢吸收，提高机体的生长性能。Shi等[8]研究发现，添加酵母硒可以显著提高太白黑羊羔羊的的生长性能。Stewart[9]研究发现在母羊饲粮中添加富硒酵母能够显著提高羔羊的平均日增重。仇武松等[10]研究结果表明，在饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以降低羔羊的料重比，从而提高生长性能。本试验研究结果与上述报道一致。然而，也有试验结果显示，微生态制剂对畜禽的生长性能没有显著影响[11]。不同的研究结果存在差异，主要是可能与微生态制剂的菌种特性、添加比例以及动物的日龄、生理状态和营养因素有关。从本试验结果来看，饲粮中添加富硒酵母和枯草芽孢杆菌能够降低料重比，显著提高羔羊的生长性能。但如何发挥其最佳使用效果，还需对微生态制剂的添加剂量和使用阶段进一步研究确定。
3.2 富硒酵母和枯草芽孢杆菌对湖羊羔羊血清指标的影响本试验对照组、富硒酵母组、枯草芽孢杆菌组之间的血清TP、ALB、GLB含量及ALT、AST活性无显著性差异，说明微生态制剂对湖羊血清中的蛋白质含量无显著影响。细胞因子是免疫系统的重要调节因子，能够影响免疫应答的类型和水平[12]。王兰惠[13]的研究发现给绵羊灌注酵母培养物能够提高血清IgA、IgG和IL-6的含量，显著提高血清IL-2、IFN-γ含量。Rajput等[14]研究发现，枯草芽孢杆菌可以提高绍兴鸭血清中IL-2的含量。Hall等[15]研究发现，在奶牛饲粮中补硒后可增加奶牛血清中的IgG含量。在本试验中富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组血清中IgA、IgG和IgM均显著高于对照组，这表明微生态制剂可以提高羔羊机体的免疫力。
血清中GSH-Px和SOD活性是反映动物机体抗氧化能力的重要指标。刘强等[16]研究发现在饲粮中添加富硒酵母能够显著提高血清GSH-Px、SOD活性，显著降低血清MDA含量。Faixová等[17]在饲粮中添加富硒酵母，显著提高了羊血清GSH-Px活性。任民等[18]研究发现，在饲粮中添加枯草芽孢杆菌能够显著提高血清GSH-Px活性，显著降低血清MDA含量。本试验中，富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组羔羊血清中的GSH-Px和SOD活性也显著提高, 血清MDA含量显著下降，这表明富硒酵母和枯草芽孢杆菌能够提高湖羊羔羊的抗氧化能力。
3.3 富硒酵母和枯草芽孢杆菌对湖羊羔羊养分表观消化率和胰腺消化酶活性的影响国内外的一些研究表明，在畜禽饲粮中合理添加富硒酵母和枯草芽孢杆菌可以显著提高营养物质的表观消化率。张丽娟等[19]研究发现，在饲粮中添加富硒酵母能够提高酸性洗涤纤维的表观消化率。Molnár等[20]研究发现，在肉鸡饲粮中添加枯草芽孢杆菌够提高饲料转化效率。Cho等[21]研究发现，在猪饲粮中添加枯草芽孢杆能够提高饲粮蛋白质消化率。微生态制剂在肠道内产生的消化酶和促生长因子等活性物质，可协同增强对养分的消化和吸收。本试验中，富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组羔羊养分表观消化率也显著提升。但是，也有微生态制剂的试验发现没有对养分消化产生影响[22]，这或许与不同的养殖管理模式有关。
淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶作为3类主要的胰消化酶，经胰液分泌与电解质一起进入近端小肠中, 在蛋白质、脂肪和碳水化合物的消化中起重要的作用[23]。刘翠玲等[24]研究发现，枯草芽孢杆菌可以显著提高鲤幼鱼胰脏蛋白酶、后肠淀粉酶的活性。李卫芬等[25]研究发现，枯草芽孢杆菌可以显著提高草鱼胰脏中脂肪酶和胰蛋白酶活性。本试验中，富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组胰蛋白酶和脂肪酶活性有显著提高，说明对湖羊羔羊消化功能有促进作用。
3.4 富硒酵母和枯草芽孢杆菌对湖羊羔羊瘤胃发酵参数的影响瘤胃液NH3-N是饲粮中多种蛋白质在瘤胃发酵的重要产物，能够为大约50%的瘤胃微生物合成菌体蛋白质提供氮源。反刍动物瘤胃液NH3-N含量正常数值范围一般维持在6.3~27.0 mg/dL[26]。周传社等[27]研究发现，在饲粮添加酵母培养物可以提高山羊瘤胃液NH3-N含量，对于调节山羊瘤胃发酵有促进作用。邓露芳[28]研究发现，在奶牛饲粮添加纳豆枯草芽孢杆菌能够提高瘤胃液NH3-N含量，这也说明枯草芽孢杆菌改善瘤胃发酵参数。反刍动物瘤胃对养分的消化吸收以及微生物动力学过程中可产生大量的挥发性脂肪酸，其主要作用为供能和维持瘤胃环境。朱翱翔等[29]研究发现，酵母硒可以提高湖羊母羊瘤胃液中乙酸和总挥发性脂肪酸含量，从而促进瘤胃发酵。研究发现，枯草芽孢杆菌可以提高奶牛瘤胃液NH3-N、总挥发性脂肪酸的含量，促进瘤胃发酵[30-31]。本试验中，富硒酵母组和枯草芽孢杆菌组羔羊瘤胃发酵参数得到改善，说明富硒酵母和枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃发酵有促进作用。
4 结论① 饲粮中添加富硒酵母和枯草芽孢杆菌能够提高断奶湖羊羔羊的平均日增重，降低料重比。
② 饲粮中添加富硒酵母和枯草芽孢杆菌能够提高断奶湖羊羔羊血清中免疫球蛋白含量和抗氧化酶活性。
③ 饲粮中添加富硒酵母和枯草芽孢杆菌能够提高断奶湖羊羔羊对养分的表观消化率、胰腺消化酶活性和瘤胃发酵参数，从而提高消化功能。
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