动物的肠道除了维持营养物质的消化吸收功能,同时也是机体的一道重要的免疫防线[1]。肠道内腔中黏膜组织形态结构的完整性及其上附着的微生态多样性是维持机体健康的有效屏障,能阻止肠道内细菌和毒素进入血液,家禽的肠道屏障主要包括机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障,各屏障之间相互作用,共同维护肠道健康(intestinal health)[2]。公元前460—370年,西方医学之父Hippocrates曾提出“所有疾病始于肠道”的论述,表明肠道健康对机体的重要性。目前,已证实肠道功能出现紊乱与多种疾病的发生有关,如炎症性肠病(IBD)[包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)]、糖尿病(DM)、癌症、肥胖等,甚至与自闭症(AD)和抑郁症等精神类疾病有关[3]。对于畜禽生产而言,健康的肠道对维持家禽的生长和可持续生产至关重要,健康的肠道可以提高养分消化率,减少营养物质的排泄,改善家禽的生产效率,减轻生产中有害气体对家禽和环境的影响。
目前,对于肠道健康还没有一个准确的定义,肠道健康取决于宿主(免疫、黏膜屏障)、营养、微生物和环境因素。肠道健康的丧失与肠道微生物群组成的变化、黏膜屏障功能和肠道感染有关[4]。尤其各国在养殖业中陆续禁抗后,如何维护肠道健康已经成为家禽营养研究的热点,特别是在集约化家禽养殖中。因此,需要对家禽肠道健康状况进行持续监测,尤其是高效的家禽生产中肠道负荷经常被推到极限,肠道健康容易出现紊乱,继而引发一系列的炎症。本文对近年来人和畜禽肠道健康研究中相关的生物标志物(biomarkers)进行了综述,同时对不同肠道疾病模型相关标志物的来源和样本类型进行了分类总结,旨在此类生物标志物在目前和未来能用于畜禽的安全健康养殖,监测家禽肠道健康并做好有效的防控措施。
1 肠道健康的生物标志物概述生物标志物被定义为肠道在健康或非健康状况下检测可变化的相关生物物质[5],生物标志物应具有可靠性、特异性和敏感性,能够准确地反映肠道的健康状态,比较理想的生物标志物是稳定的分子,最终进入排泄物中,可以定量,且最好使用快速和简单的笔端定性或定量检测[6]。生物标志物的检测不仅有助于对肠道发病机理的研究,也有助于监测肠道的健康,减少对治疗性抗生素的需求。目前,肠道健康生物标志物主要在人类肠道健康方面的报道较多,对于畜禽肠道健康的生物标志物的研究报道较少,而且用单一的生物标志物很难准确评价肠道的健康状况。对于动物肠道健康的研究,主要集中在多种生物标志物(multiple biomarkers)、DNA宏条形码(metabarcoding)、宏基因组(metagenomic)、宏转录组(metatranscriptomic)、宏蛋白质组(metaproteomic)和代谢组学(metabolomic approaches)等方向[4],尤其是多组学技术结合将是未来的发展方向。近年来,很多研究人员着手研究家禽候选生物标志物,但由于家禽肠道的复杂性,生物标志物的验证将是一个重大挑战。
在众多的动物生理、病理研究中,畜禽生产常采取传统的损伤性取样(invasive sampling,IS),通过手术或处死动物等方式采集机体组织样本或微创的方式获得的血液样本,优势是样本信息能准确反映组织、器官的健康状况。而在人类和野生动物研究中常以非损伤取样(non-invasive sampling,NIS)的方式为主,即在不处死、不捕获、不触及动物的情况下,收集不同形式的样品,包括毛发、粪便、尿液、羽毛、口腔脱落细胞的食物残渣等[7]。非损伤性取样的样本中遗传信息和微生物多样性的检测在物种鉴别、功能作用、免疫反应等方面有一定的参考价值,并得到了广泛的应用。考虑到养殖动物福利和采样的便捷性,在畜禽生产中同样可以选取一系列非损伤性取样的样本相关生物标志物来衡量畜禽的肠道健康。
