复合酶制剂是一种安全、绿色的饲料添加剂^[1]，复合酶制剂中的酶能够破坏饲料原料中的抗营养因子，从而促进动物生长，提高动物的生产性能^[2]，因此复合酶制剂在实际生产中得到了广泛地应用。伊犁鹅是我国唯一由灰雁驯化而来的家鹅品种，是优质的地方遗传资源，其产蛋性能较低，且就巢性强，远不能满足规模化生产及市场的需求^[3]。王丽娟等^[4]研究表明，在海兰褐蛋鸡饲粮中添加0.4 g/kg的复合酶制剂可显著提高其产蛋率、血清总蛋白和葡萄糖含量。代谢组学技术可以对动物机体代谢生成的小分子代谢物及其相关代谢途径进行分析，系统地阐述生物机体的营养代谢变化，从而评价动物机体对饲粮的代谢过程。毛悦等^[5]利用核磁共振代谢组学技术研究了夏秋绿茶对肉鸡脂肪和氨基酸代谢的影响，结果表明，在肉鸡饲粮中添加一定水平的绿茶粉，可通过增强甘氨酸/丝氨酸和苏氨酸代谢通路以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，增强肉鸡的抗氧化能力。本试验在伊犁鹅产蛋期饲粮中添加复合酶制剂，旨在通过探究复合酶制剂对伊犁鹅产蛋性能、血清生化指标和盲肠内容物代谢组的影响，为复合酶制剂在伊犁鹅饲粮中的应用提供理论参考依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验所用复合酶制剂由深圳绿微康生物科技有限公司提供，主要成分为蛋白酶(3 000 U/g)、木聚糖酶(2 000 U/g)、纤维素酶(1 000 U/g)、甘露聚糖酶(800 U/g)、α-淀粉酶(500 U/g)、普罗兰酶(300 U/g)。

1.2 试剂与仪器

仪器：Q Exactive质谱仪(Thermo Scientific)、高效液相系统(Thermo Scientific UltiMate^TM 3000系统)。试剂：乙腈(质谱级，A955-4，Fisher)、甲醇(质谱级，A456-4，美国Fisher公司)、水(质谱级，W6-4，Fisher)、甲酸(质谱级，A117-50，Fisher)。

1.3 试验动物与试验设计

试验采用单因素试验设计，以健康状况良好、体重相近[公鹅：(3.95±0.36) kg，母鹅：(3.29±0.32) kg]、饲养管理水平一致的200只4岁伊犁鹅(由新疆额敏县恒鑫实业有限公司国家级伊犁鹅保种场提供)为试验对象，将其随机分为4组，每组10个重复，每个重复5只(公母比例为1 : 4)。各组间试验鹅初始产蛋率无显著差异(P>0.05)。对照组饲喂玉米-豆粕型基础饲粮，试验组在基础饲粮的基础上分别添加0.2(试验Ⅰ组)、0.3(试验Ⅱ组)和0.4 g/kg(试验Ⅲ组)的复合酶制剂。预试期为7 d，正试期为38 d。基础饲粮组成及营养水平见表 1。

1.4 饲养管理

饲养试验在新疆额敏县恒鑫实业有限公司国家级伊犁鹅保种场进行，试验鹅按重复进行单圈常规饲养，种鹅舍内有产蛋窝、食槽、地面运动场和水面运动场。试验期间，试验鹅自由采食和饮水，每天分2次投喂(08:00和16:00各喂料1次)，投料后捡蛋并记录。

1.5 指标测定 1.5.1 生产性能

每日准确记录各重复试验鹅的剩料量、总蛋重、总产蛋个数、不合格蛋数，根据饲养记录计算产蛋率、平均蛋重、平均日采食量、料蛋比和种蛋合格率。

1.5.2 血清生化指标

在饲养试验的第38天，停料12 h后，每个重复随机选取2只母鹅进行翅下静脉采血，室温倾斜放置20 min后，3 000 r/min离心15 min后分离血清，分装血清后于-20 ℃下保存，用于测定以下血清生化指标：总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿酸(UA)、葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量及谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性。

