动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (5): 2066-2073    PDF    
枯草芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能和肠道形态、黏膜免疫及菌群数量的影响
邢帅兵1 , 陈代文1 , 余冰1 , 栾超2 , 何军1 , 黄志清1 , 毛湘冰1 , 郑萍1 , 罗钧秋1 , 罗玉衡1 , 虞洁1     
1. 四川农业大学动物营养研究所, 动物抗病营养教育部重点实验室, 动物抗病营养四川省重点实验室, 成都 611130;
2. 安迪苏生命科学制品(上海)有限公司, 上海 201200
摘要: 本试验旨在研究饲粮中添加枯草芽孢杆菌替代饲用抗生素对断奶仔猪生长性能和肠道健康的影响。试验选用21日龄杜长大(DLY)断奶仔猪72头,随机分为4组,分别为对照组(CON组)、抗生素组(ANT组)、抗生素+枯草芽孢杆菌组(ANT+BS组)、枯草芽孢杆菌组(BS组),每组6个重复,每个重复3头猪。试验期49 d。结果表明:1)试验全期,各组间平均日增重和平均日采食量均无显著差异(P>0.05),与CON组相比,仅ANT组的料重比显著降低(P < 0.05)。2)各组间十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度均无显著差异(P>0.05);与CON组相比,ANT组、ANT+BS组和BS组回肠的隐窝深度分别降低了10.16%、14.98%、18.10%,有差异显著的趋势(P=0.084)。3)与CON组相比,ANT+BS组和BS组盲肠中双歧杆菌的数量显著提高(P < 0.05),且与ANT组无显著差异(P>0.05)。4)与CON组相比,ANT+BS组和BS组空肠黏膜中分泌型免疫球蛋白A的含量显著提高(P < 0.05),但均显著低于ANT组(P < 0.05)。综上所述,枯草芽孢杆菌可以改善断奶仔猪小肠形态结构,增加肠道内有益菌的数量,提高小肠黏膜免疫功能,达到部分替代抗生素的效果,并且枯草芽孢杆菌与抗生素联用无协同或拮抗作用。
关键词: 枯草芽孢杆菌    断奶仔猪    生长性能    肠道形态    肠道菌群    肠道免疫    
Effects of Bacillus subtilis on Growth Performance, Intestinal Morphology, Mucosal Immune and Microflora Number of Weaned Piglets
XING Shuaibing1 , CHEN Daiwen1 , YU Bing1 , LUAN Chao2 , HE Jun1 , HUANG Zhiqing1 , MAO Xiangbing1 , ZHENG Ping1 , LUO Junqiu1 , LUO Yuheng1 , YU Jie1     
1. Key Laboratory of Animal Disease-Resistance and Nutrition of Ministry of Education, Key Laboratory of Animal Disease-Resistance and Nutrition of Sichuan Province, College of Institute of Animal Nutrition, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;
2. Adisseo Life Science(Shanghai) Co., Ltd., Shanghai 201200, China
Abstract: This experiment was conducted to investigate the effects of adding Bacillus subtilis to replace antibiotics on growth performance and intestinal health of weaned piglets. A total of 72 healthy 21-day-old DLY weaned piglets were randomly allotted 4 groups with 6 replicates per group and 3 piglets per replicate. The four groups were CON group, ANT group, ANT+BS group and BS group, respectively. The trial lasted for 49 days. The results showed as follows:1) there was no significantly difference in average daily gain (ADG) and average daily feed intake (ADFI) among groups (P>0.05); compared with the CON group, feed/gain (F/G) in ANT group was significantly decreased (P < 0.05). 2) There was no significantly difference in villous height, crypt depth and villous height/crypt depth (VH/CD) of duodenum, jejunum and ileum among groups (P>0.05); compared with the CON group, the crypt depth of ileum in ANT group, ANT+BS group and BS group decreased by 10.16%, 14.98% and 18.10%, and with a tendency for significant differences (P=0.084). 3) Compared with the CON group, the number of Bifidobacteria in cecum in ANT+BS group and BS group was significantly increased (P < 0.05), and there was no significantly difference compared with ANT group (P>0.05). 4) The secreted immunoglobulin A (SIgA) content in jejunum mucosa in ANT+BS group and BS group was significantly increased (P < 0.05), but was significantly lower than that in ANT group(P < 0.05). In summary, B. subtilis can improve the intestinal structure of weaned piglets, increase the number of beneficial bacteria in the intestinal tract, improve the immune function of intestinal mucosa, and achieve the effect of partial substitution of antibiotics, and there is no synergistic or antagonistic effect between B. subtilis and antibiotics.
Key words: B. subtilis    weaned piglets    growth performance    intestinal morphology    intestinal flora    intestinal immune    

