秸秆是我国重要的粗饲料资源，但由于其纤维木质化程度高、粗蛋白质(CP)含量低、养分消化率低、适口性较差等原因，直接饲喂效果较差。通过适当处理可提高秸秆降解率，增加其20%的能量利用率，对于缓解优质粗饲料紧缺的现状具有重要意义^[1-2]。秸秆碱化处理可使纤维内部的氢键结合减弱，酯键或醚键被破坏，纤维分子膨胀，溶解半纤维素(HCEL)和部分木质素，易于反刍动物瘤胃液的渗入及瘤胃微生物发挥作用，从而改善秸秆的适口性，提高采食量及消化率^[3]。在秸秆中添加尿素不仅可以起到碱化处理秸秆的目的，而且尿素分解释放的氨与秸秆有机物发生反应生成铵盐，还可有效提高秸秆的CP含量^[4]，但尿素碱性较弱，对纤维类物质的处理效果不及强碱类物质^[5]。碱化和氨化复合处理效果往往比单一处理效果好。碳酸氢钠作为一种常用的饲料缓冲剂，溶于水后呈弱碱性，在反刍动物饲粮中添加碳酸氢钠可提高动物采食量，改善瘤胃内环境，增强纤维素、HCEL、糖类在内的碳水化合物的降解、消化和吸收^[6]。因此，本试验研究了不同碱性物质厌氧发酵处理对鲜麦秸营养成分和超微结构的影响，利用体外产气法测定了麦秸体外降解率、产气量、瘤胃培养液pH及氨态氮、挥发性脂肪酸(VFA)产量等指标，研究了不同厌氧碱化处理鲜麦秸对崂山奶山羊体外发酵的影响，旨在筛选低质粗饲料的适宜处理方法，提高粗饲料的利用价值。

1 材料与方法 1.1 厌氧碱化麦秸的制备

试验选用刚收获籽粒的新鲜小麦秸秆，切短至3~5 cm，分别加入秸秆干物质(DM)重量的2.5%碳酸氢钠(碳酸氢钠组)、4%尿素(尿素组)、2.5%碳酸氢钠+4%尿素(复合组)，充分混合均匀后，喷雾补充水分使其含水量为30%左右，压实后密封于干净无菌的1 L塑料桶中，每个处理设3个重复，室温下(约25 ℃)贮存40 d后分别取部分秸秆于-20 ℃冷冻保存，待观察超微结构，剩余秸秆65 ℃烘干制成风干样，待测营养成分及用作体外发酵底物。试验用尿素为分析纯，含氮量≥46%，购自阳煤集团烟台巨力化肥有限公司；试验用碳酸氢钠为食用小苏打，购自青岛碱业发展有限公司，纯度≥99%。处理前鲜麦秸营养成分见表 1。

1.2 试验动物

选择体重(58.15±1.66) kg、安装永久性瘤胃瘘管的2周岁健康崂山奶山羊公羊3只，基础饲粮组成及营养水平见表 2，分别于每天06:00、11:30、18:00准时饲喂，自由采食，提供充足洁净饮水。

1.3 扫描电镜分析

选取有代表性的茎，每个组分别用刀片切割为0.3 cm×0.1 cm的横断面、外表面、内表面样本，经过一系列前处理^[8]后，用导电胶固定在铜台上，JFC-1600溅射仪喷金4次，用JSM-7500F扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)观察。

1.4 瘤胃发酵培养液的制备

瘤胃发酵培养液参考Menke等^[9]方法制备。3只试验羊于晨饲后2 h采集瘤胃液，4层纱布过滤后混合均匀，立即放入通有二氧化碳(CO₂)的保温瓶中转移到39 ℃恒温培养箱中，人工缓冲液由400 mL蒸馏水、200 mL矿物质溶液、200 mL缓冲液、0.1 mL微量元素溶液、1 mL刃天青(0.1%)、40 mL还原液(现配现用)组成，用CO₂调pH为6.8~7.0。将瘤胃液与人工缓冲液按1:2比例混合均匀，待用。