1.5.3 盲肠内容物代谢组

从对照组和复合酶制剂组(即生产性能最佳组，根据生产性能结果确定为试验Ⅱ组)中随机选取10只体重接近平均体重的母鹅，屠宰后迅速采集盲肠内容物，置于液氮中保存，用于代谢组学分析。

1.5.3.1 液相色谱-质谱联用(LC-MS)样品的预处理

向100 mg肠道内容物样品中加入300 μL甲醇-水(80 : 20，体积比)，将样品捣碎，使其充分混匀，14 000×g离心5 min，离心后取上清液进行LC-MS上机检测。

1.5.3.2 色谱条件

色谱柱：HYPERSIL GOLD AQ C18(粒径1.9 μm，规格100 mm×2.1 mm)；进样量：3 μL；柱温：35 ℃；流动相A：0.1%甲酸、10 mmol/L醋酸铵、水；流动相B：0.1%甲酸、90%乙腈、10 mmol/L醋酸铵、水。流动相梯度洗脱程序见表 2。

1.5.3.3 质谱条件

正、负离子各扫描1次，先进行正离子扫描，所有样品结束后再进行负离子扫描；电喷雾离子源；正、负离子均采用DDA模式扫描，质量扫描范围为质荷比(m/z)70~1 050；载气温度：350 ℃；毛细管温度：380 ℃；正、负离子电压均为3 500 V；鞘气压力：45 psi；辅助气流速：15 arb；鞘气和辅助气均为氮气。

1.5.3.4 质控样本

试验以2组伊犁鹅盲肠内容物样品提取物充分混合制备质控样本。采用相同的方法处理和检测制备好的质控样本。

1.5.3.5 代谢通路富集分析

使用KEGG数据库，获取差异代谢物的ID；结合数据库的通路分析和通路富集功能，鉴别出对照组与复合酶制剂组伊犁鹅盲肠内容物中表现出来的显著差异代谢物质和代谢通路。

1.6 数据统计与分析

采用Compound Discover软件对原始数据进行峰检测和峰匹配。每个样本的总峰面积归一化至10 000。采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)方法对样品进行模式识别分析。潜在标志物根据变异权重参数值[变量重要性投影(VIP)>1，P < 0.05]进行筛选和判别分析。生产性能和血清生化指标等数据采用Excel 2010进行整理后，采用SPSS 20.0软件进行单因子方差分析(one-way ANOVA)分析，试验结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。

2 结果 2.1 复合酶制剂对伊犁鹅生产性能的影响

由表 3可知，与对照组相比，试验Ⅱ组的产蛋率提高25.78%(P < 0.05)，试验Ⅱ组的料蛋比降低21.72%(P < 0.05)，其他指标各组间均差异不显著(P>0.05)。

2.2 复合酶制剂对伊犁鹅血清生化指标的影响

由表 4可知，与对照组相比，试验Ⅱ组的血清TP和GLB含量分别提高21.51%(P < 0.05)和30.61%(P < 0.05)；与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组的血清GLB含量提高23.66%(P < 0.05)。与对照组相比，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组的血清AST活性分别提高69.85%(P < 0.05)、41.26%(P < 0.05)和49.02%(P < 0.05)，ALT活性分别提高34.78%(P < 0.05)、33.78%(P < 0.05)和40.80%(P < 0.05)；与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组的血清AST活性显著降低16.84%(P < 0.05)。与对照组相比，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组的血清Glu含量分别提高55.61%(P < 0.01)、55.81%(P < 0.01)和38.02%(P < 0.01)，试验Ⅱ组的血清TC含量显著降低15.97%(P < 0.05)，试验Ⅱ、Ⅲ组的血清LDL含量分别降低37.66%(P < 0.05)和37.01%(P < 0.05)；与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ、Ⅲ组的血清LDL含量分别降低28.36%(P < 0.05)和27.61%(P < 0.05)。其他指标各组间均差异不显著(P>0.05)。