2 家禽肠道健康潜在的生物标志物 2.1 损伤性取样的生物标志物 2.1.1 肠道组织及细胞标志物肠道上皮细胞的完整性是肠道健康的重要保障,肠道组织的隐窝干细胞池可以不断形成新的单层上皮细胞,新细胞迁移到绒毛上,并分化成具有吸收营养物质功能的成熟上皮细胞,再从肠绒毛顶端脱落完成更新过程[8]。而肠道病原微生物会使绒毛上皮细胞死亡或增殖减少,导致绒毛高度(VH)减小和隐窝深度(CD)增加,这是家禽肠道绒毛损伤常见的问题[9]。因此,绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度/隐窝深度(V/C)已成为评价动物肠道组织健康的黄金标准。在以右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的肠炎雏鸡模型中,肠绒毛变短、上皮细胞高度降低,上皮细胞紧密连接(TJ)损伤,肠屏障通透性(IP)增加[10-11]。除吸收性上皮细胞外,饲粮中添加酶解小麦提取物可使鸡回肠黏膜中分泌细胞L细胞的密度增加,肠壁固有层增厚,肠道固有层黏膜中T淋巴细胞的数量与绒毛长度呈正相关[12]。健康的固有肠黏膜细胞中含有大量的叉头状转录因子3(FoxP3)耐受性阳性调节性T淋巴细胞(Treg),而现已证实,人类炎症性肠道疾病存在显著的Treg缺陷[13]。同样在肠通透性缺陷的鸡模型中,固有层中的中性粒细胞的增殖也受到了抑制[14]。因此,通过监测家禽肠壁上皮组织或相关细胞可以直接衡量肠道健康状态。
此外,肠黏膜中的一些蛋白质也可作为有用的生物标志物。肠上皮细胞质膜中参与被动扩散的ATP结合转运蛋白泵(MDR)可阻止潜在的有害小分子从肠腔扩散进入细胞,而MDR可在家禽等动物肠道中表达[15],在人肠道炎症中也发现肠上皮细胞MDR1的表达下降[16]。肠上皮细胞上还有一层致密的黏液层,由肠杯状细胞不断分泌更新的广泛糖基化黏蛋白-2(MUC-2)构成,形成上皮细胞黏膜屏障。通过喂食高脂高能饲粮的小鼠,表现为结肠黏液层生长速率显著变慢,渗透性增加[17]。肠屏障衰竭的肉鸡模型中,肠黏膜中的白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-1β(IL-1β)、转化生长因子-β4(TGF-β4)和脂肪酸结合蛋白-6(FABP-6)mRNA表达水平显著增加,而闭合蛋白和MUC-2 mRNA表达水平显著下降[5]。其中,肠道脂肪酸结合蛋白(I-FABP)是一种分子质量为1.5 ku的蛋白质,家禽的I-FABP基因仅在肠组织中表达[18],可以通过定量检测肠黏膜蛋白间接反映肠壁细胞的功能是否正常。
2.1.2 内脏组织及血液标志物肠道黏膜屏障被破坏时,一些大分子物质或致病微生物可通过受损的上皮细胞紧密连接进入血液或到达肝脏,引起急性期反应,使肝细胞分泌的蛋白质和血液中的某些物质发生变化,如人类IBD表现为血清中由肝脏分泌的C-反应蛋白和脂多糖结合蛋白(LBP)含量显著增加[19]。通过线粒体ATP缺失的氧化应激诱导的肠炎症中,单层上皮细胞(CACO-2)紧密连接的稳定性受到破坏后,肉鸡血清中连接蛋白-2(claudin-2)和连接蛋白-7(claudin-7)的表达减少[20]。α1抗胰蛋白酶(α1AT)是肝脏分泌到血清中的一种丰富的胰蛋白酶抑制剂,在患有球虫病的肉鸡中发现,其血清中α1AT含量显著升高[21]。同样在含有高非淀粉多糖饲粮和球虫病肉鸡的研究中,血清中内毒素(ET)、α1-酸性糖蛋白(α1-AGP)含量增加,血浆中细胞紧密连接蛋白(TJP)含量明显升高,革兰氏阴性菌产生的脂多糖(LPS)也可通过细胞旁路径泄漏进入血液[22]。