提高母猪年生产力是现代养猪产业追求的目标，营养是改善母猪和新生仔猪健康、提高仔猪遗传生长潜力和母猪年生产力的有效途径。霉菌毒素是霉菌在生长繁殖过程中产生的有毒次级代谢产物，具有破坏动物免疫系统、机体器官、致癌、致畸等毒害作用，对动物及人类的危害极大[1]。玉米赤霉烯酮(zearalenone)，又称F-2毒素，是镰孢菌属真菌产生的具有雌激素活性的非类固醇类霉菌毒素，已被证明对家畜繁殖有负面影响，特别是对猪危害最大[2]。因此，降低玉米赤霉烯酮对母猪繁殖的危害对提高母猪年生产力具有十分重要的实际意义。饲粮添加玉米赤霉烯酮可使雌性断奶仔猪外阴的长度、宽度和面积及生殖器官指数发生改变[3]。玉米赤霉烯酮对母猪繁殖的影响取决于母猪所处的繁殖状态，青年母猪对玉米赤霉烯酮特别敏感，因为稍高水平的玉米赤霉烯酮就可以导致其早熟[4]。饲粮添加2 mg/kg玉米赤霉烯酮可显著增加青年母猪的生殖器官重量，并可导致其阴户红肿[5]，即使低水平的玉米赤霉烯酮仍然会造成青年母猪的DNA损伤[6]。已明确玉米赤霉烯酮会对母猪的繁殖性能产生危害，但作用机理有待深入研究。去除饲料中玉米赤霉烯酮的方法主要包括物理法、化学法和生物降解法，但这些方法作用有限，效果不确定[7]。中草药提取物甘草次酸(glycyrrhetinic acid)具有解毒、保肝护肝、增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等多种作用[8-9]。迄今，甘草次酸对玉米赤霉烯酮危害青年母猪繁殖影响的研究鲜见报道。本试验在饲粮中添加玉米赤霉烯酮以造成对青年母猪的负面影响，研究饲粮中添加甘草次酸对青年母猪生长性能、养分消化率、血清抗氧化能力及生殖激素浓度的影响，探索甘草次酸对玉米赤霉烯酮危害青年母猪繁殖的影响，为改善母猪繁殖潜力和提高母猪年生产力提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料甘草次酸(纯度≥98%)购于南京泽朗医药科技有限公司，玉米赤霉烯酮(纯度≥98%)购于Sigma公司(德国)。
1.2 试验设计与试验饲粮采用单因素随机试验设计，选用(124±7)日龄、平均体重为(61.00±3.03) kg、健康、体况良好的长×大二元青年母猪64头，按日龄、体重相近的原则随机分为4个组，分别为对照组(基础饲粮)、玉米赤霉烯酮组(基础饲粮+1 mg/kg玉米赤霉烯酮)、甘草次酸组(基础饲粮+400 mg/kg甘草次酸)，玉米赤霉烯酮+甘草次酸组(基础饲粮+1 mg/kg玉米赤霉烯酮+400 mg/kg甘草次酸)，每组4个重复，每个重复4头母猪。预试期5 d，正试期28 d。试验母猪以每重复为1个单元进行圈养，每日饲喂3次，早、中、晚各1次，每组母猪饲喂相同的饲料量，每次饲喂量以料槽中稍有余料为宜，自由饮水，其他饲养管理和免疫程序按猪场规定执行。
参照NRC(2012)营养需要配制青年母猪基础饲粮，其组成及营养水平见表 1。试验饲粮于试验开始前1次配制完成，包装后堆放在木质托盘上，贮存于清洁、阴凉、干燥、通风处。酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组饲粮中玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和黄曲霉毒素含量，各组饲粮的玉米赤霉烯酮含量分别为46.30、1 039.70、49.54和1 044.60 μg/kg，各组饲粮的呕吐毒素、黄曲霉毒素含量均符合国家饲料卫生标准(GB 13078—2017)的限量要求。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
于试验第28天，观察每组母猪的阴户发育情况，将母猪整个外阴户视为菱形，对每组母猪的阴户进行测量，准确记录母猪阴户的长和宽，计算阴户面积。
1.3.2 生长性能指标试验开始和结束时，对试验猪只进行空腹称重。试验期间，准确记录每个重复母猪的日耗料量，计算平均日增重、平均日采食量和料重比等指标。
