在奶牛养殖业中，如何提高奶牛的生产性能一直是养殖者追求的目标。但是，养殖过程中，由于蛋白质利用率过低，造成了蛋白质的浪费，使奶牛粪尿中大量未利用的氮素直接排放到外界环境中，加剧了对环境的污染。因此，采用营养调控技术，提高饲粮中蛋白质的利用率和奶牛的生产性能，降低氮的排泄量，对减少奶牛生产中的环境污染具有重要的意义。牛至油(oregano oil，Oo)是一种绿色的新型饲料添加剂，具有抗菌、抑菌和杀菌的作用，能够改善消化道菌群结构，同时Oo具有零停药期、不产生耐药性和无配伍禁忌等特点，其应用于动物生产中，对提高动物的生产性能和免疫性能具有积极的意义^[1-2]。Temizkan等^[3]研究发现，Oo通过调节消化道菌群平衡，提高消化酶的活性，增强动物的消化吸收能力，提高饲粮中养分的利用率。限制性氨基酸及饲粮氨基酸组成模式是决定动物体内含氮物质利用效率的重要因素^[4]。赖氨酸作为反刍动物的第一或第二限制性氨基酸，研究表明，将过瘤胃赖氨酸(rumen-protected lysine，RPLys)添加到奶牛的饲粮中，可以增加小肠内氨基酸的含量，提高饲粮蛋白质的利用率，并对奶牛的生产性能具有积极的作用^[5]。Wang等^[6]研究饲粮中添加赖氨酸对奶牛生产性能和氮排泄的影响时指出，赖氨酸可以提高奶牛的产奶量和蛋白质的利用率，有效的降低氮排泄量。本课题组前期试验分别研究了Oo对奶牛产奶性能和氮排泄的影响^[7]、RPLys对奶牛产奶性能和氮排泄的影响，并确定了Oo和RPLys的最适添加水平分别为13和30 g/(d·头)。目前，将植物精油与过瘤胃氨基酸组合添加到奶牛的饲粮，研究其对奶牛生产性能影响的报道极为少见，张成喜等^[8]将过瘤胃蛋氨酸和肉桂醛组合添加到奶牛的饲粮，发现对提高奶牛的产奶量和降低氮排泄具有良好的效果。同时，有关Oo和RPLys对奶牛影响的研究主要集中于产奶性能方面，鲜有对氮排泄影响的研究报道，更未发现饲粮中联合添加Oo和RPLys对奶牛产奶性能及氮排泄影响的相关报道。本试验在前期试验的基础上，将Oo和RPLys分别设置3个添加水平，总计9个不同的添加组合，探讨不同添加水平组合的Oo和RPLys对奶牛产奶性能和氮排泄的影响，在寻找最适组合的同时，也为Oo和RPLys联合添加应用于奶牛的实际生产提供理论支持。

1 材料与方法 1.1 试验设计

本试验选取烟台荷牧园牧业有限责任公司年龄[(4±1)岁]、体重[(675±20) kg]、胎次(2~3胎)、产奶量[(25.30±0.25) kg]、乳成分及泌乳期[(105±15) d]相近, 体况良好的荷斯坦奶牛40头，随机分为10组，每组4头。对照组(C组)饲喂基础饲粮，各试验组添加不同水平组合的Oo和RPLys。其中，Oo设3个添加水平，分别为11.5、13.0、14.5 g/(d·头)；RPLys设3个添加水平，分别为27.5、30.0、32.5 g/(d·头)，共组成9个组合，其设计方案见表 1。每头奶牛每天从饲粮中预留出0.5 kg麸皮，将Oo和RPLys与预留的0.5 kg麸皮混合均匀后均分为2份，每日2次随全混合日粮(TMR)饲喂。试验所用的Oo和RPLys(过瘤胃率为70%)均由青岛润博特生物科技有限公司提供，其中Oo为白色粉末状物质，Oo含量≥10%，水分含量≤12%；RPLys为白色颗粒状物质，原料组成为L-赖氨酸盐酸盐、棕榈油、二氧化硅，其中赖氨酸含量≥50%，水分含量≤12%。

1.2 饲养管理

试验牛采用分栏饲喂，整个试验期共75 d，其中预试期15 d，正试期60 d。试验牛每日使用荷兰进口SAC全自动挤奶器挤奶3次(04:00、12:00、18:00)，每日饲喂TMR 2次(04:30、18:30)，确保奶牛每日有20 h以上时间能够接触到TMR。试验奶牛采食后，在运动场自由运动和饮水，按常规对试验牛进行驱虫、光照及管理。参考NRC标准配制基础饲粮，基础饲粮为TMR形式，其组成及营养水平见表 2。