断奶仔猪肠道发育不完善,当营养供应由液体母乳转变为适口性较差的固体饲粮时,容易发生断奶应激,进而导致采食量下降、肠道形态结构和功能受损、肠道屏障通透性增高、免疫功能下降、肠道微生态菌群紊乱、生长缓慢等不良后果[1-3]。为了追求更好的生产效益,饲粮中添加抗生素、高铜、高锌等用以增强动物机体抗病性,提高生长速度。但是诸如此类添加剂容易导致排泄物污染环境、动物机体残留、引发食品安全问题等[4-6]。“无抗饲料”是当下养殖行业的热门话题,因此,寻找安全、绿色的抗生素替代品受到了广泛的重视。研究发现,多种饲用添加剂如益生菌、益生元、酶制剂、有机酸、中链脂肪酸及脂肪酸酯、中草药制剂及植物提取物等均具有替代抗生素的潜能[7-8],在养殖行业中具有广阔的应用前景以及巨大的开发价值。枯草芽孢杆菌(B.subtilis,BS)作为芽孢杆菌属的一种,呈革兰氏阳性,具有耐高温、制粒稳定、过胃稳定等特点,不易受到胃肠道中各种酶的影响,能够有效地定植于肠道内,消耗肠道内游离氧,促进有益厌氧菌的生长,抑制有害菌的生长,同时还能分泌多种消化酶促进营养物质的消化吸收,激活体液免疫,提高免疫功能,改善动物机体健康[9-10],因此BS具有替代抗生素的巨大潜力。研究表明,在饲粮中适量添加枯草芽孢杆菌可以提高动物生长性能,改善肠道微生物生存环境,促进营养物质的消化吸收,提高动物机体免疫功能[11-12],同时也是一种无残留、无污染的新型饲料添加剂,具有良好的经济效益和社会效益。但是,枯草芽孢杆菌在断奶仔猪上的应用效果并不一致,且其是否具有替代抗生素的潜能仍需要进一步探讨。因此,本试验旨在研究枯草芽孢杆菌替代饲用抗生素对断奶仔猪生长性能和肠道健康的影响,为今后科学、合理地使用枯草芽孢杆菌提供试验数据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌制剂:枯草芽孢杆菌活菌数≥5.0×108 CFU/g,由某生命科学制品有限公司提供。抗生素:吉他霉素,有效成分含量为50%;金霉素:有效成分含量15%,均为市售产品。

1.2 试验动物与试验设计

试验选用21日龄杜长大(DLY)断奶仔猪72头,采用随机区组试验设计,按体重相近、性别比例相同原则随机分为4组,即对照组(CON组)、抗生素组(ANT组)、抗生素+枯草芽孢杆菌组(ANT+BS组)、枯草芽孢杆菌组(BS组),各组分别饲喂基础饲粮、基础饲粮+100 mg/kg吉他霉素(50%)+300 mg/kg金霉素(15%)、基础饲粮+50 mg/kg吉他霉素(50%)+150 mg/kg金霉素(15%)+20 mg/kg枯草芽孢杆菌、基础饲粮+20 mg/kg枯草芽孢杆菌,每组6个重复,每个重复3头猪。试验期49 d。

1.3 试验饲粮及饲养管理

基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮,参照NRC(2012)7~11 kg、11~25 kg阶段猪营养需要配制,基础饲粮组成及营养水平见表 1。本试验在四川农业大学动物营养研究所教学科研基地进行,圈舍温度控制在25~26 ℃,相对湿度控制在50%~80%,所有猪只自由采食和饮水,定时对圈舍进行打扫并交替使用消毒液进行消毒,保持圈舍通风和卫生。

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) 
1.4 样品的采集与处理

于试验第49天结算饲粮,所有猪只禁食12 h。试验第50天对所有试验仔猪进行称重并记录,每个重复内选取1头体重最接近该组平均体重的仔猪并标记,按顺序屠宰。采集十二指肠(1 cm)、空肠(3 cm)和回肠(2 cm)组织,生理盐水洗净后放入4%多聚甲醛溶液中固定;采集十二指肠、空肠黏膜样品和结肠、盲肠食糜样品,液氮速冻,放于-80 ℃冰箱中保存待测。

1.5 检测指标及方法 1.5.1 生长性能

于试验第1、15、50天对所有试验仔猪进行称重并记录。试验期间以重复为单位记录每日的采食量,用于计算各阶段平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)、平均日增重(average daily gain,ADG)和料重比(feed/gain,F/G)。

