由于夏季高温天气影响，热应激已成为阻碍奶牛养殖业前进的重要因素之一。奶牛热应激是指奶牛机体受到超过自身调节能力的高温刺激而产生的一系列非特异性防御反应[1]。奶牛为耐寒怕热体质，成年奶牛的适宜环境温度为5~25 ℃[2]。当环境温湿度指数(temperature and humidity index，THI)>68时，奶牛便有可能产生热应激；当THI>72时，则认为该环境为热应激环境，奶牛处于此环境下，便会产生热应激[3]。热应激会对泌乳期奶牛的各项生理机能产生不良影响，造成奶牛食欲下降，采食量、产奶量和乳品质下降[4-6]，免疫功能减弱，繁殖机能下降等[7-9]。热应激不仅会缩短奶牛使用年限，还会影响其经济价值的发挥，因而已成为奶牛养殖业亟待解决的重要产业问题。
金银花属忍冬科、忍冬属植物，在中国、波兰、俄罗斯[10]和日本[11]等地均有种植，兼有药用和营养双重作用。金银花富含多种化学成分，主要为有机酸类化合物，如绿原酸、异绿原酸、隐绿原酸、棕榈酸及咖啡酸[12]。金银花具有多种药理学作用。雷玲等[13]通过对金银花解热、抗炎作用的研究发现，金银花提取物(Lonicera japonica extract，LJE)浓度为10 mg/mL时，可缓解大鼠的发热情况；皮建辉等[14]研究发现，金银花提取物对小鼠有免疫调节作用，可有效调节小鼠血清免疫酶的活性，提高淋巴器官的抗氧化能力，具有良好的免疫调节作用。在热应激肉牛饲粮中添加金银花提取物可有效缓解肉牛热应激，增强抗氧化性能，促进骨骼肌纤维损伤的修复[15-16]；在围产期奶牛饲粮中添加金银花提取物可提高围产期奶牛抗炎和抗氧化能力，改善生产性能，缓解围产期奶牛能量负平衡[17-18]。金银花提取物应用于热应激肉牛和围产期奶牛均有积极影响，而现有研究对金银花提取物应用于热应激奶牛的试验却鲜有报道。因此，本试验旨在研究饲粮添加金银花提取物对热应激奶牛生产性能、血清生化指标和免疫功能的影响，以探究金银花提取物有效缓解奶牛热应激的适宜添加量。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点试验于2018年6—9月在河北省新乐市君源牧业有限公司进行。
1.2 试验材料试验使用的金银花提取物购于陕西中鑫生物技术有限公司，主要成分为绿原酸，含量为10%。
1.3 试验动物与试验设计试验选取体况评分(2.5±0.3)分、产奶量(30±1) kg/d、泌乳天数(105±5) d的健康荷斯坦奶牛20头，随机分为4组，每组5头。对照组(CON组)饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加14(LJE-14组)、28(LJE-28组)、56 g/d(LJE-56组)的金银花提取物。试验期10周，其中预试期2周，正试期8周。
1.4 试验饲粮与饲养管理试验牛采用散栏式饲养方式，每天饲喂3次(06:30、13:30、20:30)，挤奶3次(05:30、12:30、19:30)，自由饮水。根据NRC(2001)[19]配制饲粮，以全混合日粮(total mixed ration，TMR)形式饲喂，满足奶牛营养需要。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
试验期间每天06:00、14:00、22:00记录牛舍温度、相对湿度，将温湿度计挂于离地1.5 m处测定牛舍内的温度和相对湿度，并换算成为THI，换算公式为：
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式中：T是牛舍温度(℃)；RH是牛舍相对湿度(%)。
1.5.2 直肠温度(RT)和呼吸频率(RR)的测定试验期间，每周连续2 d测定每头牛的直肠温度和呼吸频率。直肠温度和呼吸频率测定的具体时间为10：00—11：30和16：00—17：30。利用普通电子体温计测定并记录直肠温度。呼吸频率根据目测胸腹部的起伏动作测定，1 min的呼吸总次数作为呼吸频率。
1.5.3 饲粮及剩料样品釆集与测定正试期每周连续3 d测定采食量，并采用四分法采集饲料样，测定干物质(DM)含量，从而计算每头牛每天的干物质采食量(DMI)。同时测定粗蛋白质(CP)[AOAC(2000)，方法976.05]、粗脂肪(EE)[AOAC(2003)，方法4.5.05]和粗灰分(Ash)[GB/T 6438—1992]含量，中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量参照Van Soest等[21]描述的方法进行测定。