D-乳酸是肠道细菌产生的代谢产物之一,D-乳酸可在肠道屏障通透性增加的动物和人类的血清中检测出来,目前已将D-乳酸作为家禽肠道通透性增加的一个生物标志物[23-24]。在猪上的研究表明,血浆中二胺氧化酶(DAO)活性与仔猪腹泻和肠型I-FABP表达水平显著相关,当仔猪肠道受损,腹泻率增加,血浆DAO活性和I-FABP含量显著提高[25]。通过对血液中这些蛋白质和大分子物质的监测可反映肠道机械屏障的完整性和受损程度。此外,禽肠炎引起的致病菌移位到达血液和肝脏引起其他炎症,所以肝脏中的病原菌计数也可用作家禽肠屏障泄漏的生物标志物。
利用外源性标志物也是目前检测肠道健康的一种有效手段,用荧光素异硫氰酸酯葡聚糖(FITC-D,3~5 ku)、乳果糖(L,342 u)、甘露醇糖(M,182 u)和鼠李糖(R,164 u)等作为外源性肠屏障渗透性标志物。研究表明,在肠屏障损伤的雏鸡模型中,喂食的FITC-D可穿过肠上皮紧密连接到达血液,使血清中FITC-D含量升高[11, 22],FITC-D被用于监测低聚纤维素和益生菌对肉鸡IP的影响[26-27]。高分子量的乳果糖可穿过受损的TJP,而甘露醇糖和鼠李糖可直接通过肠细胞吸收进入血液中,同样在家禽肠屏障缺陷的研究发现,与对照组相比,禁食后血清中FITC-D含量显著升高,空腹血浆中乳果糖/甘露醇糖和乳果糖/鼠李糖比值、DSS处理后乳果糖/甘露醇糖比值均较对照组显著升高[11]。因此,食物添加外源性FITC-D、乳果糖、甘露醇糖和鼠李糖后,通过检测其在血清中的含量可反映家禽肠道黏膜屏障的健康状况。
2.2 非损伤性取样的生物标志物 2.2.1 粪便微生物标志物随着新一代测序技术的发展,粪便中的微生物将成为研究肠道健康的重要手段。尽管动物粪便中微生物种类和数量与肠道中存在一定差异,但在人类上已经证实并确定了与IBD相关的粪便微生物群模式[28-29]。家禽消化道较短,盲肠中微生物的多样性丰度较高,研究表明其粪便和盲肠中微生物的组成高度相似,因此,可以将家禽粪便微生物群用作肠道微生物群的替代物。家禽肠道和粪便微生物受个体、年龄、饲料等因素的影响,在门水平上,以厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和梭杆菌门为主要组分。相关研究表明,成熟蛋鸡肠道比小母鸡有更多厚壁菌门和拟杆菌门,放养母鸡比笼养母鸡有着更丰富的放线菌门和拟杆菌门,且从母鸡肠道中提取的乳酸菌对幼仔鸡生长和空肠绒毛生长有促进作用[30]。同样在人类克罗恩病的研究中,肠道微生物多样性和厚壁菌门丰度明显较低[29]。在肉鸡肠道菌属水平上,不同肠段中发现乳酸杆菌属、肠球菌属、拟杆菌属、棒状杆菌属为优势菌属,而盲肠中的菌群多样性和细菌功能变化最明显,其微生物群在结构组成上与粪便相似[31]。因此,常使用粪便作为动物肠道中微生物的参考。同样在粪菌移植的新生仔猪中,结肠中厚壁菌门、普雷沃氏菌科等的丰度增加,变形菌门、梭杆菌科等的丰度减少,腹泻发生率降低,肠道形态及紧密连接屏障得到改善,肠道黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)细胞密度增加,杯状细胞数量增加,MUC-2、β-防御素2、Toll样受体(TLR)2/4的表达增加[32]。