2.3 LC-MS分析 2.3.1 对伊犁鹅盲肠内容物代谢物组分的OPLS-DA

为了消除与分类不相关的噪声信息，同时也为了获得各组之间更加可靠的显著差异代谢物信息，本试验采用正交偏最小二乘(OPLS)分析过滤与模型分类不相关信号即正交信号，获得OPLS模型，其中R_X²表示模型对X变量的累积解释率；R_Y²表示模型对Y变量的累积解释率；Q²表示累积主成分后模型的预测能力。正模式下得到6个主成分，R_X²=0.586，R_Y²=0.998，Q²=0.392；负模式下得到7个主成分，R_X²=0.636，R_Y²=1.000，Q²=0.480。由图 1、图 2可知，OPLS模型拟合较好，可以将复合酶制剂组与对照组的代谢物区分开。

如图 3、图 4所示，置换检验通过随机改变分类变量Y的所属类别，100次随机改变后，建立对应数据的OPLS-DA模型以获取模型的R²和Q²值。置换检验的方法在评估模型是否过拟合以及模型的统计显著性上具有重要作用。本试验中，正模式下R²=0.998；负模式下R²=1.000，R²均接近1，说明建立的模型符合样本数据的真实情况，正模式下Q²=0.392；负模式下Q²=0.480，Q²均接近0.500，说明模型有较好的预测能力，有新样本加入模型，会得到近似的值。随着变量Y被置换的比例加大，对应模型的R²和Q²逐渐下降，证明原模型不存在过拟合现象，模型稳定性良好。

2.3.2 复合酶制剂对伊犁鹅盲肠内容物差异代谢物的影响

在盲肠内容物代谢组方面，对照组和复合酶制剂组共检测到5 530种代谢物，筛选出21种差异代谢物。表 5、表 6分别为正模式和负模式下对照组与复合酶制剂组之间伊犁鹅肠道内容物的差异代谢物。在正模式下，与对照组相比，复合酶制剂组相对含量显著增加(P < 0.05)的物质有N-乙酰基-L-瓜氨酸、3, 4-二羟基苯乙二醇、2, 5-二羟基吡啶、1-甲基吡咯啉、焦脱镁叶绿酸、泛酸、香叶基对苯二酚和(-)-异阿哌酮，相对含量显著减少(P < 0.05)的物质有肌酐、胆碱、(R)-乳酸。在负模式下，与对照组相比，复合酶制剂组相对含量显著增加(P < 0.05)的物质有L-瓜氨酸、孕烯醇酮硫酸盐、焦脱镁叶绿酸、2-(7′-甲硫基)庚基苹果酸盐和2-(4′-甲基硫基)丙二酸丁酯，相对含量显著减少(P < 0.05)的物质有N₂-(D-1羧乙基)-L-赖氨酸、5-甲氧基吲哚乙酸酯、(R)-乳酸、(R)-3-羟基丁酸、谷胱甘肽亚精胺、3′-羟基-香叶酰基对苯二酚和(-)-马凯因。

3 讨论 3.1 复合酶制剂对伊犁鹅生产性能的影响

我国家禽的饲粮主要为玉米-豆粕型，玉米是主要的能源来源，占饲粮组成的60%左右，豆粕是主要的蛋白质来源，占饲料蛋白质的75%^[6]。玉米和豆粕中含有大量的非淀粉多糖(NSP)，NSP具有抗营养作用，可使食糜的黏度升高，内源酶活性降低，改变肠道菌群结构，形成物理屏障而降低饲粮消化率等^[7]。冯宇航等^[8]在蛋鸡饲粮中添加200 g/t的复合酶制剂(主要成分为β-葡聚糖酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶)，结果表明，复合酶制剂显著提高蛋鸡产蛋率，极显著降低料蛋比，平均蛋重有增加的趋势。海存秀等^[9]在蛋鸡饲粮中添加0.1%的复合酶制剂(主要成分为酸性蛋白酶、木聚糖酶、果胶酶)可以使产蛋率显著提高，料蛋比显著降低。本试验结果表明，饲粮中添加0.3 g/kg的复合酶制剂可显著提高产蛋期伊犁鹅的产蛋率，显著降低料蛋比，与上述冯宇航等^[8]、海存秀等^[9]的研究结果基本一致，可能的原因是：在产蛋期伊犁鹅饲粮中添加复合酶制剂，可去除玉米-豆粕型饲粮中的NSP，释放更多的营养物质，降低肠道内食糜的黏度，维持肠道健康，从而提高动物的生产性能。

