早期断奶是提高生猪整体养殖效率的一个重要技术手段。但由于断奶期间，环境、饲粮、营养等应激因素的改变容易引发仔猪断奶综合征，导致仔猪机体免疫力下降、腹泻、生长缓慢，甚至死亡。饲用抗生素在仔猪断奶应激的防治上发挥了重要作用，但过度使用抗生素带来的病原菌耐药性增加和猪肉产品药物残留问题，进一步增加了畜禽疾病和死亡率的风险，并引起畜牧业经济和公共健康问题[1-2]。随着抗生素作为促生长饲料添加剂即将全面禁止使用，对抗生素替代品(如氧化锌、植物精油、益生元、益生菌、酸化剂等)的研究已成为一个热点[3]。最近，噬菌体成为了一种替代抗生素的重要潜在新产品。目前关于噬菌体在动物疾病诊断和治疗上的研究报道较多，但其作为抗生素替代物在动物生产上的应用还鲜有报道。噬菌体是一种天然存在于自然界并易于获得的病毒，是细菌的天敌，能够专性裂解特异种属的细菌[4]，且不受细菌耐药性的限制，特异性强，对正常菌群结构的影响小。目前，美国、韩国等国家的科技人员正在开发用来对抗病原细菌的噬菌体，该噬菌体具有对抗传统抗生素治疗具有抗性的超级细菌的能力，可以预见，噬菌体制剂在畜牧生产中具有广阔的前景[5]。现有研究表明，在生长猪饲粮中添加0.025%和0.050%的抗沙门氏菌噬菌体后，生长猪对饲粮干物质、氮等养分消化率及能量利用均有改善[6]。但是噬菌体是通过怎样的途径来改善机体肠道健康以及二糖酶活性的呢？仔猪后肠段内大量的微生物能发酵碳水化合物，产生短链脂肪酸(SCFA)，微生物发酵产生SCFA的能力受细菌数量、pH及底物等的影响。小肠二糖酶是碳水化合物消化吸收的关键酶，断奶后会引起二糖酶活性急剧下降，仔猪的消化能力下降从而引起腹泻[7]。为了研究噬菌体替代抗生素的效果，并为揭示其作用机理提供依据，本试验通过向断奶仔猪饲粮中分别添加不同剂量噬菌体与抗生素，比较观察了噬菌体制剂对断奶仔猪生长性能、腹泻指数、肠道内容物pH、挥发性脂肪酸含量以及二糖酶活性的作用效果，并探讨了噬菌体制剂替代抗生素在仔猪饲粮中科学应用的有效性和可行性。
1 材料与方法 1.1 试验材料噬菌体制剂由某生物科技有限公司馈赠，由载体发酵大豆蛋白和玉米粉混合而成，噬菌体含量≥1.0×106 CFU/g。
1.2 试验动物和分组设计动物试验在九江市德安县某猪场完成。试验采用单因素试验设计，选用120头遗传背景相似、健康状况良好、胎次接近、初始体重为(7.35±0.03) kg的25日龄断奶仔猪，随机分为4个组，每组5个重复，每个重复6头仔猪。4组仔猪分别饲喂对照饲粮[基础饲粮中添加50 mg/kg奎烯酮(有效含量25 mg/kg)和75 mg/kg金霉素(有效含量11.25 mg/kg)]及基础饲粮中分别添加200、400和600 mg/kg噬菌体的饲粮。试验期为21 d。
1.3 基础饲粮基础饲粮参照NRC(2012) 5~20 kg阶段猪营养需要量配制，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成与营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
仔猪饲养于保育舍，试验期间不限制进食，可自由采食、饮水。其他饲养管理措施、免疫程序按猪场常规标准管理操作实施。
1.5 样品采集及处理试验结束时，仔猪禁食12 h，从各组的每个重复中选取1头接近平均体重的仔猪立即屠宰。分离仔猪十二指肠、空肠、回肠和盲肠，用于测定食糜pH。剪取盲肠中段肠管和结肠带有食糜的部位，结扎固定取样部位的两端，用锡箔纸包被后，用保鲜膜连同棉线一端裹好，另一端贴好标签纸，迅速置于液氮中冷冻，后转入-80 ℃冰箱保存，用于盲肠和结肠内容物挥发性脂肪酸含量分析。
分离十二指肠和空肠，洗净肠腔，于干净台面上小心刮取肠黏膜，编号后分装在无菌冻存管中，迅速置于液氮中冷冻，后转入-80 ℃冰箱保存，用于二糖酶活性的测定。
1.6 测定指标及方法 1.6.1 生长性能试验第1和21天清晨以组为单位称重记录, 仔猪称重前空腹12 h，记录仔猪初重和末重，计算全期体增重。