1.5.4 牛奶样品的釆集与测定试验期间每天准确记录试验牛产奶量并每10 d釆集1次奶样，按早、中、晚=4 : 3 : 3的比例采集50 mL奶样，采用乳成分分析仪(MilkoScanTM FT6000)测定奶样的乳脂率(milk fat rate)、乳蛋白率(milk protein rate)、乳糖率(lactose rate)、非脂乳固形物(non-fat solid)含量和总固形物(total solid)含量。
1.5.5 血清样品的采集与测定试验牛于试验结束当天晨饲前进行尾根静脉采血，室温静置30 min后，3 000×g、4 ℃离心15 min制备血清样品，于-20 ℃冰箱内保存备用。血清肌酐(creatinine，CREA)、尿酸(uric acid，UA)、尿素(urea，UREA)、总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumen，ALB)和葡萄糖(glucose，GLU)含量采用日立全自动生化仪(HITACH-17080)测定。血清免疫球蛋白A(immunoglobin A，IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobin G，IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobin M，IgM)含量采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法，试剂盒购于美国Bethyl公司；血清白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)和热休克蛋白-72(heat shock proteins-72，HSP-72)含量采用美国MyBioSource公司的试剂盒进行测定。
1.6 数据统计分析试验数据采用SAS 9.4软件中的MIXED模块进行统计学检验。统计模型中，试验牛为随机因素，试验处理为固定因素。采用Turkey’s法进行多重比较；采用线性和二次多重比较评价金银花提取物添加量的影响。P < 0.05表示差异显著，0.05≤P < 0.10表示有差异显著趋势。
2 结果 2.1 夏季高温条件下牛舍的THI由表 2和图 1可知，试验期间，牛舍全天平均温度为26.9~33.6 ℃，平均相对湿度为55.47%~77.43%，THI为77.64~84.04。试验期间牛舍早、中、晚的平均THI>72，试验期第11~25天以及第30~56天的平均THI>78，所以奶牛所处环境为热应激环境，且大部分时间处于中度热应激环境范围。
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表 2 牛舍温度和相对湿度 Table 2 Temperature and relative humidity of cattle house |
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图 1 牛舍温湿度指数变化曲线 Fig. 1 Temperature and humidity index curve of cattle house |
由表 3可知，饲粮添加金银花提取物可显著降低热应激奶牛直肠温度(P < 0.05)，而对呼吸频率无显著影响(P>0.05)。
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表 3 金银花提取物对热应激奶牛直肠温度和呼吸频率的影响 Table 3 Effects of Lonicera japonica extract on RT and RR of heat-stressed dairy cows |
由表 4可知，饲粮添加金银花提取物对热应激奶牛干物质采食量、产奶量、乳蛋白率、乳脂率、乳糖率、非脂乳固形物含量和总固形物含量均无显著影响(P>0.05)。