3.2 复合酶制剂对伊犁鹅血清生化指标的影响

血清TP和ALB含量共同反映动物体内蛋白质的代谢情况，二者含量的升高表明机体代谢活动旺盛。GLB能够参与血液凝固，并与机体免疫有关^[10]。于翔宇等^[2]在蛋鸡饲粮中添加0.3 g/kg的复合酶制剂(主要成分为木聚糖酶、纤维素酶和葡萄糖氧化酶)，与对照组相比，血清GLB和TP含量分别极显著升高37.45%和19.22%。本试验中，在产蛋期伊犁鹅饲粮中添加0.3 g/kg的复合酶制剂可以显著提高血清TP和GLB的含量，与于翔宇等^[2]的研究结果一致，可能的原因是：复合酶制剂促进了伊犁鹅对饲粮中营养物质的消化吸收，从而增加了蛋白质在伊犁鹅体内的沉积。血清中UA的含量可间接反映禽类对蛋白质和氨基酸物质的利用情况^[11]，其含量升高，则机体排出的氮量升高，从而影响机体氮的沉积^[12]。刘伟等^[13]在肉仔鸡饲粮中添加复合酶制剂(300 mg/kg低温淀粉酶、500 mg/kg固态发酵的天然复合酶和100 mg/kg植酸酶)，结果显示，试验全期血清中UA含量与对照组差异不显著。本试验中，饲粮中添加不同水平的复合酶制剂对伊犁鹅血清UA含量均无显著影响，说明动物机体内的蛋白质被充分利用，与产蛋率的提高相一致，未造成浪费现象。ALT和AST是动物体内分布最广的2种酶，这2种酶活性的提高有利于动物体内氨基酸的合成，提高蛋白质的代谢率^[14]。崔广林等^[15]在肉鸡饲粮中添加0.1%的纤维素酶(主要成分为木聚糖酶、β-葡萄糖酶、纤维素酶和甘露聚糖酶等)，可以显著提高肉鸡血清中ALT和AST的活性。在本试验中，在产蛋期伊犁鹅饲粮中添加不同水平的复合酶制剂均能显著提高血清中ALT和AST的活性，提示添加复合酶制剂提高了伊犁鹅的蛋白质合成能力，有利于氮在伊犁鹅体内的蓄积。

血糖是动物机体主要能量来源，可参与机体的各种代谢^[16]。刘长忠等^[17]在雏鹅饲粮中添加0.2% NSP酶，结果发现，NSP酶能显著提高血清Glu含量，与本试验中添加0.2、0.3和0.4 g/kg复合酶制剂均能极显著提高伊犁鹅血清Glu含量的结果一致，说明复合酶制剂加快了动物体内营养物质的分解代谢，生成的小分子糖类物质进入血液，从而提高了血液中的Glu含量，为机体提供更多能量。血清中TG、TC、HDL和LDL含量是综合反映动物体内脂肪代谢水平的指标。TC含量降低，家禽脂代谢水平加强，反之减弱^[18]。血清中携带胆固醇的主要是LDL，LDL会使脂肪沉积于血管壁上，形成粥状硬化，造成血管壁伤害，对机体产生不利影响^[19]；HDL能将血管中的胆固醇运回肝脏，促进胆固醇代谢，HDL含量越高，表明机体自身清除胆固醇的能力越强^[20]。盛东峰等^[21]在扬州鹅饲粮中分别添加250、500和1 000 mg/kg的壳聚糖，结果显示，与对照组相比，各添加组扬州鹅血清TC和LDL含量均显著降低，血清TG和HDL含量均差异不显著。这与本试验中添加0.3 g/kg复合酶制剂后血清TC和LDL含量显著降低，血清TG和HDL含量差异不显著的结果一致，可能是因为复合酶制剂中的纤维素酶通过分解饲粮中的纤维素，降低了肠道内容物的黏滞性，从而促进内源性脂肪酶对脂类的分解，降低了动物机体内胆固醇的含量^[22-23]。