1.5 体外培养产气量和瘤胃发酵参数的测定

准确称取300 mg样品放入4.0 cm×1.5 cm的400目尼龙袋中，密封、标记后送入100 mL玻璃注射器中，在注射器中间1/3部位均匀涂抹适量医用凡士林，39 ℃预热，然后迅速向每个注射器中加入30 mL新鲜人工瘤胃培养液，记录初始刻度值，每组6个重复，同时做3个未加底物的空白对照，加液完成后立即转入39 ℃恒温培养箱中培养，并与2、4、8、12、24、36、48 h记录注射器准确产气刻度值，48 h后迅速取出注射器，冰浴，分别取出尼龙袋，用水洗涤至无异味，65 ℃烘干，用于测定干物质降解率(DMD)、中性洗涤纤维降解率(NDFD)、酸性洗涤纤维降解率(ADFD)；将培养液倒入50 mL的离心管中，测定pH，然后将培养液于3 556×g离心20 min后取上清液-20 ℃保存待测氨态氮(NH₃-N)、VFA产量。pH使用OHAUS pH计测定；NH₃-N产量采用FOSS全自动凯氏定氮仪测定；VFA产量采用Agilent 6890N气相色谱仪测定，色谱柱FFAP(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，进样口温度250 ℃，检测口温度250 ℃，柱温箱参数为程序升温60 ℃ 5 min，10 ℃/min升温至180 ℃，5 min，载气氮气(N₂)流速为1.9 mL/min，分流比2:1，进样量1 μL。

1.6 测定指标及计算方法

按GB/T 6435—2006测定水分含量后，进一步计算DM含量；CP含量按GB/T 6432—1994测定；粗灰分(Ash)含量按GB/T 6438—2007测定；中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)含量采用范氏(Van Soest)分析法^[10]，使用美国ANKOM A200i全自动纤维分析仪进行测定；HCEL含量按以下公式计算：

产气量、营养成分降解率、总挥发性脂肪酸(TVFA)产量按以下公式计算：

1.7 数据统计与分析

试验数据采用Excel 2010初步处理，使用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，Duncan氏法多重比较检验组间差异显著性，试验数据以平均值±标准误表示，以P < 0.05和P < 0.01作为差异显著和极显著标准。

2 结果与分析 2.1 不同厌氧碱化处理对麦秸营养成分含量的影响

由表 3可知，在CP含量方面，尿素组和复合组极显著高于碳酸氢钠组(P < 0.01)，分别提高了87.84%和107.80%；复合组极显著高于尿素组(P < 0.01)，提高了10.62%。在NDF含量方面，复合组极显著低于碳酸氢钠组(P < 0.01)，降低了3.02%；尿素组显著低于碳酸氢钠组(P < 0.05)，复合组与尿素组之间差异不显著(P>0.05)。在HCEL含量方面，尿素组与复合组极显著低于碳酸氢钠组(P < 0.01)，分别降低了5.50%和8.14%；复合组与尿素组之间差异不显著(P>0.05)。3个组之间ADF含量差异不显著(P>0.05)。在Ash含量方面，复合组与碳酸氢钠组极显著高于尿素组(P < 0.01)，复合组显著高于碳酸氢钠组(P < 0.05)。

2.2 不同厌氧碱化处理对麦秸超微结构的影响

图 1为不同厌氧碱化处理的麦秸在扫描电镜下的超微结构。麦秸的结构从横切面上看由表皮、基本组织和维管束3部分构成。

表皮细胞只有1层，细胞排列紧密，外侧由角质膜覆盖(图 1-4、图 1-5、图 1-6)，表皮细胞由长细胞和短细胞构成，短细胞包括细胞壁木栓化的栓质细胞和含有二氧化硅的硅质细胞，表皮上分布有由2个哑铃形保卫细胞和2个半圆形的副卫细胞构成的气孔器。麦秸茎壁内表面是幼期髓薄壁细胞解体时形成的膜质结构(图 1-7、图 1-8、图 1-9)。试验中，麦秸经不同碱化处理后表皮与内表面结构基本完整，角质膜未出现明显破损，其中，碳酸氢钠组外表面较为光滑，尿素组和复合组外表面粗糙，有起伏。

