饲粮纤维的测定和研究已有100多年的历史,但有关定义并不统一,Hipsley[1]首次提出“饲粮纤维”的概念,把饲粮纤维作为植物细胞壁中不可消化组分的代用词,最初是指纤维素、半纤维素和木质素等。兔对纤维素的利用情况一直是值得关注和研究的课题。家畜进行养分消化吸收的主要场所是肠道,动物生长的快慢及健康与胃肠道发育的好坏有关。兔对饲草、饲料中纤维性物质的消化利用能力一般在17%~25%,明显低于牛、羊和马等草食动物,但饲粮纤维对兔的生长和健康起着非常重要的作用[2]。由于兔是单胃草食动物,具有发达的盲肠,能够利用盲肠内大量的微生物,将难消化的纤维发酵分解为能被机体吸收的低分子质量有机酸等营养物质。Stephen等[3]研究表明可溶性纤维和不溶性纤维对肠道的作用在于它们在消化道内被消化的程度。有研究者通过体外发酵模型预测体内可溶性纤维发酵的速率,证明了可溶性纤维可以增加发酵速率、产气量及挥发性脂肪酸(VFA)的产生,降低消化道pH[4]。不溶性纤维可以增加食糜的质量,进而机械性刺激肠黏膜进行分泌和肠蠕动[5]。Ley等[6]报道纤维能通过影响肠道菌群进而影响能量平衡,产生瘦及肥胖2种表现型的大鼠。
因此,探讨饲粮纤维对肉兔盲肠内容物发酵及菌群情况,对合理利用粗饲料资源、确定适合的饲粮纤维等具有重要实际意义。但是前人对兔饲粮纤维这方面研究的报道不多。本试验旨在研究苜蓿干草、甜菜渣、大麦糠和燕麦草4种纤维源对福建黄兔盲肠内环境的影响,为肉兔饲粮中添加适当的饲粮纤维以提高生产效率提供相关理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计及饲粮选取200只体重相近、健康的(35±2)日龄断奶福建黄兔(由福建春龙农牧科技有限公司提供),采用单因子完全随机区组试验设计,随机分为4组,分别饲喂以苜蓿干草、甜菜渣、燕麦草、大麦糠为粗饲料原料,以25%的添加比例配制成的4种等能等粗蛋白质的配合饲粮,即高可溶性纤维(HSDF)饲粮(包括2种纤维源,分别为苜蓿干草和甜菜渣)、高不溶性纤维(HIDF)饲粮(纤维源为大麦糠)和对照(CK)饲粮(纤维源为燕麦草),每组5个重复,每个重复10只。饲粮组成及营养水平见表 1,用制粒机将配合饲粮制成颗粒料。预试期为7 d,预试期内进行分组、驱虫和免疫注射,正试期53 d。
试验兔饲养在同一兔舍,重叠式4层笼养,单笼饲养,各组试验兔均处于相同的管理和卫生条件。试验前对饲养栋舍进行完全的清扫,兔笼火焰消毒,地面百毒杀清洁消毒。每天饲喂2次,自由采食、饮水。试验过程注意定期视察试验兔的健康状况,详细地做好记录。
1.3 测定指标及方法 1.3.1 盲肠发酵参数的测定pH的测定:用PHB-4便携式pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)测定盲肠前、中、后3个不同位置的内容物pH,取平均值。
氨态氮(NH3-N)含量的测定:根据苯酚次氯酸钠比色法[7]测定。
挥发性脂肪酸(VFA)含量的测定[8]:样品预处理后用Agilent-6890N型气相色谱仪进行测定。相关参数:进样口温度220 ℃,进样量为1 μL,载气是氮气,分流比40 : 1。
1.3.2 盲肠微生物菌群数量的测定刮取靠近盲肠肠壁的内容物至已高压灭菌的10 mL离心管中,漩涡振荡器混匀,每个样品称取200 mg移到2 mL离心管中,并将管子置于冰上,试验按照天根粪便基因组总DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书操作。提取的肠道中残留物总DNA用洗脱TB洗脱到1.5 mL离心管中,置-20 ℃冷冻储存。
根据大肠杆菌、乳酸杆菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌16S rDNA基因序列设计特异性PCR引物,引物序列见表 2。反应体系20 μL,其中上、下游引物各2 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 7.5 μL,10×Buffer 2 μL,dNTP 4 μL,Easytaq 0.5 μL。凝胶电泳检测所合成引物的特异性。PCR扩增步骤如下:94 ℃预变性5 min,94 ℃ 30 s,55~62 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,循环35次,72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析,凝胶成像系统观察片段大小和浓度。