3.3 复合酶制剂对伊犁鹅含氮小分子代谢的影响

氨基酸是构成蛋白质的基本组分，也是生命活动中的一类重要物质，对动物体生长、维持和健康等重要代谢通路起着调控作用^[24]，在体内通过一系列生化代谢途径转化为糖类或者脂类，并合成多种重要的生物活性物质，如激素、酶、核酸、多胺及神经递质等。正常机体内游离氨基酸水平是相对稳定的，体内不能合成的必需氨基酸主要从食物摄入，而非必需氨基酸可以通过自身合成或由其他氨基酸转化而来^[25]。本研究结果表明，在伊犁鹅饲粮中添加复合酶制剂后，在盲肠内容物中有5种氨基酸代谢物的相对含量发生显著变化，分别为乙酰-L-瓜氨酸、L-瓜氨酸、N₂-(D-1羧乙基)-L-赖氨酸、5-甲氧基吲哚乙酸酯和胆碱。

精氨酸是生物蛋白质合成的一种必需氨基酸，其对动物的能量代谢、氨基酸代谢与微生物代谢调控发挥着重要作用。Najib等^[26]研究发现，将饲粮精氨酸含量提高到1.5%，可以显著提高蛋鸡的产蛋性能和饲料转化率。乙酰-L-瓜氨酸和L-瓜氨酸是合成精氨酸所必需的前体物质。在本研究中，复合酶制剂组中乙酰-L-瓜氨酸和L-瓜氨酸的相对含量均较对照组显著增加，为精氨酸的合成提供了物质基础，从而促进了机体蛋白质的合成。赖氨酸是家禽的第二限制性氨基酸^[27]，大量研究表明赖氨酸对家禽的产蛋率有显著的促进作用^[28-29]。N₂-(D-1羧乙基)-L-赖氨酸是L-赖氨酸的分解产物。本研究显示，复合酶制剂组中N₂-(D-1羧乙基)-L-赖氨酸的相对含量较对照组显著降低，可能是赖氨酸的降解效率降低所致。色氨酸是家禽的第三限制性氨基酸，色氨酸不仅是组成蛋白质的氨基酸之一，而且调节蛋白质的合成^[30]，因此色氨酸的含量直接影响家禽蛋白质合成的速率^[31]。色氨酸分解生成5-甲氧基吲哚乙酸酯。本试验中，复合酶制剂组中5-甲氧基吲哚乙酸酯的相对含量较对照组显著降低，可能是色氨酸的降解速率减慢所致。饲粮中添加复合酶制剂后盲肠内容物中乙酰-L-瓜氨酸、L-瓜氨酸、N₂-(D-1羧乙基)-L-赖氨酸和5-甲氧基吲哚乙酸酯等差异代谢物的相对含量的显著变化，反映伊犁鹅机体内蛋白质的合成代谢水平升高，与血清中TP含量显著升高的结果相呼应。

丝氨酸是家禽的非必需氨基酸，在机体内有助于抗体的形成，对于维持动物机体免疫系统的稳定性具有重要意义^[32]。胆碱参与了丝氨酸代谢通路。本试验中，复合酶制剂组的胆碱的相对含量较对照组显著下降，可能是丝氨酸的分解效率降低所致，推测复合酶制剂对维持伊犁鹅机体免疫系统的稳定性具有促进作用。