麦秸表皮细胞的内侧有4~5层厚壁细胞，为机械组织，对麦秸具有机械支持作用；靠近麦秸内表面的细胞为薄壁细胞，在小麦生长发育的后期细胞壁都有加厚，麦秸茎壁中有2轮维管束，内轮较大，在薄壁组织中(大维管束)，外轮较小，在厚壁组织中(小维管束)。麦秸经不同碱化处理后，在形态上薄壁细胞出现扭曲、变形，厚壁细胞基本会向外压扁(图 1-1、图 1-2)，在小维管束两侧较大的厚壁细胞壁常呈解体状(图 1-3)，大小维管束变化不大，不同碱化处理对麦秸横断面的侵蚀程度基本表现为碳酸氢钠组 < 尿素组 < 复合组，从处理前后薄壁细胞和厚壁细胞细胞壁厚度的变化来看，除较小的厚壁细胞其细胞壁基本没有什么变化，不同碱化处理的麦秸薄壁细胞和较大的厚壁细胞都有变薄的趋势。

2.3 不同厌氧碱化处理对麦秸营养物质体外降解率的影响

由表 4可知，在DMD方面，复合组极显著高于碳酸氢钠组(P < 0.01)，提高了20.79%；与尿素组差异不显著(P>0.05)；尿素组显著高于碳酸氢钠组(P < 0.05)，提高了10.88%。在NDFD和ADFD方面，复合组均显著高于碳酸氢钠组(P < 0.05)，与尿素组差异不显著(P>0.05)；尿素组与碳酸氢钠组之间差异不显著(P>0.05)。

2.4 不同厌氧碱化处理麦秸对体外发酵参数的影响

由表 5可知，除8 h时间点以外，各时间点体外产气量均是复合组最大，尿素组次之，碳酸氢钠组最小，3个组在2、4 h时体外产气量差异不显著(P>0.05)，6、8 h时复合组体外产气量显著或极显著高于尿素组和碳酸氢钠组(P < 0.05或P < 0.01)；48 h时复合组和尿素组的体外产气量显著高于碳酸氢钠组(P < 0.05)，复合组和尿素组之间的体外产气量差异不显著(P>0.05)。

碳酸氢钠组、尿素组和复合组之间pH差异不显著(P>0.05)。在NH₃-N产量方面，复合组显著低于碳酸氢钠组和尿素组(P < 0.05)。在VFA产量方面，复合组乙酸产量显著高于尿素组(P < 0.05)，极显著高于碳酸氢钠组(P < 0.01)，分别提高11.74%、22.68%；尿素组与碳酸氢钠组之间差异不显著(P>0.05)；复合组和尿素组丙酸产量显著高于碳酸氢钠组(P < 0.05)，复合组与尿素组之间差异不显著(P>0.05)；复合组丁酸产量极显著高于碳酸氢钠组(P < 0.01)，与尿素组差异不显著(P>0.05)。在TVFA产量方面，复合组极显著高于碳酸氢钠组(P < 0.01)，尿素组显著高于碳酸氢钠组(P < 0.05)，分别提高了26.69%、15.71%，复合组与尿素组之间差异不显著(P>0.05)。3个组之间乙酸/丙酸差异不显著(P>0.05)。

