粗饲料是反刍动物重要的营养来源，占反刍动物饲粮的40%~80%[1]。全株青贮玉米能量高、纤维含量低、单位面积上干物质产量高、对反刍动物瘤胃环境及肠道健康起着重要的作用，是优质的粗饲料资源。随着“中央一号文件”中“粮改饲”政策的推行，青贮玉米等饲用作物展开大面积种植。但目前，我国对青贮玉米的研究仍停留于对其营养成分或某些单一指标的测定。如张万祥等[2]、吴欣明等[3]对青贮玉米各营养成分进行了探究；殷满财等[4]借助美国康奈尔大学净碳水化合物-净蛋白质体系(CNCPS)评价包括青贮玉米秸秆在内6种常见粗饲料的营养价值；陈晓琳等[5]研究了青贮玉米秸在肉牛体内的瘤胃降解特性。传统的湿化学分析方法在测定样品时耗时长、费用高，并且测定过程中往往会发生剧烈的化学反应，采取将物质同质化或提取的方法以达到分析的目的。傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术能弥补湿化学分析方法在测定样品过程中的不足之处，且能揭露饲料的结构信息[6]。酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带是蛋白质红外光谱的2个重要的特征区域，与蛋白质相关的官能团变化会直接体现在二者的峰高及峰面积的数值上。蛋白质二级结构主要包括α-螺旋和β-折叠，饲料的蛋白质二级结构会影响饲料蛋白质的质量、营养利用及消化率[7]。本试验旨在探究不同种植地对全株青贮玉米蛋白质营养价值、干物质(DM)和粗蛋白质(CP)的瘤胃降解参数的影响，同时利用FTIR技术对不同种植地青贮玉米进行扫描，探求不同种植地是否明显改变青贮玉米中蛋白质分子结构，最后进行相关性分析，证明借助光谱参数对其蛋白质营养价值进行预测的可行性，在分子结构层面对不同种植地全株青贮玉米的蛋白质效价进行更深入地了解。
1 材料与方法 1.1 试验样品采集与处理本试验选取气候环境差异较大，且玉米种植普及的5个地区的全株青贮玉米，分别为：北京、天津、河北沧州、新疆乌鲁木齐、吉林东丰，品种为丰垦白糯。各地区地理气候条件如下。
北京：典型的暖温带半湿润大陆性季风气候，夏季高温多雨，冬季寒冷干燥，春秋短促。年平均气温约为14.0 ℃，年无霜期180~200 d，年平均降水量483.9 mL，降水季节分配很不均匀。
天津：暖温带半湿润大陆性季风气候，四季分明。年平均气温约为14.0 ℃，年无霜期196~246 d，年平均降水量360~970 mL。
河北沧州：温带大陆性季风气候，四季分明。年平均气温约为14.2 ℃，年无霜期81~204 d，年平均降水量484.5 mL。
新疆乌鲁木：中温带大陆性干燥气候，春秋两季较短，冬夏两季较长，昼夜温差大。年平均气温约为7 ℃，年无霜期150~220 d，年平均降水量294 mL。
吉林东丰：温带大陆性季风气候，四季分明，雨热同季。年平均气温约为4.5 ℃，年无霜期100~160 d，年平均降水量400~600 mL。
收割时间均为乳熟后期至蜡熟前期，每个种植地使用五点取样法各刈割20株，留茬高度约10 cm。将采集的样品切段后放入烘箱，65 ℃烘干至恒重，制成风干样品，将烘干后的样品混合均匀，用粉碎机粉碎后，一部分样品过1 mm孔筛，用于常规营养成分测定和瘤胃降解试验，一部分样品过0.25 mm孔筛，用于中红外光谱信息的采集。
1.2 试验动物及饲粮在东北农业大学阿城试验基地选取3头体况良好、装有永久性瘤胃瘘管的干奶期健康荷斯坦奶牛(体重550~600 kg)作为试验动物。每天饲喂2次，分别在07:00和21:00，自由饮水。试验饲粮组成及营养水平参照李昕等[8]的试验。
1.3 测定指标及方法 1.3.1 常规养分分析饲料样品DM含量按照AOAC(1990)[9]方法进行分析；使用FOSS 8400全自动凯氏定氮仪对饲料CP、中性洗涤不溶蛋白(NDICP)和酸性洗涤不溶蛋白(ADICP)含量进行测定；可溶性蛋白(SCP)含量按照Krishnamoorthy等[10]方法分析；非蛋白氮(NPN)含量采用三氯乙酸法进行测定。根据CNCPS公式[11]求出蛋白质各组分含量。
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试验采用体内尼龙袋法[12]进行测定，选用大小为10 cm×20 cm、孔径为40 μm的尼龙袋，提前称重并标号，再向已称重的尼龙袋内准确称取7 g的待测样品。尼龙袋采取逐步放入，统一取出的方法，在瘤胃内的滞留时间分别设为0、4、8、12、24、36、48和72 h，每个时间点放入3个尼龙袋。取出后的尼龙袋(连同0 h)一起放入冷水中终止发酵，反复冲洗至流水澄清为止。然后65 ℃烘干至恒重，将尼龙袋内剩余的饲料取出，粉碎，并测定瘤胃降解后不同时间点剩余饲料的CP含量。