1.3 样品的采集与处理 1.3.1 TMR样

分别在预试期第1~3天以及正试期第28~30天和第58~60天时采用四分法收集TMR样，将收集的TMR样置于65 ℃恒温干燥箱中烘干，制成风干样，粉碎混匀后备用。

1.3.2 尿样

分别在预试期第1~3天以及正试期第28~30天和第58~60天时收集每头试验牛尿样，参照朱雯^[10]的点收尿法，采取人工接尿结合膀胱取尿的方法，每天收集2次，每隔12 h收集1次，连续收集3 d，每天在前1天的基础上延后4 h收集。向每次收集的尿样中加入10%的硫酸，调整pH(使pH < 3)后，于-20 ℃冰柜中冷冻保存。

1.3.3 粪样

分别在预试期第1~3天以及正试期第28~30天和第58~60天时收集全部试验牛的粪样，每次连续3 d进行24 h全收粪。每次收集粪样前，将试验牛的牛床冲洗干净，及时将试验牛粪便收集入桶，将每天收集的粪样混合均匀并称重，采用四分法收集当天粪便，按每100 g粪样加入25 mL硫酸(10%)的方式进行固氮处理，放到-20 ℃冰柜中进行冷冻保存。每阶段采样结束后，将3 d所收集的粪样按样重比例混匀，置于恒温干燥箱中65 ℃烘至恒重，制成风干样进行保存。

1.3.4 乳样

分别在预试期第1天和正试期每隔15 d，按照早、中、晚4:3:3的比例收集乳样50 mL于取样瓶中，加入30 mg重铬酸钾防腐剂，混匀后将其放至4 ℃冰柜中冷藏保存，用于乳成分各项指标的测定。

1.4 指标测定与方法 1.4.1 采食量

试验牛分栏饲喂，单独记录每头试验牛的采食量。预试期内，每隔2 d记录1次投料量，每次饲喂前收集剩余饲粮并称重，依据投料量和剩料量计算出每头牛的采食量。采用相同的方法，正试期内每隔10 d记录并计算1次采食量，总共记录6次，每次连续记录3 d，根据3 d的采食量记录计算出该阶段的平均采食量。每次根据上一阶段测定的平均采食量调整下一阶段TMR饲喂量。

1.4.2 TMR样和粪样主要养分含量

采用GB/T 6435—2006^[11]中方法测定水分含量，计算干物质(DM)含量；粗蛋白质(CP)含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994^[12])进行测定；采用GB/T 20806—2006^[13]中方法测定中性洗涤纤维(NDF)含量；采用NY/T 1459—2007^[14]中方法测定酸性洗涤纤维(ADF)含量；采用高锰酸钾法(GB/T 6436—2002^[15])测定钙(Ca)含量；采用分光光度法(GB/T 6437—2002^[16])测定磷(P)含量。

1.4.3 产奶量及乳成分含量

采用荷兰进口SAC全自动挤奶器挤奶，挤奶时自动显示奶量。在预试期和正试期期间，每隔5 d记录1次试验牛产奶量，每次连续记录3 d，取3 d产奶量的平均值。

采用山东省农业科学院奶牛研究中心生产性能测定实验室的乳成分和体细胞自动分析仪(丹麦Foss公司生产，型号Combi Foss FT+)测定乳样中的乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、非脂固形物含量和乳体细胞数。

1.4.4 氮代谢指标

利用福斯Kjeltec^TM 8200凯氏定氮仪(丹麦Foss公司生产)测定尿氮含量，利用苦味酸比色法测定尿肌酐含量^[17]，以上测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。参考Valadares等^[17]的试验方法，通过尿肌酐(每天每头牛1 kg体重大约排出29 mg尿肌酐)标记来测定试验牛的排尿量。测定粪样中CP含量的方法与TMR相同。测定尿氮、尿肌酐含量时，使用仪器为UV-1800 PC型紫外可见分光光度计(购自上海美谱达仪器有限公司)。

氮代谢指标计算公式如下：

1.5 数据处理与分析

使用Excel 2010软件对试验数据进行初步处理，使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法多重比较检验组间差异显著性，以P < 0.05和P < 0.01分别表示差异显著和差异极显著，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析 2.1 不同添加水平Oo和RPLys组合对奶牛主要养分采食量的影响

由表 3可知，各试验组的干物质采食量(DMI)与C组相比无显著差异(P>0.05)。同时不同添加水平Oo和RPLys组合对奶牛的主要养分采食量的影响均不显著(P>0.05)。