在属水平上,产丁酸盐的厚壁菌门中,罗氏菌属人型支原体、梭菌属和丁酸球菌属的丰度在溃疡性结肠炎的人肠道中明显减少[33],在添加益生菌的研究中,肉鸡肠道丁酸球菌属可维持肠道黏膜结构的稳态,是肠道黏膜健康的重要微生物标志物之一[34]。还有一些致病菌如产气荚膜梭菌,可使肉鸡肠道组织病变,绒毛高度下降,而添加了精氨酸后可改善肠道组织病变和微生物多样性[35]。肠道炎症还与兼性厌氧菌的增加密切相关,变形菌门微生物丰度的增加是肠道微生态失调的诊断标志,其中肠杆菌属(Enterobacteriaceae)以及硫酸盐还原脱硫弧菌属(Desulfovibrio)是潜在的硫酸盐还原菌,它们大量增长可产生高浓度硫化氢,被认为是人类IBD的标志物[30],肠杆菌属的大量繁殖与家禽肠道健康呈显著的负相关。在沙门氏菌感染的小鸡肠道内,细菌的毒力因子可增加上皮氧合作用,促进致病菌进行有氧呼吸,导致其扩张和定殖;而益生菌可通过肠腔内的氧气竞争来防止沙门氏菌的定植,使盲肠中的沙门氏菌减少、干扰素-γ(IFN-γ)和LPS诱导的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量降低[36-37]。可用定量PCR(q-PCR)或其他方法对肠杆菌科定量测量来评估家禽的肠道微生态失调。目前,在家禽上用粪便微生物作为肠道健康标志物的研究比较少,主要集中在盲肠和回肠微生物的多样性研究,随着人们对家禽福利的关注以及后抗生素时代家禽肠道健康实时监测,采用粪便非损伤性取样具有很多优势,如取样方便、不需处死动物等。未来应该加强家禽粪便微生物与家禽肠道健康的生物标志物研究,筛选出适合于粪便检测的生物标志物。
2.2.2 微生物代谢的生物标志物在消化道末端,微生物可将非淀粉多糖等纤维发酵产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸(SCFA),众多研究也证实了SCFA对宿主健康的有益作用,尤其是丁酸和丙酸对宿主动物的健康调控作用。尽管粪便中丁酸盐和丙酸盐的浓度与肠道内容物的浓度可能是肠道健康有价值的生物标志物。然而,由于丁酸和丙酸通过肠上皮吸收是受体介导,其肠腔内的浓度取决于微生物合成和黏膜吸收之间的平衡。在一项肉鸡的研究中,已证明该类生物标志物与改善肠道健康有关[38]。在肠道免疫功能方面,肠道菌群通过代谢产物在上皮细胞或树突细胞介导下直接或间接与CD4+ T细胞互作,影响其分化为辅助性T细胞(Th)1、Th17、Treg、Th2、恒定自然杀伤T细胞(iNKT)等细胞,从而影响自身免疫疾病及炎症性反应[39]。SCFA可通过激活肠巨噬细胞和树突状细胞(DCs)上的G蛋白偶联受体(GPR)109A促进FoxP3+CD4+Treg分化,其中DCs表达白细胞介素-10(IL-10)[40],丁酸盐能够通过抑制肠巨噬细胞和DCs中的去乙酰化酶(HDACs)来下调促炎性因子的表达[41]。Treg可通过抑制Th2和Ⅱ型固有淋巴细胞(ILC2)为定殖在肠道中的特定细菌制造生存空间;它们之间代谢功能的交互作用促进宿主肠上皮细胞获取能量[42]。SCFA也可以通过抑制B细胞的新陈代谢来抑制淋巴细胞Th17的反应,从而增加免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白A(IgA)的生成调节稳态和病原体特异性免疫反应[43]。因此,可以通过q-PCR量化丁酸盐产生途径中的关键酶(丁酰辅酶A和乙酸辅酶A转移酶)来评估微生物代谢产生丁酸盐的能力[44]。还有一类益生菌代谢产物,如罗伊氏乳杆菌产生的色氨酸TRA通过调控芳基烃受体(AHR)转录因子活性减轻炎症和自身免疫性疾病,如罗伊氏乳杆菌产生的吲哚-3-乙酸(IAA)可激活宿主CD4+上皮内T淋巴细(DPIELs)分化为免疫调节T细胞[45]。罗伊氏乳杆菌产生的IAA和色氨酸TRA可降低炎症因子如TNF-α、IL-1β和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的生成,而吲哚3醛(I3A)可介导白细胞介素-22(IL-22)的表达,调节巨噬细胞和T细胞的扩张,从而降低机体的炎症反应[46]。