待测饲料在瘤胃中不同时间点的消失率计算公式如下：
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瘤胃降解参数根据Ørskov等[13]提出的数学指数模型进行计算：
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式中：y为某物质t时间点的瘤胃消失率；t为瘤胃滞留时间；a为某物质在瘤胃内的快速降解部分(%)；b为某物质在瘤胃内的慢速降解部分(%)；c为慢速降解部分的降解速率(%/h)；ED为某物质的有效降解率；k为瘤胃外流速度，本试验中取k=0.025 h-1[14]。
1.3.3 FTIR数据的采集及分析光谱信息的采集于东北农业大学化学馆实验室进行。准确称取干燥的待测样品2 mg，溴化钾200 mg放入玛瑙研钵中，混合均匀，并充分研磨直至样品成粉末状，整个过程在红外烤灯下进行，防止溴化钾吸水。用红外专用压片机(型号：769YP-15A)压成半透明的薄片，然后利用FTIR仪(型号：岛津FTIR-8400S)对样品薄片进行扫描，扫描波段4 000~400 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数128次，每个样品重复采集5个图谱，读取并记录饲料样品红外光谱图。
扫描得到的饲料红外光谱图利用OMNIC 8.2软件进行分析，对蛋白质酰胺带进行基线校正。蛋白质相关官能团的分子结构主要包括：蛋白质一级结构中酰胺Ⅰ带区域(光谱区域和基线：ca.1 712~1 565 cm-1；峰高位置：ca.1 639 cm-1)和酰胺Ⅱ带区域(光谱区域和基线：ca.1 565~1 489 cm-1；峰高位置：ca.1 545 cm-1)。再利用软件中的傅里叶自动去卷积功能在酰胺Ⅰ带峰区确定蛋白质二级结构中α-螺旋(峰高位置：ca.1 656 cm-1)和β-折叠(峰高位置：ca.1 634 cm-1)的位置。读取相应的峰高和峰面积数值，进而对光谱特征参数进行分析。
1.4 统计分析通过Excel 2016软件进行初步统计整理，利用SAS 9.4软件中的PROC GLM模块对不同种植地全株青贮玉米蛋白质营养价值和瘤胃降解参数进行分析(P < 0.05表示差异显著，0.05≤P < 0.10表示差异趋于显著)；利用PROC CORR模块进行相关性分析(P < 0.01表示极显著相关，P < 0.05表示显著相关)；并利用PROC REG模块对数据进行多元回归分析，建立多元回归方程。
2 结果 2.1 不同种植地对全株青贮玉米蛋白质成分和CNCPS蛋白质组分的影响由表 1可知，不同种植地全株青贮玉米的CP、NPN、SCP、NDICP和ADICP含量均存在显著差异(P < 0.05)。在试验调查的3个地区中，天津的青贮玉米CP、NPN和SCP含量均为最高(分别为8.91%、2.06%和2.72%)；吉林的青贮玉米NPN、SCP、NDICP和ADICP含量均为最低(分别为0.89%、1.39%、1.46%和0.35%)。吉林的青贮玉米NPN含量显著低于其他4个地区(P < 0.05)；北京的青贮玉米ADICP含量显著高于其他4个地区(P < 0.05)。
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表 1 不同种植地对全株青贮玉米蛋白质成分和CNCPS蛋白质组分的影响 Table 1 Effects of different producing areas on protein components and CNCPS protein components in whole silage corn |
从CNCPS蛋白质组分来看，不同种植地青贮玉米的PA、PB2、PB3和PC含量均存在显著差异(P < 0.05)。其中北京的青贮玉米PA含量显著高于新疆(P < 0.05)；而新疆的青贮玉米PB3含量显著高于北京(P < 0.05)；天津的青贮玉米PC含量显著低于其他4个地区(P < 0.05)。
2.2 不同种植地对全株青贮玉米瘤胃降解参数的影响由表 2可知，除DM慢速降解部分的降解速率(DMc)外，不同种植地青贮玉米的DM瘤胃降解参数之间均存在显著差异(P < 0.05)。天津的青贮玉米DM快速降解部分(DMa)含量最高，为28.22%，北京、新疆其次；各地区青贮玉米DM慢速降解部分(DMb)含量的排列顺序由高到低依次为河北>北京>吉林>新疆>天津；河北的青贮玉米DM有效降解率(DMED)最高，北京其次，但二者均显著高于天津和吉林(P < 0.05)。