2.2 不同添加水平Oo和RPLys组合对奶牛产奶量的影响

由表 4可知，正试期内，LL、LM、LH、ML、MM、MH、HL、HM、HH组产奶量分别比C组提高了6.03%(P < 0.01)、11.42%(P < 0.01)、9.82%(P < 0.01)、12.22%(P < 0.01)、16.05%(P < 0.01)、12.30%(P < 0.01)、9.38%(P < 0.01)、12.53%(P < 0.01)、10.66%(P < 0.01)，以MM组产奶量的提高效果最佳。

2.3 不同添加水平Oo和RPLys组合对奶牛乳成分的影响

由表 5可知，在乳脂率方面，以MM组效果最佳，极显著高于C、LL、LM、LH、HL和HH组(P < 0.01)，显著高于HM组(P < 0.05)，与ML和MH组无显著差异(P>0.05)；在乳蛋白率方面，以MM组效果最佳，极显著高于C和LL组(P < 0.01)，显著高于ML和HL组(P < 0.05)，与LM、LH、MH、HM和HH组无显著差异(P>0.05)；在奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后，各试验组的非脂固形物含量不同程度地高于C组，其中MM组的非脂固形物含量极显著高于C组(P < 0.01)；在奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后，各试验组的乳体细胞数均较C组极显著降低(P < 0.01)，以MM组降低效果最佳；在奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后，各试验组的乳糖率与C组相比差异不显著(P>0.05)。

2.4 不同添加水平Oo和RPLys组合对奶牛氮表观消化率和氮排泄的影响

由表 6可知，在奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后，各试验组的食入氮与C组相比差异不显著(P>0.05)，各试验组的粪氮和尿氮均极显著低于C组(P < 0.01)，LL、LM、LH、ML、MM、MH、HL、HM和HH组的总氮排泄量与C组相比分别降低了6.63%(P < 0.01)、9.29%(P < 0.01)、7.73%(P < 0.01)、11.81%(P < 0.01)、18.21%(P < 0.01)、15.06%(P < 0.01)、10.83%(P < 0.01)、11.27%(P < 0.01)和6.95%(P < 0.01)，以MM组最低。在奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后，各试验组的乳氮、氮沉积和氮表观消化率均极显著高于C组(P < 0.01)。

3 讨论 3.1 不同添加水平Oo和RPLys组合对奶牛主要养分采食量的影响

DMI作为奶牛场的第一限制性营养因素，直接影响着奶牛的生产性能和健康状况，合理提高奶牛DMI，可使奶牛能够长期稳定的保持较高的生产性能^[18]。本试验中，添加适中水平Oo的试验组DMI相对较高，因此，添加适中水平的Oo有提高奶牛DMI的趋势，而添加RPLys对DMI的影响较小。周晓荣等^[19]在研究Oo对生长猪生产性能和主要养分表观消化率的影响时指出，添加Oo对生长猪的采食量有提高的趋势，但差异不显著，对CP、Ca、P等主要养分的表观消化率无显著影响。本试验中，在奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后，奶牛的DMI得到提高，可能是源于Oo的抑菌抗菌作用改善了奶牛消化道菌群结构，提高了消化酶的活性^[20-21]；另外，Oo特殊的芳香气味可以刺激奶牛的食欲^[22]，起到增加采食量和促进消化的作用。

3.2 不同添加水平Oo和RPLys组合对奶牛产奶量的影响

产奶量是奶牛生产过程中最直观，也是最重要的生产性能指标，直接关系到奶牛养殖的经济效益。本试验中，在奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后，奶牛的产奶量得到了极显著提高，其中以MM组效果最好。姚喜喜等^[23]研究在TMR中添加Oo对奶牛产奶性能的影响时发现，Oo能够提高奶牛的产奶量。晓霖^[24]研究发现，在奶牛TMR中加入牛至草可以提高饲料转化率和奶牛的产奶量。Oo又名香芹酚，可以有效减少沼气产生量，沼气越少意味着奶牛有更多的能量用于产奶^[25]，从而提高奶牛的产奶量。红敏等^[26]研究发现，在奶牛的饲粮中添加包被赖氨酸对奶牛产奶量的提高具有积极作用。Giallongo等^[27]在研究RPLys对奶牛生产性能的影响时指出，RPLys有助于提高奶牛的产奶量。将RPLys添加到奶牛的饲粮中满足了泌乳奶牛对限制性氨基酸的需要，增加了小肠可利用氨基酸的数量，提高了奶牛的产奶量。Oo通过激活肠道消化酶的活性，加强了奶牛对养分的消化吸收，间接提高了产奶量。另外，在奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后有提高奶牛采食量的趋势，对产奶量的提高起到积极的作用。