此外,高蛋白质和低碳水化合物会改变动物肠道菌群结构,使得潜在的致病性微生物增加,微生物代谢蛋白质和肽产生的一系列代谢产物,如酸、胺、硫醇、吲哚、酚、支链脂肪酸、硫化氢和氨等,这些代谢物会损害家禽肠道黏膜及上皮细胞[47]。在肠杆菌科扩增的小鼠肠炎模型中,肠道中甲酸含量显著升高,炎症引起的氧自由基与肠腔中的硫化物反应形成的四硫酸盐又能促进沙门氏菌和弯曲杆菌的扩增[48-49],粪便蛋白质衍生物(硫化氢、氨)及其他挥发性化合物(氢、二氧化碳、甲烷)的测定已作为人类肠道健康常用的生物标志物[50],这些代谢物的定量测定可以反映微生物群组成的变化,而且有害的气体代谢物又可以通过呼吸作用损伤家禽的呼吸组织和器官,甚至引起中毒。
2.2.3 粪便微小RNA(microRNA,miRNA)肠上皮细胞分泌的miRNA是一类数量丰富的小分子非编码RNA,通过调节目标基因的表达而影响宿主免疫系统和肠道微生物的炎症反应[51]。miRNA相对于菌群组成可以更好地反映肠道的健康程度。研究表明,IBD患者结肠黏膜中的miR-200家族表达升高,CD患者十二指肠中的miR-146、miR-155、miR-122表达升高,miRNA可调节UC患者体内Treg产生细胞因子、TJP、黏附连接蛋白等维持肠道屏障,IBD患者体内差异表达的部分miRNA可调节上述蛋白质[52]。肠腔中的miRNA可聚集在粪便中,而粪便中的miRNA也受到肠道微生物群组成的差异性和特异性的影响,因此,可以通过粪便中miRNA的变化调节膳食或药物治疗肠道炎症。粪便中的miRNA可以作为人IBD和结肠炎新兴的生物标志物。在无菌小鼠中移植了敲除IL-10和TLR5的菌群的研究中,粪便中miRNA能反映肠道中微生物群特定功能的相关变化,更好地反映肠道菌群的健康程度[53]。同样在沙门氏菌感染的雏鸡研究中,添加益生菌可降低IFN-γ含量及LPS诱导的TNF-α含量,鼠伤寒沙门氏菌和乳酸杆菌的存在显著影响14个miRNA的表达,这些miRNA主要通过调控依赖于蛋白激酶活性的环磷酸腺苷(cAMP)代谢通路及免疫相关的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和分泌糖蛋白(Wnt)等信号通路来影响宿主的肠道健康[37]。由于miRNA存在广泛性和多样性,目前已发现多种miRNA在动物肠道中发挥着调控作用,肠道菌群和宿主细胞的miRNA存在复杂的互作机制。目前对miRNA的研究还处于初级阶段,大多数miRNA的功能仍然是个谜。因此,用粪便miRNA作为家禽肠道健康生物标志物具有潜在的应用价值,今后应该加强家禽粪便miRNA生物标志物的研究及治疗肠道炎症的靶点。
2.3 其他潜在的肠道健康生物标志物除了已有的关于家禽或猪的肠道健康标志物以外,在人类肠道研究中也涉及很多分子标志物可以为家禽肠道健康研究提供参考。新蝶呤(NP)是一种嘌呤核苷酸,由T淋巴细胞产生的IFN-γ刺激巨噬细胞和树突状细胞活化后分泌,肠道内容物或粪便中NP也是肠道炎症的标志[54]。但肾脏排出的NP也会干扰肠道的炎症过程,需要进一步判断其来源。胰腺炎相关蛋白(PAP)是一种由革兰氏阳性和阴性菌诱导产生的C型凝集素,具有抗菌和抗炎的特性,最初被作为人类胰腺炎的标志物[55]。此外,人类肠易激综合征中,血浆中急性期蛋白(APP),如C反应蛋白(CRP)和结合珠蛋白(HP),也是常用的肠道炎症的标志物[39]。在肠炎患者的粪便中,还发现一整组不同的肠道炎症标志物,其中包括钙调蛋S100(CAM-S100)和钙卫蛋白(CALP)、乳铁蛋白(LF)、脂质运载蛋白2(LCN2)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)[56],多数这些蛋白质类似物也存在于猪体内,但是否都存在于家禽中还无相关报道。此外,近几年有相关研究将噬菌体作为健康或疾病的生物标志物,在诊断和治疗肠道菌群介导的生态失调方面具有非常大的应用价值[57]。