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表 2 不同种植地对全株青贮玉米瘤胃降解参数的影响 Table 2 Effects of different producing areas on rumen degradation parameters in whole silage corn |
不同种植地青贮玉米CP瘤胃降解参数之间存在显著差异(P < 0.05)。天津的青贮玉米CP快速降解部分(CPa)含量最高，北京其次，二者均显著高于其他3个地区(P < 0.05)；天津的青贮玉米CP慢速降解部分(CPb)含量显著低于其他4个地区(P < 0.05)；新疆和河北的青贮玉米CP慢速降解部分的降解速率(CPc)显著高于其他3个地区(P < 0.05)；吉林和河北的青贮玉米CP有效降解率(CPED)显著低于其他3个地区(P < 0.05)。
2.3 不同种植地对全株青贮玉米蛋白质分子结构的影响由表 3可知，不同种植地青贮玉米的蛋白质结构光谱特征参数之间存在显著差异(P < 0.05)。从蛋白质酰胺带来看，天津的青贮玉米酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带峰面积、酰胺Ⅰ带和Ⅱ带总面积、酰胺Ⅰ带峰高以及酰胺Ⅰ带与Ⅱ带峰高比均为最大；河北的青贮玉米酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带峰面积、酰胺Ⅰ带和Ⅱ带总面积以及酰胺Ⅰ带峰高数值上最小；新疆的青贮玉米酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带峰面积比最大，北京最小。从蛋白质二级结构来看，河北的青贮玉米α-螺旋、β-折叠峰高均为最小；天津的青贮玉米β-折叠峰高最大，α-螺旋与β-折叠峰高比最小；吉林的青贮玉米α-螺旋峰高最大。
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表 3 不同种植地对全株青贮玉米蛋白质分子结构的影响 Table 3 Effects of different producing areas on protein molecular structure in whole silage corn |
由表 4、表 5可知，不同种植地青贮玉米的蛋白质分子光谱参数与蛋白质营养价值之间存在一定的相关关系。其中，CP含量与酰胺Ⅰ带和Ⅱ带峰面积比存在极显著负相关(r=-0.83，P < 0.01)。SCP、NPN、PA含量与酰胺Ⅱ带峰面积存在显著正相关(r=0.60，P < 0.05)；与酰胺Ⅰ带和Ⅱ带峰面积比存在显著负相关(r=-0.63~-0.77，P < 0.05)。NDICP含量与α-螺旋峰高存在显著负相关(r=-0.57，P < 0.05)。ADICP含量与酰胺Ⅰ带和Ⅱ带峰面积比存在显著负相关(r=-0.63，P < 0.05)。PB3含量与酰胺Ⅱ带峰面积存在显著负相关(r= -0.53，P < 0.05)，与酰胺Ⅰ带和Ⅱ带峰面积比存在显著正相关(r=0.55，P < 0.05)。PC含量与酰胺Ⅰ带峰高和峰面积存在显著负相关(r=-0.58~-0.64，P < 0.05)。
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表 4 不同种植地全株青贮玉米的蛋白质分子结构与其蛋白质成分和CNCPS蛋白质组分之间的相关关系 Table 4 Relationship between protein molecular structure and protein components, CNCPS protein components in whole silage corn from different producing areas |
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表 5 不同种植地全株青贮玉米的蛋白质分子结构与其瘤胃动态降解参数之间的相关关系 Table 5 Relationship between protein molecular structure and rumen degradation parameters in whole silage corn from different producing areas |