1.6.2 腹泻指数试验期内每天07：00观察仔猪粪便，按照Castillo等[8]的方法对粪便进行评分。0分：粪便条形或粒状；1分：软粪、能成形；2分：稠状、不成形、粪水未分离；3分：液状、不成形、粪水分离。当粪便评分≥2时认为仔猪发生腹泻。计算试验期内各组腹泻指数，计算公式如下：
腹泻指数＝试验期内每组仔猪腹泻总评分/每组仔猪头数。
1.6.3 肠道内容物pH取好肠样，立即用pH计测定十二指肠、空肠、回肠以及盲肠内容物pH，每个肠段重复测量3次，并做好记录。
1.6.4 肠道挥发性脂肪酸含量参考贺琴等[9]的操作方法，分别准确称取1 g解冻后的盲肠和结肠内容物于EP管中，加入1 mL超纯水漩涡振荡至内容物混合均匀，在4 ℃条件下15 000 r/min离心15 min。转移上清液，按体积比9 : 1加入25%偏磷酸固定，气相色谱仪测定挥发性脂肪酸含量。
1.6.5 肠道二糖酶活性各准确称取0.3 g的十二指肠和空肠黏膜样品，加入2.7 mL磷酸盐缓冲液(PBS)，于低温条件下研磨混匀，在4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min，取上清液，即得到10%的小肠黏膜匀浆液，采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定十二指肠和空肠黏膜蔗糖酶、乳糖酶和麦芽糖酶活性。
1.7 数据处理与统计分析所有数据用Excel 2016简单处理后，采用SPSS 20.0软件进行方差分析，Duncan氏法进行多重比较，通过回归分析作线性和二次曲线拟合。各组数据以“平均值±标准误”表示。以P < 0.05为差异显著性判断标准，0.05≤P < 0.10为有差异趋势。
2 结果与分析 2.1 噬菌体对断奶仔猪生长性能和腹泻指数的影响由表 2可知，与对照组相比，饲粮中添加400、600 mg/kg噬菌体可显著提高仔猪全期增重(P < 0.05)，随着饲粮噬菌体添加量的提高，仔猪全期增重呈显著线性和二次曲线变化(P=0.001和P=0.003)。400、600 mg/kg噬菌体组仔猪腹泻指数显著低于对照组与200 mg/kg噬菌体组(P < 0.05)。随着饲粮中噬菌体添加量的提高，仔猪腹泻指数呈显著线性和二次曲线变化(P=0.024和P=0.015)。
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表 2 噬菌体对断奶仔猪生长性能和腹泻指数的影响 Table 2 Effects of bacteriophage on growth performance and diarrhea index of weaned piglets (n=5) |
由表 3可知，与对照组相比，饲粮中添加400 mg/kg噬菌体可显著降低仔猪回肠pH(P < 0.05)，降幅为7.7%，并对空肠pH有降低的趋势(P=0.089)，降低7.6%。各组间盲肠pH虽无显著差异(P>0.05)，但与对照组和200 mg/kg噬菌体组相比，400 mg/kg噬菌体组盲肠pH分别降低4.4%、7.3%。与200 mg/kg噬菌体组相比，600 mg/kg噬菌体组盲肠pH降低3.6%。
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表 3 噬菌体对断奶仔猪肠道内容物pH的影响 Table 3 Effects of bacteriophage on intestinal pH of weaned piglets (n=5) |