3 讨论 3.1 不同厌氧碱化处理对麦秸营养物质含量的影响

CP是评价反刍动物饲粮蛋白质营养的重要指标之一。试验中，尿素组小麦秸秆CP含量明显提高，复合组比尿素组提高了10.62%，经尿素处理之后，麦秸中木质素与纤维素、HCEL间的酯键被打断，镶嵌结构被破坏，细胞壁纤维性物质在吸附作用下与尿素等大分子有机物结合，提高了麦秸CP含量^[11]，碳酸氢钠的添加提高了pH，增强了秸秆对尿素的吸附性，提高了氮在麦秸中的保留率。闫贵龙等^[12]用2%尿素分别与2%、4%、6%、8%、10%的氢氧化钙组合处理麦秸，复合处理后的麦秸CP含量均显著或极显著高于未处理麦秸，秸秆中氮的保留率随着氢氧化钙剂量的增加而提高。NDF是秸秆细胞壁成分，经中性洗涤后，秸秆细胞的内容物(CP、可溶性糖等)溶解，细胞壁成分不受破坏而完整地存在于NDF中，NDF为纤维素、HCEL和木质素的总和。试验中，NDF、HCEL含量以复合组最低，其次为尿素组、碳酸氢钠组，原因可能是尿素添加后分解为氨溶于水后呈弱碱性，加入弱碱性的碳酸氢钠后比单独加尿素处理效果有所提高，溶解了HCEL。HCEL是一大类能够用碱液收取出来的各种聚糖物质^[13], NDF中的HCEL不稳定，溶于碱液生成了戊糖、己糖^[14]，HCEL含量的降低导致了NDF含量的降低。经酸性洗涤剂处理后，秸秆的细胞内容物和HCEL被溶解所剩部分为ADF, 其包括纤维素和木质素。试验中，3种厌氧碱化处理对ADF的含量的影响差异不显著。吕贞龙等^[15]、鲁琳等^[16]分别用尿素及尿素+氢氧化钙处理麦秸，处理后ADF含量较对照组均未见降低，此报道与本试验结果基本一致。

3.2 不同厌氧碱化处理对麦秸超微结构的影响

小麦秸秆的结构由表皮组织、维管束及基本组织构成。表皮细胞外壁不仅角质化，而且高度硅化，刘丹^[8]采用4%氢氧化钠(NaOH)、5%尿素、10%碳酸氢铵(NH₄HCO₃)处理稻草，在扫描电镜下发现3个组稻草茎表皮层的组织结构均无明显变形和脱落现象，Shen等^[17]研究认为，尿素可以溶解秸秆茎和叶片表面的少部分角质蜡硅层。本试验中，3个组的麦秸表皮与髓腔内表面均保留完整，尿素组与复合组表皮较为粗糙，原因可能是尿素溶解了麦秸角质蜡硅层和短细胞中的部分硅酸盐，并沉积于茎秆表面呈起伏状。3个组的麦秸薄壁组织扭曲和变形，厚壁细胞均有压扁、部分解体的现象。细胞壁均有变薄的趋势，分析原因可能是在碱性的条件下，HCEL与木质素之间的酯键或醚键发生断裂，使HCEL水解。室温下碱可以水解酯键(1 mol/L NaOH，25 ℃)，提高碱液浓度，升高温度(4 mol/L NaOH，170 ℃)可以水解醚键^[18]，刘培剑等^[19]研究发现，2.5%碳酸氢钠、4%尿素、2.5%碳酸氢钠+4%尿素处理麦秸10 d后，pH分别为6.74、8.47、8.66，复合组碱性最强，碳酸氢钠组碱性最弱，进一步证实了扫描电镜下观察的复合组对麦秸结构的破坏程度大于尿素组，碳酸氢钠组最差。秸秆细胞壁厚度变薄，原因还可能是碱性物质破坏了木质素与结构性多糖，以及木质素单体之间的连接，导致了细胞壁各层木质素组分不同程度的下降，细胞壁变薄^[20]。细胞壁中纤维聚合物(纤维素、HCEL、木质素、部分蛋白质)与乙酰基和酚酸化合物共同构成的三维立体结构发生破坏后，细胞的机械支持能力就会降低。值得注意的是, 秸秆中薄壁细胞较薄，原理上更易于受到碱性物质的影响，但试验中不同碱化处理后薄壁细胞仅出现扭曲和变形，而厚壁细胞出现压扁，甚至在小维管束两侧出现部分解体，原因可能是麦秸呈中空的圆柱状，喷洒的碱液从表皮侵蚀秸秆，碱液通过高度角质化、硅质化的表皮，溶解了部分硅盐，进入秸秆内部后作用于外侧的厚壁细胞与维管束，维管束较难被降解，厚壁细胞的次生壁高度木质化，碱液可断裂HCEL与木质素的连接，降低木质素，从而使厚壁细胞壁解体，碱液通过紧密排列的厚壁细胞后，含量变少，浓度降低，当碱液进一步作用于内侧的薄壁细胞时，仅能使其变形，而非完全解体。