由表 5可知，酰胺Ⅰ带峰面积与DMa含量存在显著正相关(r=0.54，P < 0.05)，与DMc、DMED、CPc存在极显著负相关(r=-0.67~-0.75，P < 0.01)。酰胺Ⅱ带峰面积、α-螺旋峰高与DMa、CPa含量存在显著正相关(r=0.52~0.70，P < 0.05)，与DMc、DMED、CPc存在显著负相关(r=-0.62~-0.78，P < 0.05)。酰胺Ⅰ带峰高、β-折叠峰高与DMc、DMED、CPc存在极显著负相关(r=-0.69~-0.77，P < 0.01)。CPb含量与酰胺Ⅱ带峰高存在显著正相关(r=0.55，P < 0.05)，与酰胺Ⅰ带和Ⅱ带峰高比存在极显著负相关(r=-0.75，P < 0.01)。CPc与α-螺旋峰高存在极显著负相关(r=-0.74，P < 0.01)。
2.5 不同种植地全株青贮玉米蛋白质分子结构与蛋白质营养价值之间的回归方程表 6为不同种植地青贮玉米蛋白质分子结构光谱参数与蛋白质化学成分、CNCPS蛋白质组分之间建立的回归方程。通过方程可以看出，酰胺Ⅰ带峰高、峰面积，酰胺Ⅱ带峰高、峰面积，酰胺Ⅰ带和Ⅱ带峰高比、峰面积比以及α-螺旋峰高均可作为预测因子。利用这些蛋白质分子结构光谱参数能够有效地预测CP含量(R2=0.81，P < 0.000 1)、ADICP含量(R2=0.88，P < 0.000 1)、NPN含量(R2=0.84，P=0.000 1)和CNCPS蛋白质组分中PC的含量(R2=0.85，P < 0.000 1)。
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表 6 不同种植地全株青贮玉米的蛋白质分子结构与其蛋白质成分和CNCPS蛋白质组分之间的回归关系 Table 6 Regression relationship between protein molecular structure and protein component, CNCPS protein component in whole silage corn from different producing |
由表 7可得，青贮玉米蛋白质分子结构光谱参数可以对其瘤胃降解参数进行预测。其中酰胺Ⅱ带峰面积、酰胺Ⅰ带峰高以及β-折叠峰高为最佳的预测因子。可以利用这些典型的光谱参数对DMED(R2=0.59，P=0.000 8)、CPa(R2=0.69，P=0.000 9)以及CPc(R2=0.60，P=0.000 7)进行预测。
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表 7 不同种植地全株青贮玉米的蛋白质分子结构与其瘤胃动态降解参数之间的回归关系 Table 7 Regression relationship between protein molecular structure and rumen degradation parameters in whole silage corn from different producing |
饲用作物的营养价值受气温、降雨、土壤、光照、温度、生长发育阶段等多种因素影响[15]。本试验研究表明，不同地区的青贮玉米CP含量差异很大，其中含量最高的天津地区要比含量最低的新疆地区高出1.96个百分点，说明种植地的不同对青贮玉米蛋白质成分含量有显著影响。底姝霞等[16]在研究不同种植密度对青贮玉米“农大108”营养成分的影响时发现，增大种植密度会使CP含量表现出下降趋势。买尔亚木·玉苏甫等[17]在研究覆盖材料对新疆哈密地区种植的青贮玉米生长和营养品质的影响时发现，秸秆覆盖可以显著提高青贮玉米CP含量。胡春华等[18]也提出，青贮玉米CP含量随着氮肥水平提高呈极显著上升。由于各种植区的种植环境有所差异，因此这些都可能是影响各种植区青贮玉米CP含量的因素。
CNCPS体系将饲料蛋白质分为PA、PB1、PB2、PB3、PC 5部分，其中，PA为瞬时降解部分；PB1为快速降解蛋白；PB2为中速降解蛋白；PB3为慢速降解蛋白；PC为不可降解蛋白，它含有与木质素、单宁等成分结合的蛋白部分或是其他高度抵抗微生物和酶类分解的成分，其含量越少，说明蛋白质利用率越高[11]。本试验中青贮玉米PA和PB3含量与赵广永等[19]报道的数据不一致，可能是由于饲料品种及收割时期不同等因素导致，也有可能是由于该试验选取的4个种植区与本试验并不吻合。试验发现，天津地区青贮玉米的PA含量最高，PC含量最低，说明其NPN含量较高，PC含量最少，相较于其他地区营养价值较高，但还需经瘤胃尼龙袋法进一步验证。
