2. 广州飞禧特生物科技有限公司, 广州 510640
2. Guangzhou Fishtech Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 510640, China
鱼粉是水产动物最重要的优质动物性蛋白质原料，具有蛋白质含量较高、氨基酸均衡、不饱和脂肪酸丰富、无抗营养因子和易消化吸收等特点，在肉食性或杂食性水产动物饲料中广泛应用。随着我国水产养殖业的快速发展，近年对鱼粉需求量日益增长，而长期对海洋渔业的过度捕捞导致渔业资源短缺，鱼粉产量逐年降低，原料市场供不应求，促使价格不断上涨。高价位的鱼粉致使饲料成本高居不下，严重制约了水产养殖业可持续发展。因此，寻求健康安全、资源丰富的廉价蛋白质替代源成为解决鱼粉短缺问题的有效途径之一。
黑水虻(Hermitia illucens)又名亮斑扁角水虻，属于双翅目水虻科的一种昆虫，幼虫期能高效地利用畜禽粪便、生活餐厨垃圾等有机质转化为自身营养成分，具有繁殖力强、适应性广、生物量大、易于加工和营养全面等特点[1]。黑水虻幼虫粉(BSFLM)是幼虫阶段的黑水虻经过筛分、烘干、粉碎处理后得到的干虫粉，因采食不同来源的废弃物，黑水虻幼虫粉中营养成分的含量存在一定差异，一般虫粉干物质中含有35%~45%的粗蛋白质，10%~40%的粗脂肪[2-3]，必需氨基酸模式与鱼粉相似，作为动物饲料具有广泛的应用前景[4-5]。研究表明，黑水虻幼虫粉替代饲料中部分鱼粉，在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[6]、海鲈(Lateolabrax japonicas)[7]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[8]、建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)[9]、锦鲤(Cyprinus carpio)[10]和大菱鲆(Psetta maxima)[11]等中均取得较好的应用效果。
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又名南美白对虾，具有生长速度快、养殖分布广和营养价值高等特点，是世界也是我国养殖面积和年产量最大的对虾养殖品种。研究表明，凡纳滨对虾对黑水虻幼虫粉(粗脂肪含量高达37.0%)干物质和粗蛋白质的表观消化率均在82%以上[12]，且发现在高盐(30.7‰)养殖条件下，黑水虻幼虫粉(粗脂肪含量为15.1%)可以部分替代鱼粉而不影响凡纳滨对虾的生长和体组成[13]。凡纳滨对虾为广盐性种类，是对虾中为数不多的能够耐受低盐的种类，因此在饲料中添加鱼粉替代物，研究其对低盐条件下凡纳滨对虾生长性能、体组成、血清生化指标和抗氧化能力的影响具有实际意义。
1 材料与方法 1.1 试验饲料以鱼粉(粗蛋白质含量为73.7%、粗脂肪含量为7.9%)、豆粕、花生粕为主要蛋白质源，高筋面粉为主要糖源，鱼油和磷脂油为主要脂肪源配制基础饲料(G0，作为对照)，然后用黑水虻幼虫粉替代基础饲料中10%(G10)、15%(G15)、20%(G20)、25%(G25)、30%(G30)的鱼粉配制5种饲料，6种试验饲料组成及营养水平见表 1。饲料原料经粉碎后过80目筛，维生素和矿物质等微量成分按逐级扩大法混合，所有原料混合均匀后加适量水混匀，用SLX-80型双螺杆挤压机制成粒径为0.5 mm的颗粒饲料，55 ℃烘干，自然冷却后放入密封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存备用。黑水虻幼虫粉由广州飞禧特生物科技有限公司提供，营养成分含量为：粗蛋白质40.85%，粗脂肪31.16%，粗灰分13.04%，水分3.16%，蛋氨酸0.63%，赖氨酸2.02%。
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表 1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
试验用凡纳滨对虾幼虾购自中山神湾养殖场。养殖试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室循环水养殖系统(缸体为300 L的圆柱形玻璃纤维缸)中进行。试验开始前将虾苗在水泥池中暂养2周。试验分组时挑选规格均匀、体格健康、平均体重约为1.80 g的凡纳滨对虾幼虾720尾，随机分为6个组(G0、G10、G15、G20、G25、G30组)，每组3个重复，每个重复放养40尾，分别投喂对应的试验饲料。每日饱食投喂3次(08:30、14:30和20:30)，并根据各组摄食情况调节次日投喂量，若有剩料收集扣除。试验期间为自然光照，水温27~31 ℃，盐度4.5‰~5.5‰，氨氮浓度 < 0.20 mg/L，亚硝酸盐浓度 < 0.01 mg/L，溶氧浓度>5.0 mg/L，pH 7.8~8.2。饲养试验为期8周。