由表 4可知，与对照组相比，饲粮中添加400和600 mg/kg噬菌体可显著提高仔猪盲肠乙酸、丁酸、总酸含量(P < 0.05)，且随着饲粮中噬菌体添加量的提高，盲肠乙酸、丁酸和总酸含量呈显著线性和二次曲线变化(P < 0.01和P < 0.01，P=0.017和P=0.014，P < 0.01和P < 0.01)；200、400 mg/kg噬菌体组仔猪盲肠丙酸含量显著低于对照组及600 mg/kg噬菌体组，而200和400 mg/kg噬菌体组之间差异不显著(P>0.05)；600 mg/kg噬菌体组中盲肠戊酸含量显著高于其他各组(P < 0.05)；与对照组相比，饲粮中添加400 mg/kg噬菌体对盲肠异丁酸和异戊酸含量无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，饲粮中添加400 mg/kg噬菌体可显著提高仔猪结肠乙酸、总酸含量(P < 0.05)，且随着饲粮中噬菌体添加量的提高，结肠乙酸含量呈显著先升高后降低的二次曲线变化(P=0.008)；与200和600 mg/kg噬菌体组相比，400 mg/kg噬菌体组中丁酸含量显著升高(P < 0.05)；与对照组相比，400 mg/kg噬菌体组仔猪结肠内异戊酸含量有升高的趋势(P=0.053)，升高49.80%。
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表 4 噬菌体对断奶仔猪盲肠和结肠挥发性脂肪酸含量的影响 Table 4 Effects of bacteriophage on volatile fatty acids contents in cecum and colon of weaned piglets (n=5) |
由表 5可知，与对照组相比，饲粮中添加400 mg/kg噬菌体可显著提高仔猪十二指肠黏膜中乳糖酶活性(P < 0.05)，随着饲粮中噬菌体添加量的提高，十二指肠黏膜中乳糖酶活性呈显著先升高后降低的二次曲线变化(P=0.029)；与对照组和200 mg/kg噬菌体组相比，400 mg/kg噬菌体组中十二指肠黏膜蔗糖酶活性显著升高(P < 0.05)；400 mg/kg噬菌体组与对照组仔猪十二指肠黏膜中麦芽糖酶活性无显著差异(P>0.05)，但400 mg/kg噬菌体组麦芽糖酶活性提高了31.63%。与对照组和200 mg/kg噬菌体组相比，饲粮中添加400 mg/kg噬菌体可显著提高空肠黏膜中麦芽糖酶活性(P < 0.05)。
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表 5 噬菌体对断奶仔猪十二指肠和空肠黏膜二糖酶活性的影响 Table 5 Effects of bacteriophage on duodenum and jejunum mucosal disaccharidase activity of weaned piglets (n=5) |
仔猪断奶是一个很大的应激过程，仔猪从液体母乳直接过渡到固体饲料，采食量下降，易出现“断奶应激综合征”。随着仔猪日龄的增长维持需要量增加，从母乳中获得的母体免疫缺失，对肠道病原菌的敏感性增加，患肠道疾病的可能性增大[10]，导致仔猪出现“生长抑制”现象。动物体内和其生活环境中含有大量的噬菌体，其中体内噬菌体对维持肠道平衡起着重要的作用[11]。新生仔猪可以从母乳中获得极高的被动免疫，断奶后被动免疫下降，仔猪易出现采食量下降、消化不良、饲料转化率降低和腹泻等现象[12]。20世纪60年代，世界卫生组织依照国际标准在东巴基斯坦的达卡进行的噬菌体和四环素治疗霍乱的对比测试表明，噬菌体对腹泻的治疗效果与四环素相当，能够显著减少粪便中的霍乱弧菌[13]。Bull等[14]结果表明，噬菌体能够有效地治疗大肠杆菌引起的猪、牛、羊腹泻。Kim等[15]表明，饲粮中添加噬菌体，生长猪平均日增重和平均日采食量均有改善，但对料重比没有显著影响。Gebru等[16]研究表明，饲粮中添加3×109 CFU/kg的抗鼠沙门氏菌噬菌体能够显著提高猪的平均日增重，降低料重比。张灿等[17]研究结果表明，灌服噬菌体对白羽肉鸡生长性能没有显著影响。本试验结果表明，与对照组相比，饲粮中添加400、600 mg/kg噬菌体可显著提高仔猪全期增重，同时400、600 mg/kg噬菌体组中仔猪腹泻指数也显著低于对照组与200 mg/kg噬菌体组。