3.3 不同厌氧碱化处理对麦秸体外降解率的影响

粗饲料DMD可反映其在动物体内消化的难易程度，是影响干物质采食量的重要因素^[21]。NDFD和ADFD可较准确的反映饲料中纤维的可利用程度，是评价反刍动物粗饲料营养价值的重要指标。研究表明，粗饲料体外DMD与NDF含量呈极显著的负相关，与CP含量呈显著正相关^[22]，饲料体外NDFD与NDF含量呈显著负相关^[23]。麦秸纤维类物质含量较高, 碱化和氨化复合处理不仅可以破坏木质素与HCEL之间的酯键，降低HCEL和NDF含量，还可以显著提高CP含量。反刍动物可利用瘤胃液中的细菌、真菌及原虫等分泌的纤维素酶来分解利用饲料中的纤维类物质^[24]。秸秆经尿素处理后纤维结构蓬松、空隙增多，吸附酶的表面积增大，有助于纤维素酶的酶解^[25]。贺永惠^[26]采用4%尿素+4%氢氧化钙复合处理玉米秸可显著提高秸秆降解率，体内瘤胃尼龙袋48 h的DMD、NDFD及ADFD分别比未处理秸秆提高了45.54%、50.56%、36.81%。王佳堃等^[27]研究还发现，化学处理秸秆的总硅含量随着碱化或氨化剂量的增加呈极显著线性下降，总硅与稻草DMD间存在极显著负相关(r=-0.560)。孙国强等^[28]研究了尿素和氢氧化钙添加比例均为2%、3%、4%的不同处理组合对麦秸干物质及纤维瘤胃降解率的影响，随着尿素、氢氧化钙添加比例的增加，麦秸72 h的DMD、NDFD及ADFD基本呈现上升的趋势，当4%尿素+2%氢氧化钙的最优组合时麦秸DMD、NDFD及ADFD分别比未处理秸秆提高了90.98%、92.06%、139.38%。本试验中，NDF含量为复合组<尿素组<碳酸氢钠组，CP含量为复合组>尿素组>碳酸氢钠组，麦秸营养物质降解率表现为：复合组>尿素组>碳酸氢钠组，复合组48 h的DMD、NDFD及ADFD比碳酸氢钠组分别提高了20.79%、21.45%及15.47%，比尿素组分别提高了8.94%、5.93%及5.21%。尿素和碳酸氢钠复合处理鲜麦秸效果优于单独处理，较大程度上提高了秸秆的营养价值，此结果与徐清华等^[29]的报道基本一致。