1.3 样品采集和检测分析饲养试验结束后禁食24 h，称量每缸试验虾总重并统计存活尾数，用于计算生长性能。从每个重复中选取接近均重的20尾试验虾，其中5尾置于-20 ℃冰箱保存，用于虾体常规营养成分含量测定；另外15尾于围心腔取血，血液静置4 h后，10 000 r/min离心10 min，制备血清，于-80 ℃冰箱保存，用于血清生化指标检测。
虾体水分含量采用105 ℃常压干燥法(GB/T 6435—2014)测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—2018)测定，粗脂肪含量采用石油醚抽提法(GB/T 6433—2006)测定，粗灰分含量采用550 ℃灼烧法(GB/T 6438—2007)测定。血清白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin, GLOB)、胆固醇(cholestero, CHOL)、甘油三酯(triglyceride, TG)、尿酸(uric acid, UA)、葡萄糖(glucose, GLU)含量及谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)活性采用罗氏全自动生化分析仪(cobas-8000 c702)测定。总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)及过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定，具体操作按试剂盒的说明书进行。
1.4 计算公式增重率(weight gain rate，WGR)、特定生长率(specific growth rate，SGR)、饲料系数(feed coefficient，FC)和存活率(survival rate，SR)的计算公式如下：
增重率(%)=100×(终末均重-初始均重)/初始均重；
特定生长率(%/d)=100×(ln终末均重-ln初始均重)/试验天数；
饲料系数=总耗料量/(末总重+死亡总重-初总重)；
存活率(%)=100×(终末尾数/初始尾数)。
1.5 数据统计分析试验数据用平均值±标准误(mean±SE)表示，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后用Duncan氏法进行组间显著差异性的多重比较，显著性水平为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 黑水虻幼虫粉替代鱼粉对凡纳滨对虾幼虾生长性能的影响由表 2可知，各替代组(G10~G30组)幼虾的终末均重、增重率、特定生长率和存活率较G0组有升高趋势，但差异未达显著水平(P>0.05)。仅G15组的饲料系数显著低于G0组(P < 0.05)，较G0组降低了9.29%，其他各组间差异不显著(P>0.05)。
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表 2 黑水虻幼虫粉替代鱼粉对凡纳滨对虾幼虾生长性能的影响 Table 2 Effects of fish meal replacement by BSFLM on growth performance of juvenile Litopenaeus vannamei |
由表 3中可知，各组幼虾的粗蛋白质、粗脂肪、总磷和水分含量差异不显著(P>0.05)；仅G25组幼虾的粗灰分和钙含量较G0组显著升高(P < 0.05)，其他各组间差异不显著(P>0.05)。
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表 3 黑水虻幼虫粉替代鱼粉对凡纳滨对虾幼虾体组成的影响 Table 3 Effects of fish meal replacement by BSFLM on body composition of juvenile Litopenaeus vannamei |