1.5.2 肠道形态结构

取出4%多聚甲醛固定下的十二指肠、空肠和回肠样品制成石蜡切片,随后进行苏木素-伊红(HE)染色,脱水封片后在显微镜下进行图像采集,应用Image-pro plus 6.0软件以40倍标尺为标准测量各肠段绒毛高度(villous height,VH)和隐窝深度(crypt depth,CD),并计算绒毛高度/隐窝深度(VH/CD)。

1.5.3 肠道微生物群落

将含有目的片段的质粒作为标准质粒分别建立各菌群的标准曲线,采用实时荧光定量方法(探针法)对所有样本拷贝数进行测定,通过标准曲线进行计算得到断奶仔猪结肠和盲肠中的大肠杆菌(E.coli)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、沙门氏菌(Salmonella)和双歧杆菌(Bifidobacterium)的数量。

1.5.4 肠道紧密连接和免疫功能

采用猪分泌型免疫球蛋白A(SIgA)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(购自北京诚林生物科技有限公司)测定十二指肠和空肠黏膜中SIgA的含量。

1.6 数据统计与分析

使用Excel 2010对所有试验数据进行初步统计,使用SPSS 20.0统计软件中的one-way ANOVA程序进行单因素方差分析,所有数据以“平均值±标准误”表示,P<0.05为差异显著,0.05≤P < 0.10为有显著差异趋势。

2 结果与分析 2.1 枯草芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能的影响

表 2可知,在试验第1~14天,各组间ADFI、ADG和F/G均无显著差异(P>0.05);在试验第15~49天,各组间ADFI、ADG和F/G均无显著差异(P>0.05)。试验全期,各组间ADFI和ADG均无显著差异(P>0.05);与CON组相比,仅ANT组F/G显著降低(P<0.05)。

表 2 枯草芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of B. subtilis on growth performance of weaned piglets
2.2 枯草芽孢杆菌对断奶仔猪肠道形态结构的影响

表 3可知,各组间十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度均无显著差异(P>0.05);与CON组相比,ANT组、ANT+BS组和BS组回肠的隐窝深度分别降低了10.16%、14.98%、18.10%,有差异显著的趋势(P=0.084)。

表 3 枯草芽孢杆菌对70日龄仔猪肠道形态结构的影响 Table 3 Effects of B. subtilis on intestinal morphology of 70-day-old piglets
2.3 枯草芽孢杆菌对断奶仔猪盲肠和结肠菌群的影响

表 4可知,与CON组相比,ANT组、ANT+BS组和BS组盲肠中双歧杆菌的数量显著提高(P<0.05),而大肠杆菌、乳酸杆菌和沙门氏菌的数量无显著差异(P>0.05),且ANT+BS组、BS组与ANT组盲肠中各菌群数量无显著差异(P>0.05)。各组间结肠中大肠杆菌、乳酸杆菌、沙门氏菌和双歧杆菌的数量均无显著差异(P>0.05)。

表 4 枯草芽孢杆菌对70日龄仔猪盲肠和结肠菌群的影响 Table 4 Effects of B. subtilis on microflora in cecum and colon of 70-day-old piglets 
2.4 枯草芽孢杆菌对断奶仔猪十二指肠和空肠黏膜中SIgA含量的影响

表 5可知,各组间十二指肠黏膜中SIgA的含量无显著差异(P>0.05);与CON组相比,其他3组空肠黏膜中SIgA的含量显著提高(P<0.05),且ANT+BS组与BS组之间无显著差异(P>0.05),但均显著低于ANT组(P<0.05)。

表 5 枯草芽孢杆菌对70日龄仔猪十二指肠和空肠黏膜中SIgA含量的影响 Table 5 Effects of B. subtilis on content of SIgA in duodenum and jejunum mucosa of 70-day-old piglets 
3 讨论 3.1 枯草芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能的影响

大量的研究发现,动物饲粮中添加一定量的益生菌制剂可以改善动物的生长性能,起到替代饲用抗生素的作用,常见的益生菌有芽孢杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌等[13]。然而在实际的生产试验中,由于枯草芽孢杆菌添加量和活菌数的不同使得试验所得到的结果也并不一致。王晓丹等[14]的试验研究结果表明,与空白对照组相比,饲粮中添加250 g/t的枯草芽孢杆菌制剂(活菌数≥4.0×109 CFU/g)可以显著提高断奶仔猪的末重和ADG,且显著高于抗生素组,但ADFI和F/G无显著差异。魏立民等[15]的试验研究结果表明,饲粮中添加0.2%的枯草芽孢杆菌制剂(≥2.0×1010 CFU/g)可以显著提高断奶仔猪的末重、ADG、ADFI,但其F/G与对照组相比无显著差异。万根等[16]的试验研究结果表明,饲粮中添加1.5、2.0 g/kg的枯草芽孢杆菌制剂(≥2.0×108 CFU/g)可以显著提高断奶仔猪末重、ADG,显著降低F/G,但对ADFI无显著影响。本试验的研究结果表明,饲粮中添加20 mg/kg枯草芽孢杆菌制剂对断奶仔猪的生长性能无显著影响,并且与抗生素联用也无协同或拮抗作用。本试验与前人的研究结果[14-16]有差异,这可能与枯草芽孢杆菌添加量、试验时间等因素有关。