3.4 不同厌氧碱化处理对麦秸瘤胃体外发酵产气量及发酵参数的影响

体外瘤胃发酵试验中产气量、VFA、pH及NH₃-N含量是反映饲粮体外发酵效果的重要指标。产气量主要是饲粮在瘤胃微生物的作用下产生的甲烷和二氧化碳，产气量可反映饲粮能量水平，研究证明体外产气量与营养物质的消化率呈正相关^[30-31]。VFA是反刍动物能量利用的主要形式，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，这3种酸约占瘤胃发酵挥发性脂肪酸总产量的95%。VFA与反刍动物的能量代谢有直接关系，TVFA气量的提高表明底物消化率的上升。pH受到VFA及一些代谢产物影响，瘤胃pH可反映瘤胃中饲粮的发酵程度，主要受饲粮品质、唾液分泌、瘤胃渗透压、瘤胃内VFA的气量等因素的影响^[32]。NH₃-N是由瘤胃氮代谢中外源蛋白质和内源含氮物质降解产生的氨基酸在适宜的pH条件下脱氨基产生的，是瘤胃微生物合成微生物蛋白质的重要原料，瘤胃NH₃-N含量受饲粮中蛋白质等含氮养分在瘤胃中的降解速度和微生物对NH₃-N摄取与利用速度的影响，所以NH₃-N含量可反映饲粮中蛋白质降解与合成的平衡关系。试验中，复合组与尿素组48 h体外产气量高于碳酸氢钠组，复合组体外产气量高于尿素组，乙酸、丙酸、丁酸及TVFA气量也表现为复合组高于尿素组，碳酸氢钠组最低，进一步验证了复合组秸秆营养物质的降解率高于尿素组和碳酸氢钠组，分析原因可能与复合组NDF含量的降低有关。饲粮在体外发酵的总产气量及甲烷(CH₄)、CO₂、VFA产量与NDF含量呈显著的负相关，与非结构性碳水化合物含量呈显著正相关，秸秆经碱化氨化复合处理后，NDF含量下降，细胞壁结构疏松，增加了碳源，有利于微生物的发酵，尿素为其提供氮源，使微生物(主要是细菌及原虫)数量增加、活性提高，促进了秸秆DM及纤维的降解，碳水化合物降解为VFA，产生CH₄、CO₂，增加了体外产气量。赵广永等^[33]采用不同水平(0、2%、4%、6%、8%)尿素处理稻草进行体外瘤胃发酵试验，随着尿素水平的增加，碱性逐渐增强，秸秆NDF含量降低，体外产气量及TVFA、乙酸产量显著提高，此研究与本试验结果基本一致。试验中，经尿素和碳酸氢钠复合处理后，小麦秸秆体外发酵液中NH₃-N产量并未提高，而是显著降低，原因可能是麦秸纤维性物质消化率的提高增加了碳源的供给，使菌体蛋白质合成量的增加，促进生成了蛋白质。霍文婕等^[34]研究过氧化氢与尿素复合处理小麦秸秆时也有类似发现。乙酸/丙酸是衡量微生物发酵模式的参数，3个组乙酸/丙酸差异不显著，说明3种处理的秸秆没有改变瘤胃发酵模式，均以乙酸发酵为主；另外，试验中pH维持在6.85~6.87，3个组pH差异不显著，纤维素酶均在适宜的pH范围(6.5~7.0)内^[35]，此结果与历磊^[36]研究的用不同添加量碳酸氢钙-尿素复合处理的花生藤经体外模拟瘤胃发酵72 h后pH均差异不显著的报道基本一致。

4 结论

① 复合组麦秸CP含量比碳酸氢钠组和尿素组分别提高了107.80%和10.62%，NDF、HCEL含量分别降低3.02%和1.58%、8.14%和2.80%。

② 不同厌氧碱化处理对麦秸超微结构的破坏程度表现为复合组>尿素组>碳酸氢钠组，碱液对麦秸组织的侵蚀力度表现为厚壁细胞>薄壁细胞>维管束。

③ 复合组麦秸48 h的DMD、NDFD及ADFD比碳酸氢钠组分别提高了20.79%、21.45%及15.47%，比尿素组分别提高了8.94%、5.93%及5.21%，复合组体外产气量、VFA产量显著提高，NH₃-N产量明显降低，不同厌氧碱化处理的麦秸未改变瘤胃发酵的pH和发酵模式。