1.3.3 血清指标试验结束时，每个重复母猪经前腔静脉采血10 mL于灭菌的离心管中，室温静置30 min，1 500×g离心15 min，上清液分装于Eppendorf管中，置于-20 ℃保存备用。采用ELISA法检测血清雌二醇(E2)、促黄体素(LH)和吻素(kisspeptin，Kp)浓度，试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司，操作方法参考试剂盒说明书。血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脱氢酶(LDH)活性，总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量采用试剂盒进行测定，试剂盒购于南京建成生物工程研究所，操作方法参考试剂盒说明书。
1.3.4 养分消化率于试验第23天至第26天，连续收集4 d新鲜粪便，准确称重，按每100 g粪样滴加10 mL 10%的硫酸，另加几滴甲苯防腐，混匀置于-20 ℃保存。试验结束后，将各组4 d的粪样混匀，按10%的比例取样，65 ℃烘干，回潮24 h，粉碎过40目筛，用样品袋密封保存于-20 ℃待测。采用4 mol/L盐酸不溶灰分内源指示剂法测定养分消化率，按照国际官方分析化学家协会(AOAC)的方法测定饲料样品和粪样中粗蛋白质(CP)、粗纤维(CF)、粗脂肪(EE)、钙(Ca)和磷(P)含量，根据食入养分量和排出养分量计算各养分消化率，计算公式如下：
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式中：a为饲料中某养分含量；c为饲料中盐酸不溶灰分含量；b为粪样中某养分含量；d为粪样中盐酸不溶灰分含量。
1.4 数据统计与分析试验数据采用Excel 2007进行初步整理，采用SPSS 17.0统计软件的ANOVA程序进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异显著时进行Duncan氏法多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，以P＜0.05作为差异显著判断标准，以P＜0.01作为差异极显著判断标准。
2 结果 2.1 甘草次酸对青年母猪阴户发育的影响由图 1可知，与对照组相比，玉米赤霉烯酮组青年母猪的阴户长、宽及面积极显著增加(P＜0.01)，甘草次酸组和玉米赤霉烯酮+甘草次酸组的阴户长、宽及面积无显著差异(P>0.05)。
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CON：对照组Control group；ZEA：玉米赤霉烯酮组Zearalenone group；GA：甘草次酸组Glycyrrhetinic acid group；ZEA+GA：玉米赤霉烯酮+甘草次酸组Zearalenone+glycyrrhetinic acid group。 数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。 Value columns with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P < 0.01). 图 1 甘草次酸对青年母猪阴户大小的影响 Fig. 1 Effects of glycyrrhetinic acid on vulva size of prepubertal gilts |
由表 2可知，与对照组相比，甘草次酸组、玉米赤霉烯酮+甘草次酸组青年母猪的终末重有增加趋势，但差异不显著(P>0.05)。甘草次酸组和玉米赤霉烯酮+甘草次酸组青年母猪的平均日采食量和平均日增重均显著高于对照组和玉米赤霉烯酮组(P＜0.05)，对照组与玉米赤霉烯酮组间的平均日采食量和平均日增重均无显著差异(P>0.05)。各组间青年母猪的料重比无显著差异(P>0.05)。
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表 2 甘草次酸对青年母猪生长性能的影响 Table 2 Effects of glycyrrhetinic acid on growth performance of prepubertal gilts |