由表 4可知，各替代组(G10~G30组)幼虾血清白蛋白、球蛋白、胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、尿素含量及谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性与G0组相比差异不显著(P>0.05)。
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表 4 黑水虻幼虫粉替代鱼粉对凡纳滨对虾幼虾血清生化指标的影响 Table 4 Effects of fish meal replacement by BSFLM on serum biochemical indexes of juvenile Litopenaeus vannamei |
由表 5可知，与G0组相比，G20组幼虾血清总抗氧化能力显著提高(P < 0.05)，G30组则显著降低(P < 0.05)；与G0组相比，G15~G30组幼虾血清过氧化物酶活性显著升高(P < 0.05)，G10组则显著降低(P < 0.05)；血清过氧化氢酶活性随替代水平的升高呈现先升高后降低的趋势，G15~G25组幼虾血清过氧化氢酶活性较G0组显著升高(P < 0.05)；G25组幼虾血清超氧化物歧化酶活性较G0组显著升高(P < 0.05)，其他各组间差异不显著(P>0.05)。
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表 5 黑水虻幼虫粉替代鱼粉对凡纳滨对虾幼虾血清抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of fish meal replacement by BSFLM on serum antioxidant indexes of juvenile Litopenaeus vannamei |
本试验结果显示黑水虻幼虫粉替代30%(黑水虻幼虫粉添加量为10.82%)及以下的鱼粉对凡纳滨对虾幼虾的终末均重、增重率、特定生长率和存活率未产生显著影响，各替代组幼虾的增重率、特定生长率和存活率均高于对照组(G0组)，15%替代组(黑水虻幼虫粉添加量为5.41%)幼虾的生长性能最佳，这与Cummins等[13]试验得出的黑水虻幼虫粉替代60%(黑水虻幼虫粉添加量为21%)或以下的鱼粉对凡纳滨对虾的增重率、特定生长率、饲料系数和存活率没有显著影响，20%替代组(黑水虻幼虫粉添加量为7%)效果最佳的结果基本一致，但二者不同的是本试验是在低盐度、低鱼粉的凡纳滨对虾幼虾配合饲料中利用高油脂黑水虻幼虫粉开展的替代研究，在这种养殖模式下黑水虻幼虫粉替代鱼粉依然是可行的，再次说明凡纳滨对虾幼虾能够很好地利用黑水虻幼虫粉。也有报道显示蝇蛆粉[14]和脱脂蚕蛹粉[15]替代部分鱼粉对凡纳滨对虾增重率、特定生长率、摄食率、饲料效率、存活率无显著影响，说明昆虫粉可以适量替代鱼粉应用于凡纳滨对虾饲料中，但替代量的高低与昆虫种类及其营养组成有关。本团队使用餐厨养殖或花生麸养殖的黑水虻幼虫粉替代海鲈[7, 16]、草鱼[17]和黄颡鱼[8, 18]配合饲料中的鱼粉所得研究结果也说明适宜替代量与黑水虻幼虫粉的营养价值直接相关。同样，在建鲤[9, 19]、锦鲤[10]、大菱鲆[11]、大西洋鲑[20]、黄颡鱼[21]和澳洲肺鱼[22]等试验动物中得出黑水虻幼虫粉可以部分替代鱼粉，但在不同试验动物上替代量不同，且替代量与黑水虻幼虫的来源有关。关于不同培养基质获得的黑水虻幼虫营养价值差异的研究早有报道，餐厨养殖的黑水虻幼虫营养组成优于鸡粪、酒糟和牛粪养殖的黑水虻幼虫[23]，并且处理餐厨垃圾获得的黑水虻幼虫较处理鸡粪、变质果蔬和生物沼液获得的黑水虻幼虫粗脂肪含量高、粗灰分含量低[24]，且处理餐厨垃圾获得的黑水虻幼虫较处理鸡粪获得的黑水虻幼虫含有更丰富的不饱和脂肪酸和必需脂肪酸[2]。当使用过多的黑水虻幼虫粉导致试验动物生长性能下降时，这可能与鱼、虾对黑水虻幼虫粉或含有高虫粉的配合饲料的干物质、粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率下降有关[8, 11, 21]。