3.3 不同添加水平Oo和RPLys组合奶牛乳成分的影响

乳脂率和乳蛋白率是衡量奶牛生产性能的主要指标，也是评定乳品质优劣的重要指标。本试验中，各试验组的乳脂率和乳蛋白率与对照组相比均有提高，其中添加适中水平的Oo能显著提高奶牛的乳脂率，添加适中水平的RPlys能显著提高奶牛的乳蛋白率。石宁^[28]研究Oo对奶牛生产性能的影响时发现，Oo可以提高奶牛的产奶量并改善乳脂肪酸的组成，提高奶牛的乳脂率。云伏雨等^[29]研究过瘤胃赖氨酸对奶牛产奶量和乳成分的影响时发现，RPLys显著提高了奶牛的产奶量，并对乳蛋白率、乳脂率的提高具有积极的作用。Giallongo等^[27]研究RPLys对奶牛生产性能的影响时指出，RPLys可以提高奶牛的产奶量和乳蛋白率。唐庆凤等^[30]研究发现，饲粮中添加RPLys能显著提高泌乳水牛的乳蛋白率。奶牛饲粮中的小肠可消化蛋白(IDCP)是合成乳蛋白的来源^[5]，通过向奶牛饲粮中添加RPLys，提高了IDCP的总量，并改善IDCP中可消化氨基酸的组成比例，达到提高牛奶中乳蛋白率的作用。另外，奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后，乳脂率、乳蛋白率提高的原因可能是，Oo通过调节瘤胃内pH，改善瘤胃微生物的生存环境，促进瘤胃内有益菌群的生长和繁殖^[22]，同时RPLys增加了小肠可利用氨基酸数量，二者共同促进了奶牛机体对营养物质的消化和吸收。

乳体细胞数与奶牛的产奶量密切相关，同时乳体细胞数反映奶牛乳房的健康状况，乳体细胞数越少，说明奶牛隐性乳房炎的发病率越低。本试验中，在奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后，各试验组牛奶中乳体细胞数极显著降低，说明奶牛乳房的健康状况得到改善，有助于提高奶牛的产奶量并改善乳品质。郭琦^[31]在研究Oo对奶牛SCC的影响时发现，Oo可以显著降低奶牛乳体细胞数，降低奶牛隐性乳房炎的发病率。Oo的主要成分香芹酚通过使细胞膜中的蛋白质变性而改变细胞膜的通透性，破坏蛋白质的合成，使有害菌生长受到抑制^[20]，从而降低奶牛的乳体细胞数。另外，Oo和RPLys可以促进机体免疫器官的生长发育，提高吞噬细胞的吞噬能力，增加机体的免疫能力^[32]，对降低奶牛乳体细胞数、提高乳房的健康状况具有积极的作用。

3.4 不同添加水平Oo和RPLys组合对奶牛氮表观消化率和氮排泄的影响

氮的消化代谢反映了饲粮蛋白质沉积效率和氨基酸的平衡状况，与动物的生产性能息息相关^[33]，氨作为饲粮蛋白质降解的产物，更是瘤胃微生物生长所需的主要氮源。因此，提高奶牛瘤胃中氨态氮(NH₃-N)的利用率，对提高氮的利用率、降低总氮排泄量具有积极的作用。本试验中，在奶牛饲粮中联合添加Oo和RPLys后，各试验组的总氮排泄量均极显著降低，以MM组效果最佳。Manzanilla等^[34]研究表明，Oo可以延长营养物质在消化道的停留时间，促进机体对蛋白质的吸收和利用，有助于提高氮的利用率，增加氮沉积，减少氮排泄量。程胜利等^[35]研究结果表明，包被赖氨酸可以提高绵羊对饲粮中氮素的消化率，提高饲粮蛋白质的利用率，降低氮素的排泄量。李雪玲等^[36]研究RPLys对断奶羔羊氮利用率的影响时发现，饲粮中添加RPLys能提高饲粮蛋白质的转化效率，提高氮的利用率和氮表观消化率。Oo的抑菌、抗菌作用以及RPLys在奶牛瘤胃中游离出的少量赖氨酸共同作用，改善瘤胃内的营养环境，促进有益微生物的生长繁殖，加快瘤胃微生物利用NH₃-N的速率，减少了NH₃-N的损失，使瘤胃内NH₃-N的生成和利用速率趋于平衡^[37]，进而提高氮的利用率，减少氮的排泄量。另外，Oo和RPLys的联合添加可通过改善瘤胃内的营养环境，改善瘤胃的发酵类型^[38]，提高瘤胃微生物的消化代谢能力，促进瘤胃微生物蛋白(MCP)的合成^[39]，从而降低氮排泄量。

4 结论

饲粮中联合添加Oo和RPLys能够提高奶牛的产奶性能、降低氮排泄量。综合考虑各个指标，在本试验条件下，最佳组合为Oo 13.0 g/(d·头)、RPLys 30.0 g/(d·头)。