由表 3可知，与对照组相比，玉米赤霉烯酮组青年母猪的粗脂肪消化率显著增加(P＜0.05)，钙和磷消化率显著降低(P＜0.05)。与对照组相比，甘草次酸组青年母猪的粗纤维和粗脂肪消化率显著增加(P＜0.05)，钙和磷消化率极显著增加(P＜0.01)。玉米赤霉烯酮+甘草次酸组的粗脂肪消化率显著高于对照组(P＜0.05)，其他养分消化率与玉米赤霉烯酮组相比有增加趋势(P>0.05)。
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表 3 甘草次酸对青年母猪养分消化率的影响 Table 3 Effects of glycyrrhetinic acid on nutrient digestibilities of prepubertal gilts |
由表 4可知，与对照组相比，玉米赤霉烯酮组青年母猪的血清Kp、E2、LH浓度极显著增加(P＜0.01)，甘草次酸组的血清Kp和E2浓度显著增加(P＜0.05)，玉米赤霉烯酮+甘草次酸组的血清Kp、E2和LH浓度极显著增加(P＜0.01)。
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表 4 甘草次酸对青年母猪血清生殖激素浓度的影响 Table 4 Effects of glycyrrhetinic acid on serum reproductive hormone concentrations of prepubertal gilts |
由表 5可知，玉米赤霉烯酮组青年母猪的血清MDA含量显著高于对照组和甘草次酸组(P＜0.05)。与玉米赤霉烯酮组相比，玉米赤霉烯酮+甘草次酸组青年母猪的血清MDA含量显著降低(P＜0.05)，血清LDH活性极显著降低(P＜0.01)。各组间其他青年母猪的血清抗氧化指标均无显著差异(P>0.05)。
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表 5 甘草次酸对青年母猪血清抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of glycyrrhetinic acid on serum antioxidant indexes of prepubertal gilts |
母猪阴户红肿是玉米赤霉烯酮中毒的典型表现。玉米赤霉烯酮及其代谢产物能够引起雌性动物的雌激素过多症和生殖障碍性疾病，导致母猪一系列的生殖障碍，包括诱发外阴红肿、阴道和直肠脱垂、初情期延迟及连续动情导致的不育、假孕、卵巢畸形和流产等[10]。Zhou等[11]试验表明，饲粮中添加1 mg/kg玉米赤霉烯酮可导致母猪的外阴面积增加。本研究结果表明，饲粮中添加1 mg/kg玉米赤霉烯酮可导致青年母猪阴户发育异常，阴户长、宽及面积极显著增加，与上述结果一致。Malekinejad等[12]研究表明，甘草提取物对赭曲霉毒素诱导的雄性大鼠睾丸组织病理学损伤具有保护作用。本试验结果表明，饲粮中同时添加玉米赤霉烯酮和甘草次酸未观察到青年母猪出现阴户发育异常，提示甘草次酸具有缓解玉米赤霉烯酮对青年母猪阴户发育危害的作用。
Šperanda等[13]和赵虎等[14]试验表明，玉米赤霉烯酮对猪的采食量及日增重无显著影响。本试验中，玉米赤霉烯酮组青年母猪的平均日采食量、平均日增重、料重比与对照组相比无显著差异，与上述结果一致。甘草次酸的化学结构类似于氢化可的松(皮质醇)，具有肾上腺皮质激素样作用，即调节糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢作用。何子双等[15]研究发现，在代乳粉中添加甘草次酸饲喂7日龄公仔猪能促进其生长。罗宗刚等[16]试验表明，甘草渣能提高生长育肥猪的生长性能。本试验研究发现，甘草次酸组和玉米赤霉烯酮+甘草次酸组青年母猪的平均日采食量和平均日增重均显著高于对照组，与上述报道一致。