饲料组成往往会影响水产动物的体组成。研究表明，黑水虻幼虫粉和脱脂黑水虻幼虫粉替代0~100%鱼粉对幼建鲤鱼体粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和水分含量均无显著影响[9, 16]，这与在黄颡鱼[18]和澳洲肺鱼[22]中用黑水虻幼虫粉替代鱼粉对体组成无显著影响的结果一致。本团队前期在花鲈上的研究发现黑水虻幼虫粉替代20%或以上鱼粉时仅鱼体粗脂肪含量显著提高[7]，也有黑水虻幼虫粉替代52.2%的鱼粉蛋白(黑水虻幼虫粉添加量为49%)使大菱鲆鱼体粗脂肪含量显著下降的报道[11]。本试验中，仅25%替代组(黑水虻幼虫粉添加量为9.02%)虾体粗灰分和钙含量显著升高，其他替代组幼虾体组成与对照组均无显著差异，这一结果与黑水虻幼虫粉替代40%鱼粉(黑水虻虫粉添加量为14%)对凡纳滨对虾虾体粗脂肪含量、替代80%(黑水虻虫粉添加量为28%)或以下鱼粉对虾体粗蛋白质含量、替代100%鱼粉(黑水虻虫粉添加量为36%)对虾体粗灰分含量均无显著影响的报道[13]不完全一致，这可能与试验所用黑水虻幼虫粉的营养组成(尤其是矿物质组成)和添加量等不同有关，有待深入研究。
3.2 黑水虻幼虫粉替代鱼粉对凡纳滨对虾幼虾血清生化指标和抗氧化能力的影响鱼类血液生化指标是反映动物生理机能及代谢状况的重要指标，也是衡量动物健康标准的指标[25]。影响鱼类血液指标的因素有很多，主要有性别、生长、运动、饱食、健康状况等[26]，在同等条件下这些指标仍能够很好地反映养殖动物的生理状况和健康状况。血清总胆固醇和甘油三酯的含量可反映机体脂肪代谢的状况。本试验中黑水虻幼虫粉替代30%或以下的鱼粉对幼虾血清白蛋白、球蛋白、胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、尿素含量以及谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性均没有产生显著影响，说明在本试验条件下，黑水虻幼虫粉对凡纳滨对虾幼虾蛋白质、脂肪和糖类三大营养物质代谢未产生明显负面影响，这与黑水虻幼虫粉替代鱼粉对建鲤血清生化指标没有显著影响的结果[9, 19]一致，也与蝇蛆粉替代60%以下鱼粉对凡纳滨对虾血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性没有显著影响的结果[27]一致。不同于本试验结果，胡俊茹等[7]采用黑水虻幼虫粉替代50%或以下鱼粉时仅20%替代组鲈鱼血清球蛋白含量显著上升，血清其他生化指标均无显著变化；刘兴等[10]在锦鲤饲料中用黑水虻幼虫粉替代70%的鱼粉和陈晓瑛等[18]在黄颡鱼饲料中用黑水虻幼虫粉替代30%鱼粉时均导致试验动物血清谷丙转氨酶活性显著降低。分析原因，这可能是由对虾(低等动物)和鱼类(脊椎动物)本身氨基酸代谢能力的差异和饲料组成不同所导致的。
本试验结果显示黑水虻幼虫粉替代适宜水平的鱼粉时凡纳滨对虾幼虾血清抗氧化指标——总抗氧化能力以及过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性显著提高。刘兴等[10]研究发现黑水虻幼虫粉替代70%或以下的鱼粉导致锦鲤血清和肝胰脏超氧化物歧化酶活性显著升高，血清和肝胰脏过氧化氢酶活性有一定增加。使用脱脂黑水虻幼虫粉替代饲料中鱼粉时对建鲤血清抗氧化指标超氧化物歧化酶活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量无显著影响，但替代量为75%或100%时建鲤血清过氧化氢酶活性显著提高[19]。在黄颡鱼配合饲料中使用黑水虻幼虫粉替代25%鱼粉时其血清超氧化物歧化酶活性显著上升[21]。在草鱼种鱼饲料中用黑水虻幼虫粉替代20%鱼粉时其血清超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力有一定程度地提高[17]。虽然在花鲈饲料中使用脱脂黑水虻幼虫粉替代64%或以下的鱼粉对血清超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)活性没有显著影响，但可以显著降低血清过氧化氢酶活性[16]。上述报道与本试验结果基本相似，表明当使用一定量的黑水虻幼虫粉替代饲料中鱼粉时对提高养殖动物的抗氧化能力具有积极的促进作用。黑水虻幼虫粉替代鱼粉提高水产动物抗氧化能力的作用是否与黑水虻幼虫粉中的含有的抗菌肽以及其他未知生物活性成分相关，值得进一步深入研究。
4 结论本试验条件下，黑水虻幼虫粉替代饲料中30%(黑水虻幼虫粉添加量为10.8%)或以下的鱼粉对凡纳滨对虾幼虾的生长性能有一定的促进作用，当替代水平为15%时，饲料系数最低，增重率最高。黑水虻幼虫粉替代饲料中15%~20%的鱼粉对凡纳滨对虾幼虾体组成和血清生化指标无显著影响，但可显著提高血清中抗氧化酶的活性，进而提高机体的抗氧化能力。
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