3 肠道健康标志物在家禽生产中的应用前景目前对家禽肠道健康标志物的研究较少,本文对可用于家禽肠道健康研究中可检测的生物标志物进行总结,并对各类标志物的来源和样本类型进行分类,见表 1。在人类医学中已筛选出较多的肠道生物标志物并广泛应用于临床治疗,尽管畜禽动物可以获得各类的体内组织样本,但由于物种的差异,很多标志物参数不一定适用于所有动物,如猪和家禽在同源性、基因功能等方面也存在较大的差异,目前现有的免疫检测的试剂具有一定的特异性,如猪的PAP为胰岛衍生蛋白(Reg)3α亚型,对现有的其他哺乳动物的Reg3γ亚型抗体就缺乏交叉反应[58]。当然,单个标志物并不能准确地跟踪肠道健康及缺陷的所有方面,将多种标志物结合检测和评价,如用16S rRNA基因测序分析粪便中微生物群落的组成或全基因组测序的方法与粪便中代谢产物、功能蛋白质的检测进行关联分析,找到功能性代谢小分子对应的菌群或菌株,追踪肠道微生态失衡的关键靶点,对其进行有效的预防和控制。此类标志物可以快速用于家禽肠道健康状况的检测。长远来看,选用非损伤型生物标志物,将宏基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等方法与大数据分析相结合,将成为家禽生产和研究肠道健康的有力工具,可以持续监测肠道健康状况。
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表 1 家禽肠道健康的生物标志物 Table 1 Biomarkers for intestinal health in poultry |
维护家禽肠道健康已经成为家禽研究的热点之一,尤其是在禁抗后需要对集约化养殖家禽肠道健康状况进行持续监测。在传统的畜禽病理研究中,肠壁组织、黏膜蛋白以及血液指标等标志物是肠道健康损伤最可靠的证据,但是此类样品的采集、处理和分析技术比较复杂,且对于肠壁活检组织的检查标准需要进行不断完善和基准测试,例如绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度此类形态学参数只反映病理型上皮细胞死亡的情况,而不能反映上皮细胞的生理障碍和细胞旁路径渗漏的发生。畜牧业生产过程中肠道健康指标的检测成本也是畜禽肠道生物标志物的信息相对缺乏的重要因素。而一些理想的新型生物标志物可能比传统的组织学标志物更敏感和成熟,如跨膜大分子蛋白、LPS以及粪便中微生物群的种类、丰度及其代谢产物等一系列稳定的分子,目前可以快速量化检测,直接或间接反映肠道的健康程度。因此,对于畜禽对肠道健康的生物标志物的筛选和验证是一项艰巨的任务,尤其是在排泄物中,家禽的排泄物的成分不同,含有大量尿酸,这也会使某些检测复杂化。但随着基因组和蛋白质组信息的日益丰富,在大多数畜禽的基因组中寻找同源序列是一项相对容易的任务。无论同源蛋白质是否真的被表达,或者是否具有与生物标志物相同的功能和有效性,都可以被确定。无论选择何种肠道生物标志物,家禽的肠道健康研究和监测是健康有效生产的重要保障,因此,所有这些肠道健康标志物的检测技术和方法需要在今后的研究和生产中不断补充和验证,以便更好地了解家禽肠道功能在健康和疾病中的作用。
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