3.2 噬菌体对断奶仔猪肠道内容物pH的影响pH是维持动物体内内环境稳态的重要因素之一，pH的高低直接影响着肠道内物质的消化吸收。仔猪断奶前全部营养来源于母乳，断奶后，仔猪从液体母乳直接过渡到固体饲料，采食量下降，乳糖发酵产生的乳酸受限，加上胃酸分泌不足，导致胃肠内pH升高。有学者发现，乳糖发酵产生的乳酸是维持肠道较低酸度的重要物质[18-19]。同时肠道内pH也是维持消化酶分泌和活性的重要因素，pH升高不仅影响消化酶活性，同时会增加病原微生物的附着，降低有益微生物的数量，最终导致肠道内环境紊乱[20]。研究还发现，肠道内胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和淀粉酶等的分泌和活性都受肠道内pH的影响[21]。Lee等[22]研究表明，pH还可以影响肠道细菌群落的组成。本研究结果显示，与对照组相比，饲粮中添加400 mg/kg噬菌体可显著降低仔猪回肠pH，空肠pH有降低的趋势，降低7.56%。这表明在一定的程度上噬菌体能够提高仔猪肠道内消化酶活性，维持肠道消化功能，促进仔猪体内营养物质的吸收利用。
3.3 噬菌体对断奶仔猪盲肠和结肠挥发性脂肪酸含量的影响微生物代谢产物和宿主发生复杂的相互作用，其中最重要的细菌代谢产物是SCFAs，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等[23]。SCFAs可作为宿主细胞的直接能量底物，刺激胃肠激素的产生，抵御病原微生物侵袭以及维持动物肠道健康[24]。仔猪肠道微生物发酵碳水化合物还可产生大量的乳酸[25]。有研究发现，肠道微生物能通过利用乳酸和乙酸转化生成丁酸[26]。丁酸作为小肠上皮细胞的直接能源物质，能刺激上皮细胞增殖。乙酸为肠道内重要的代谢产物，主要的作用是用于合成丁酸[27]。有学者在小鼠模型中进行的一项研究表明，乙酸盐产量的增加可抑制大肠杆菌毒素从肠腔到血液的转移，从而改善上皮细胞介导的肠道防御，保护宿主免受致命感染[28]。反观本试验结果，添加噬菌体能够显著增加盲肠和结肠中乙酸含量，表明噬菌体在一定程度上可以保护仔猪肠道健康，免受病原菌等感染。此外本试验还得出，饲粮中添加400 mg/kg噬菌体可显著提高仔猪盲肠和结肠中总挥发性脂肪酸含量，添加600 mg/kg噬菌体可显著增加盲肠总酸和戊酸含量。蒲俊宁等[29]发现挥发性脂肪酸可通过降低肠道pH和氧化还原电位促进有益菌生长，抑制有害菌增殖，改善肠道微生态环境。本试验结果表明，噬菌体可以调节仔猪肠道挥发性脂肪酸含量，盲肠和结肠挥发性脂肪酸含量变化不同可能与肠道内微生物种类以及肠道pH有关，具体调节机制有待进一步研究。
3.4 噬菌体对断奶仔猪肠道二糖酶活性的影响在消化能力方面，肠道酶在一定程度上负责食品加工，将大分子营养物质水解成小分子供肠道吸收[30]。饲粮中的碳水化合物主要由多糖、寡糖、二糖和单糖组成，可为单胃动物提供能量，然而动物体只能吸收单糖，多糖和寡糖需先经过一系列消化酶的作用转变为二糖[31]，二糖的消化吸收则需要肠道二糖酶的参与[32]。在二糖酶中，随着年龄的增长，小肠刷缘膜上的麦芽酶和蔗糖酶的活性增加，而乳糖酶的活性由于饮食转换如断奶而减弱[33]。断奶后仔猪肠道二糖酶分泌不足，加上胃肠道pH升高，抑制了消化酶活性，降低了肠道的消化吸收能力。大量未消化完全的营养物质在后肠段堆积，为致病微生物的附着与繁殖提供生存条件，肠道有害菌顺势发展为优势菌群，最终导致仔猪腹泻。本试验研究发现，400 mg/kg噬菌体组仔猪十二指肠蔗糖酶和乳糖酶活性显著升高，空肠中麦芽糖酶活性显著升高。这可能是由于噬菌体改善了肠道内环境，从而使肠道内二糖酶活性得到了提高；还可能是噬菌体增加了小肠绒毛面积，增加了二糖酶的附着位点，从而提高了肠道内二糖酶的活性。
4 结论① 饲粮中添加噬菌体可以提高仔猪生长性能，改善仔猪的腹泻情况。
② 饲粮中添加噬菌体可以降低断奶仔猪肠道内pH，对肠道消化酶活性具有一定的调节作用。
③ 饲粮中添加噬菌体能够调节仔猪盲肠和结肠中挥发性脂肪酸含量。
④ 饲粮中添加噬菌体可以提高仔猪十二指肠和空肠黏膜二糖酶活性，表明仔猪对碳水化合物消化吸收能力增强。
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