将经电泳检测后符合试验要求的PCR扩增产物进行切胶纯化回收。将纯化后的目标PCR产物与载体连接,转化至感受态细胞,取150 μL菌液均匀的涂布在含有β-半乳糖苷酶(X-gal)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(AmP)的LB琼脂平板培养基上,37 ℃恒温培养箱中过夜,观察蓝斑和白斑菌落。在培养基中随机选择10个白斑菌落,接种在1 mL的LB液体培养基中,37 ℃恒温培养箱中过夜。培养后的菌液进行阳性克隆检测。用质粒提取试剂盒将确定的阳性克隆菌进行质粒提取并测序(由英潍基测序公司测序)。于GenBank上用BLAST进行序列的同源性分析,选择相似性大于99%的阳性克隆,将其质粒浓度换算成拷贝数,进而制作标准曲线用以精确定量。
1.4 数据统计方法试验数据经Excel 2010初步整理后,应用软件SPSS 16.0进行单因素方差分析,差异显著后进行LSD多重比较,结果用平均值±标准差(mean±SD)表示。P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。
2 结果与分析 2.1 不同来源饲粮纤维对福建黄兔盲肠发酵参数的影响由表 3可以看出,HSDF组pH极显著低于对照组和HIDF组(P<0.01),且甜菜渣组pH显著低于苜蓿干草组(P<0.05);HIDF组pH最高,但与对照组差异不显著(P<0.05)。HIDF组NH3-N含量最高,与对照组和HSDF组差异极显著(P<0.01);HSDF组NH3-N含量显著低于对照组(P<0.05)。HSDF组TVFA含量极显著高于对照组和HIDF组(P<0.01),其中甜菜渣组TVFA含量与苜蓿干草组差异极显著(P<0.01);HIDF组TVFA含量极显著低于对照组(P<0.01)。HSDF组的乙酸、丙酸、丁酸含量均极显著高于对照组和HIDF组(P<0.01);在HSDF组中苜蓿干草组的丙酸、丁酸含量极显著高于甜菜渣组(P<0.01),乙酸的含量极显著低于甜菜渣组(P<0.01);HIDF组的乙酸、丙酸含量低于对照组,且差异极显著(P<0.01),丁酸含量极显著高于对照组(P<0.01);HSDF组和对照组的异丁酸含量无显著性差异(P>0.05),但均极显著高于HIDF组(P<0.01);对照组的异戊酸含量最低,且与HSDF组和HIDF组均有显著性差异(P<0.05),HIDF组的异丁酸含量高于HSDF组,且与苜蓿干草组有显著性差异(P<0.05);苜蓿干草组戊酸含量最高,且与其他各组均有极显著的差异(P<0.01),甜菜渣组的戊酸含量最低,但与HIDF组和对照组无显著性差异(P>0.05),HIDF组和对照组的戊酸含量无显著性差异(P>0.05)。
从表 4可得,HSDF组的大肠杆菌数量极显著高于对照组和HIDF组(P<0.01),其中,甜菜渣组的大肠杆菌数量极显著高于苜蓿干草组(P<0.01);HIDF组的大肠杆菌数量高于对照组,但无显著性差异(P>0.05)。HSDF组的乳酸杆菌数量极显著高于对照组和HIDF组(P<0.01),其中苜蓿干草组的乳酸杆菌数量极显著高于甜菜渣组(P<0.01);HIDF组的乳酸杆菌数量高于对照组,但无显著性差异(P>0.05)。在对纤维素分解菌数量的定量测定中,HIDF组和对照组的黄色瘤胃球菌数量极显著高于HSDF组(P<0.01);对照组的黄色瘤胃球菌数量低于HIDF组,但无显著性差异(P>0.05)。HIDF组的白色瘤胃球菌数量最高,显著高于对照组(P < 0.05)且与HSDF组有极显著差异(P<0.01);HSDF组的白色瘤胃球菌数量极显著低于对照组(P<0.01),苜蓿干草组的白色瘤胃球菌数量极显著高于甜菜渣组(P<0.01)。