3.4 复合酶制剂对伊犁鹅碳水化合物代谢的影响

盲肠中的细菌可以将碳水化合物和蛋白质降解成短链脂肪酸(包括甲酸、乙酸、丙酸和丁酸)，这些短链脂肪酸在盲肠被吸收，增加了肠道内渗透压，加速了食糜的蠕动，促进盲肠对营养物质的吸收，从而提高生产性能^[33]。丁酸在机体内通过反应生成酮体，并产生ATP为肠道黏膜提供能量，提高肠道对营养物质的消化吸收^[34]。Sikandar等^[35]研究发现，饲粮中添加1 000 mg/kg丁酸钠能显著提高肉鸡的生长性能。(R)-3-羟基丁酸是丁酸的分解产物。本研究中，复合酶制剂组的(R)-3-羟基丁酸的相对含量较对照组显著降低，原因可能是丁酸分解能力降低，丁酸的相对含量增加，从而为机体肠道提供更多的能量，促进肠道营养物质的消化吸收效率。

丙酮酸是能量代谢的重要物质，丙酮酸在糖酵解代谢过程中可以分解为乳酸，也可通过糖异生途径生成Glu，为机体提供能量。本研究结果表明，与对照组相比，复合酶制剂组伊犁鹅乳酸的相对含量显著减少，这表明复合酶制剂的添加使得伊犁鹅能量代谢发生改变，并促进了糖异生^[36]，与本试验中该组血清Glu含量极显著升高的结果相互印证，可产生更多的能量为机体供能，从而提高生产性能。

3.5 复合酶制剂对伊犁鹅脂质代谢的影响

胆固醇是动物体内一类重要的脂类，通过生物转变发挥着重要的生理功能。胆固醇不仅是细胞膜的组成成分，还是动物合成胆汁酸、类固醇激素和维生素D₃等生理活性物质的前体^[37]。但是，胆固醇含量过高会引起动物机体肝脏脂质代谢发生紊乱。在本研究中，复合酶制剂组中孕烯醇酮硫酸盐的相对含量较对照组显著增加，而孕烯醇酮硫酸盐是胆固醇的分解产物之一，表明机体内的胆固醇分解效率提高，这与本试验中该组血清TG含量显著降低的结果相吻合。

3.6 复合酶制剂对伊犁鹅其他代谢物的影响

谷胱甘肽可减少巯基被氧化而导致的酶失活，并可与体内自由基结合，加速其向酸类物质的还原过程，减轻自由基对机体重要脏器的损伤，因此，谷胱甘肽分解代谢减弱对维持机体健康有着积极作用^[38]。Xiong等^[39]采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)代谢组学技术研究发现，多酚能够通过增强肉仔鸡的谷胱甘肽过氧化物酶活性来缓解热应激状况。谷胱甘肽的分解产物是谷胱甘肽亚精胺，在本试验中，复合酶制剂组中谷胱甘肽亚精胺的相对含量较对照组显著下调，说明在饲粮中添加复合酶制剂使得谷胱甘肽的分解速率降低，从而对维持伊犁鹅机体健康起到积极作用。本试验中发现的一些差异代谢物还参与了烟酸与烟酰胺代谢、卟啉和叶绿素代谢、异黄酮生物合成、泛醌和其他萜类化合物生物合成、泛酸和辅酶A生物合成和硫代葡萄糖苷生物合成等代谢通路，以上这些代谢通路的具体作用未见相关报道，具体机理有待进一步研究。

4 结论

本试验条件下，在饲粮中添加0.3 g/kg复合酶制剂可显著提高产蛋期伊犁鹅的产蛋率，显著降低料蛋比，极显著提高血清Glu的含量，显著提高血清TP、GLB的含量及ALT、AST的活性，显著降低血清TP和LDL的含量，并可引起盲肠内容物中21种代谢物的相对含量发生显著变化，增强了伊犁鹅肠道的代谢活动，主要表现为增加能量、促进氨基酸代谢以及脂质利用，从而提高了营养物质利用率，改善了伊犁鹅的生产性能。