3.2 不同种植地对全株青贮玉米瘤胃动态降解参数的影响DM瘤胃降解率是影响干物质采食量(DMI)的一个重要因素，DM瘤胃降解率越高，DMI就越高[20]。DM瘤胃降解率受试验动物、饲粮类型、饲料种类、收获时期等多种因素的影响，因此种植地的差异很可能会对DM瘤胃降解率造成影响。粗饲料的蛋白质多存在于细胞内容物中，影响CP降解率的主要原因有饲料蛋白质的含量、组成及饲料在瘤胃内的滞留时间等[21]。本试验结果显示，全株青贮玉米的DMED在48.73%~53.36%，CPED在34.96%~54.19%，与颜欣超等[22]的试验结果相似。梁稼烨[23]的研究测得青贮玉米的DMED为55.01%，与本试验相近；CPED为68.68%，略高于本试验，这可能是由于研究的样本品种不同导致。张颖等[24]以肉牛为试验动物，测得CPED为45.21%，与本试验相似；DMED为47.92%，略低于本试验，这可能是由于试验动物不同导致。
3.3 不同种植地对全株青贮玉米蛋白质分子结构的影响酰胺Ⅰ带(1 700~1 600 cm-1)和酰胺Ⅱ带(1 560~1 500 cm-1)是蛋白质红外光谱的2个基本特征。酰胺Ⅰ带主要产生于C=O和C-N的伸展振动，它对蛋白质二级结构的改变十分敏感。因此，可以将酰胺Ⅰ带用于蛋白质二级结构的鉴定。酰胺Ⅱ带是由包括N-H和C-N等在内的多个官能团振动产生。所以，一般不将酰胺Ⅱ带用于蛋白质二级结构的鉴定[25]。本试验得出，不同种植地全株青贮玉米酰胺Ⅰ带峰高、峰面积存在极显著差异。其中，天津地区青贮玉米的CP含量最高，而其酰胺Ⅰ带的峰高、峰面积也均为最高，这与其常规化学方法测定的结果一致。反刍动物饲料中蛋白质在瘤胃内的降解直接体现在蛋白质红外光谱区域酰胺Ⅰ带的α-螺旋和β-折叠上。在酰胺Ⅰ带中，α-螺旋的谱峰位于1 658~1 650 cm-1，β-折叠的谱峰位于1 640~1 610 cm-1。它们之间的比值受饲料中蛋白质的质量、可利用性及消化率的影响。Yu等[26]发现羽毛的蛋白质含量高达84%，但蛋白质消化率却仅为5%，在与大麦、小麦、燕麦等蛋白质利用率高的饲料比较时发现，羽毛蛋白质二级结构中α-螺旋含量低，β-折叠含量高。本试验中，各地区青贮玉米蛋白质二级结构中α-螺旋和β-折叠含量均存在极显著差异，这可能是造成不同种植地青贮玉米蛋白质利用率不同的原因。
3.4 不同种植地全株青贮玉米蛋白质分子结构与蛋白质营养价值之间的相关关系研究表明，蛋白质分子结构(特征峰的峰高、峰面积及它们的比值)与蛋白质营养价值之间存在密不可分的联系，可以借助蛋白质光谱信息对饲料样品蛋白质营养价值进行估测[27]。Ban[28]在研究饼粕类饲料时发现，酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的比与CP、SCP、NPN含量存在显著负相关，与本试验结果一致。本试验中，酰胺Ⅱ带的峰面积与SCP、NPN、PA含量存在显著正相关，与PB3含量存在显著负相关，这与李昕等[8]在研究不同热处理豆渣蛋白质结构与蛋白质营养价值之间的相关性时得出的结果一致。Zhang等[29]在研究无壳大麦与干酒糟及其可溶物(DDGS)复合饲料时发现，其酰胺Ⅰ带和Ⅱ带的峰面积与DMa、DMED、CPc存在相关关系，与本试验结果相似。本试验根据相关性和回归方程得出酰胺Ⅰ带峰高、酰胺Ⅰ带峰面积、酰胺Ⅱ带峰面积、酰胺Ⅰ带和Ⅱ带的峰面积比可以有效地估测青贮玉米的蛋白质营养价值，这些结果与Gomaa等[30]的研究结果相似。Liu等[31]在对大麦外壳与籽粒降解特性时发现，α-螺旋与β-折叠的峰高比，与CPa含量、CPED存在显著正相关；Doiron等[32]和Samadi等[33]也在研究中发现α-螺旋与β-折叠的峰高比和NDICP、ADICP含量存在正相关，而本试验中α-螺旋与β-折叠的峰高比与蛋白质化学成分及降解特性之间并不存在相关，这可能是由于饲料种类不同，饲料的分子结构也存在差异。上述试验结果表明，利用蛋白质光谱特征参数可对全株青贮玉米蛋白质化学成分和瘤胃降解特性进行预测，并且通过回归方程预测其蛋白质营养价值是可行的。
4 结论① 不同种植地全株青贮玉米蛋白质成分、CNCPS组分、DM和CP瘤胃降解参数存在显著差异。
② 通过FTIR光谱技术分析得出，不同种植地全株青贮玉米蛋白质分子结构之间也存在显著差异。并且，红外光谱参数与蛋白质营养价值之间存在明显的相关关系，可以借助青贮玉米蛋白质红外光谱参数对其蛋白质营养价值进行预测。
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