兔盲肠的消化代谢与反刍动物瘤胃相似。反映盲肠内发酵活力的指标主要有pH、NH3-N和VFA含量等。这几个指标相互关联,VFA含量提高,pH自然下降,NH3-N含量降低,说明瘤胃微生物利用NH3-N合成的微生物蛋白质(MCP)能力提高。同时,由于NH3-N呈碱性,其含量的降低,结果也使pH下降。盲肠内微生物的生长繁殖需要合适的酸度环境,而这种酸度环境由食糜在盲肠内发酵而积聚的游离氨基酸、VFA和不挥发性脂肪酸等酸性物质来维持。Champe等[9]研究发现, 当以苜蓿草粉为饲粮纤维的主要来源时, 饲粮纤维含量的变化不影响盲肠pH。但Gidenne[10]报道表明, 纤维的类型和水平显著影响盲肠pH。Trocino等[11]报道,家兔饲粮可溶性纤维的增加会降低盲肠的pH,但增加TVFA的含量。这与本试验研究结果一致,本研究发现,HSDF组pH极显著低于HIDF组和对照组,TVFA含量极显著高于HIDF组和对照组。
NH3-N是饲料蛋白质和内源尿素的分解产物,同时也是盲肠微生物产生MCP的氮来源,使盲肠细菌得以生长繁衍,并通过软粪被家兔利用[11]。本试验中,HSDF组的NH3-N含量极显著低于HIDF组及对照组。
VFA是盲肠发酵的重要产物,盲肠中的VFA是肉兔供能的一个重要的途径,正常情况下,盲肠中VFA的含量平均为57.2 mmol/L, 范围为31.8~88.5 mmol/L。晁洪雨等[12]报道,家兔发酵产生的VFA在家兔后肠中迅速吸收,提供能量,丁酸是后肠的直接能量来源,而乙酸在肝脏代谢中生成脂肪和胆固醇,纤维的来源会影响VFA的含量,不易消化的高木质化纤维会使得VFA的含量降低。增加饲粮可溶性纤维能够提高育肥兔盲肠发酵,但可溶性纤维的增加又常以非可溶性纤维和淀粉减少为代价。可溶性纤维对盲肠VFA含量的影响现在还没有形成统一认识。本试验中,HSDF组TVFA含量极显著高于HIDF组及对照组。Gidenne等[13]的试验表明,盲肠内VFA含量随饲粮纤维水平的增加而提高,但差异不显著;其中乙酸比例显著提高,丁酸比例显著降低。这与本试验结果不同,其原因可能是由于纤维来源不同影响了VFA含量。
3.2 不同来源饲粮纤维对福建黄兔盲肠菌群数量的影响健康断奶肉兔盲肠区内厌氧菌群以拟杆菌、双歧杆菌、消化球菌、乳酸杆菌为主,大肠杆菌等需氧菌数量极少。优势菌群可以合成纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等,参与家兔体内物质代谢和生理生化活动。同时利用空间位阻和代谢产物的挥发酸等迅速杀死不耐酸的大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌群,形成生物和化学屏障,维持家兔的菌群平衡[14]。在正常状况下,有益菌占绝对优势,细菌间形成一种相当稳定的复杂生态系统。因此盲肠细菌的种类、数量及其平衡性是肉兔消化机能健康与否的重要标志,也是消化道结构和机能正常与否的重要体现。Awati等[15]研究表明,饲粮种类不同,兔肠道微生物区系组成不同,其中饲粮纤维起着重要的作用。冯平[16]研究不同纤维类型对猪后肠微生物变化的影响,其中大豆皮和玉米皮能够最为显著地影响猪后肠微生物结构。谷子林等[8]研究发现,饲粮纤维水平显著影响盲肠菌群,其中低纤维水平饲粮使有益菌比例降低。Varel等[17]研究发现,高纤维水平饲粮能够使小猪粪样中纤维分解菌的数量显著增多。Matsui等[18]认为,含有拟杆菌门丰富的盲肠,其发酵作用更强。本试验发现,HSDF组乳酸杆菌数量极显著高于对照组,但黄色瘤胃球菌与白色瘤胃球菌数量极显著降低,其中HIDF组最高,极显著提高了黄白色瘤胃球菌数量。出现这个结果可能是因为可溶性纤维比高不溶性纤维或一般不溶性纤维更有利于促进兔的生长,为兔生产提供能量和MCP,但是可溶性纤维水平过高有导致盲肠菌群失调的可能。
4 结论在本试验条件下,HSDF(苜蓿干草、甜菜渣)对福建黄兔盲肠发酵及菌群有较好的效果。
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