动物肠道分泌的生长激素释放肽(ghrelin)可促进动物对营养物质的消化吸收。小猪饲粮中添加玉米赤霉烯酮可使小肠组织学结构发生变化，小肠ghrelin分泌降低，小肠的消化吸收能力降低[17]。本试验结果表明，饲粮中添加玉米赤霉烯酮显著降低青年母猪的钙和磷消化率，这可能与上述原因有关。甘草常用于治疗消化系统疾病，如脾胃虚弱、食少、消化性溃疡和肝炎等[18]。蔡东森[19]研究表明，饲料中添加甘草次酸可显著提高团头鲂幼鱼的肠道蛋白酶和脂肪酶活性。本试验结果显示，饲粮中添加甘草次酸能显著提高青年母猪粗脂肪、粗纤维等养分的消化率，与上述报道一致；与玉米赤霉烯酮组相比，玉米赤霉烯酮+甘草次酸组的养分消化率均有增加趋势，说明甘草次酸能在一定程度上改善玉米赤霉烯酮对青年母猪养分消化率的影响。
Kp参与初情期的启动和对下丘脑-垂体-性腺轴的控制[20]。E2是最重要的性激素，对生殖系统的发育和生殖功能的发挥起着关键作用[21]。LH与促卵泡激素(FSH)共同作用促进卵泡成熟和排卵，促进E2、孕激素(progesterone)的分泌以及黄体的生成和维持。动物体内生殖激素的调控作用几乎贯穿整个生殖活动，如性器官的发育、性成熟、发情、排卵、妊娠等[22]。激素间相互影响、相互调节共同对动物繁殖发挥作用，激素浓度的变化对动物的繁殖产生影响。玉米赤霉烯酮能够与动物体内的雌激素受体结合，是内分泌的干扰者[23]，可影响体内激素的分泌。关于玉米赤霉烯酮对生殖激素的影响报道结果不一。Zheng等[24]报道认为，玉米赤霉烯酮可降低动物的血清睾酮(T)、E2和孕酮(P)浓度。而王定发[5]研究表明，饲粮中添加0.5和2.0 mg/kg玉米赤霉烯酮，青年母猪的血清E2和LH浓度增加。本试验结果表明，饲粮中添加玉米赤霉烯酮使青年母猪的血清Kp、E2和LH浓度增加，这可能与动物日龄及玉米赤霉烯酮的添加水平有关。动物日龄不同，生殖器官的发育程度不同，激素的分泌水平和调控机制不同[25]。0.5和1.0 mg/kg玉米赤霉烯酮可促进卵泡的提前发育，卵泡发育成熟有利于生殖激素的分泌，而1.5 mg/kg玉米赤霉烯酮可导致生长卵泡发生闭锁[26]，从而影响激素分泌。甘草次酸抑制3α-类固醇脱氢酶(3α-HSD)和3β-类固醇脱氢酶(3β-HSD)活性[27]，而3α-HSD和3β-HSD参与激素合成过程[28]。甘草次酸可诱导人乳腺癌细胞(MCF-7)雌激素受体α(ERα)与雌激素受体β(ERβ)的蛋白表达，显示甘草次酸有雌激素样作用[29]。本试验结果表明，饲粮中添加甘草次酸，青年母猪的血清Kp和E2浓度显著增加。但是，饲粮中同时添加玉米赤霉烯酮和甘草次酸，未观察到青年母猪出现阴户发育异常现象。这可能与玉米赤霉烯酮和甘草次酸在动物体内的作用机制不同有关，关于二者作用机制有待深入研究。
氧化应激可造成机体损伤，使机体内MDA含量和LDH活性升高。机体内的SOD、GSH-Px可有效清除自由基，其活性高低可反映机体清除自由基的能力。T-AOC反映机体防御体系总体抗氧化能力的强弱。玉米赤霉烯酮能够刺激动物机体产生氧化应激，对肝脏造成氧化损伤，肝脏发生损伤时血清LDH活性增加[30]。本试验结果表明，玉米赤霉烯酮可增加青年母猪的血清MDA含量。贺建荣等[31]研究表明，甘草次酸对羟基自由基(-OH)及超氧阴离子自由基(·O2-)均有较强的清除作用，且清除能力与甘草次酸水平呈显著相关性。蔡东森[19]研究表明，饲料中添加甘草次酸也可显著提高团头鲂的抗氧化能力。本试验结果表明，与玉米赤霉烯酮组相比，甘草次酸组降低青年母猪的血清MDA含量；同时添加玉米赤霉烯酮和甘草次酸显著降低血清LDH活性。这提示甘草次酸可降低血清MDA含量和LDH活性，可改善玉米赤霉烯酮感染青年母猪的抗氧化能力。
4 结论① 饲粮中添加1 mg/kg玉米赤霉烯酮，可使青年母猪的阴户发育异常，降低钙和磷消化率，影响抗氧化能力和生殖激素浓度。
② 饲粮中添加400 mg/kg的甘草次酸，可提高青年母猪的养分消化率及血清生殖激素浓度，改善繁殖性能，降低玉米赤霉烯酮对阴户发育的影响，提高抗氧化能力。
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