3.2 枯草芽孢杆菌对断奶仔猪小肠形态结构的影响

小肠是动物机体消化与吸收营养物质的主要场所,小肠的绒毛高度与隐窝深度直接影响小肠对营养物质消化与吸收的效率。绒毛高度增加,隐窝深度减小,可增加小肠与营养物质的接触面积,增强对营养物质的消化与吸收能力[17-18]。有研究表明,饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以促进小肠绒毛的发育[19]。邓军等[20]的试验研究结果表明,新生仔猪口腔灌服枯草芽孢杆菌RJGP16菌液(活菌数为1.0×109 CFU/mL)可以显著增加回肠绒毛高度,极显著降低回肠隐窝深度,极显著增加回肠绒毛高度/隐窝深度。Lee等[21]的试验结果表明,饲粮中添加4.5 g/kg的枯草芽孢杆菌发酵物可以显著提高断奶仔猪小肠的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度。本试验的研究结果表明,饲粮中添加20 mg/kg枯草芽孢杆菌制剂对肠道形态的影响主要是通过降低回肠的隐窝深度,从而起到改善肠道形态发育,促进肠道健康的作用。

3.3 枯草芽孢杆菌对断奶仔猪肠道微生物的影响

断奶应激会影响仔猪肠道微生物系统,使有益菌的数量减少,有害菌的数量增加,从而危害断奶仔猪的健康生长。因而添加能够定植于仔猪肠道内,且能改善仔猪肠道微生物生态平衡的益生菌是有必要的。枯草芽孢杆菌是一种兼性厌氧菌,能迅速消耗肠道环境中的游离氧,造成厌氧环境[10],促进乳酸杆菌、双歧杆菌等有益厌氧菌的生长,抑制其他病原菌的生长,进而保证动物健康和促进生长。王志成等[22]研究表明,饲粮中添加植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的复合益生菌制剂可以显著抑制盲肠、结肠、直肠中大肠杆菌的增殖,促进有益菌双歧杆菌、乳酸杆菌的生长。Hu等[23]研究表明,饲粮中添加2×109、4×109、20×109 CFU/kg的枯草芽孢杆菌KN-42可以显著降低仔猪粪便中大肠杆菌的数量,显著增加乳酸杆菌的数量,且与添加剂量呈正相关。本试验的研究结果表明,饲粮中添加20 mg/kg枯草芽孢杆菌制剂可以提高断奶仔猪盲肠中双歧杆菌的数量,起到调节肠道菌群的作用,并且与抗生素联用无显著差异。

3.4 枯草芽孢杆菌对断奶仔猪肠道黏膜中SIgA含量的影响

SIgA在肠道免疫功能中发挥着重要的作用,其主要通过维持肠道黏膜内环境稳态,干扰病原体与上皮细胞受体的结合,免疫排异清除病原体和降低病菌毒力等方式从而有效地实现对机体的免疫保护[24],因此SIgA是衡量肠道免疫功能的重要指标之一。枯草芽孢杆菌进入小肠后,激活TH2细胞产生细胞因子,继而激活B细胞,激发免疫球蛋白(Ig)A、IgG、IgM等体液免疫,通过淋巴细胞再循环活化全身免疫系统,从而增强机体的免疫功能[25]。Rajput等[26]的试验结果表明,枯草芽孢杆菌B10可以提高肉鸡空肠和回肠中SIgA含量。秦红等[27]研究结果表明,饲粮中添加0.1 g/kg芽孢杆菌制剂(1.0×109 CFU/kg)可以显著提高育肥猪空肠和回肠中SIgA的含量,提高肠道免疫功能。本试验的研究结果表明,饲粮中添加20 mg/kg枯草芽孢杆菌制剂可以通过提高断奶仔猪空肠黏膜中SIgA的含量来提高肠道免疫功能。

4 结论

本试验条件下,饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以改善断奶仔猪肠道结构,增加肠道内有益菌的数量,提高小肠黏膜免疫功能,达到部分替代抗生素的效果,并且枯草芽孢杆菌与抗生素联用无协同或拮抗作用。

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