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表 4 金银花提取物对热应激奶牛生产性能和乳成分的影响 Table 4 Effects of Lonicera japonica extract on performance and milk composition of heat-stressed dairy cows |
由表 5可知，饲粮添加金银花提取物可显著降低热应激奶牛血清肌酐含量(P < 0.05)，对热应激奶牛血清尿酸、尿素、总蛋白、白蛋白和葡萄糖含量无显著影响(P>0.05)。随着金银花提取物添加量的增加，血清葡萄糖含量呈二次升高趋势(P=0.072)，其中LJE-28组血清葡萄糖含量最高。
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表 5 金银花提取物对热应激奶牛血清生化指标的影响 Table 5 Effects of Lonicera japonica extract on serum biochemical indexes of heat-stressed dairy cows |
由表 6可知，LJE-28组热应激奶牛血清IgG含量显著高于CON组(P < 0.05)；饲粮添加金银花提取物对热应激奶牛血清IgA和IgM含量无显著影响(P>0.05)。LJE-28组热应激奶牛血清IL-4含量显著高于CON组(P < 0.05)，饲粮添加金银花提取物对热应激奶牛血清IL-1β和IL-2含量无显著影响(P>0.05)。饲粮添加金银花提取物有降低热应激奶牛血清HSP-72含量的趋势(P=0.084)。
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表 6 金银花提取物对热应激奶牛血清免疫指标的影响 Table 6 Effects of Lonicera japonica extract on serum immune indexes of heat-stressed dairy cows |
通常情况下，奶牛直肠温度保持在38.3~39.1 ℃，热应激状态下的奶牛直肠温度会明显升高，当直肠温度达到42~45 ℃时便会出现致死情况[22]。现代药理学研究发现，金银花提取物具有清热解毒的作用[13]。本试验中，饲粮添加金银花提取物可显著降低热应激奶牛直肠温度，表明金银花提取物有助于缓解奶牛热应激。
3.2 金银花提取物对热应激奶牛生产性能和乳成分的影响奶牛处于热应激状态时，主要表现为以减少干物质采食量来最大限度地降低热总负荷，加快激活散热机制，引起连锁生理调节，使维持能量增加，生产能量减少[22-23]。当THI>72时，THI每升高1，奶牛产奶量降低0.2 kg[24]；当最大THI达到77时，奶牛产奶量和干物质采食量均显著降低，THI和干物质采食量呈显著负相关[25]，发生热应激时，各泌乳阶段奶牛的乳蛋白率、乳脂肪率和非脂乳固形物含量均有下降趋势[26]。本试验结果显示，饲粮添加金银花提取物对热应激奶牛干物质采食量无显著影响，但同对照组相比，金银花提取物添加组干物质采食量均有所提高，表明金银花提取物对热应激奶牛的干物质采食量无负面影响[27]。由于奶牛的产奶量主要受其干物质采食量和饲粮中粗蛋白质含量的影响，而金银花提取物添加组干物质采食量无显著变化，奶牛产奶量和乳成分亦无显著变化，但金银花提取物添加组产奶量与对照组相比在数值上均有所提高，表明金银花提取物对热应激奶牛产奶量和乳品质无负面影响。
3.3 金银花提取物对热应激奶牛血清生化指标的影响肌酐是反映肾脏功能的重要指标。在热应激条件下，奶牛血清肌酐含量会升高[28]，这可能与热应激导致奶牛汗腺分泌增强、呼吸加快、排尿减少有关[29]。本试验中，饲粮添加金银花提取物可显著降低热应激奶牛血清肌酐含量。Tzeng等[30]将金银花提取物用于治疗糖尿病大鼠，8周之后大鼠的肌酐清除率明显增加，与本试验结果一致。由此推断金银花提取物在一定程度上缓解了热应激对泌乳奶牛造成的危害。
葡萄糖是重要的营养性单糖，可为动物的代谢活动提供快速且有效的营养素。热应激条件下，奶牛采食量下降，造成奶牛能量负平衡，使得血清中葡萄糖含量减少[31]。Wheelock等[32]、Rhoads等[33]和权素玉[34]通过葡萄糖耐受试验、肾上腺素激发试验和同位素标记试验证实，热应激条件下肝脏葡萄糖生成并未减少，而是全身组织器官葡萄糖消耗率显著升高，导致乳腺可利用的葡萄糖减少，造成牛奶中乳糖率下降。本试验中，血清葡萄糖含量呈二次升高趋势，并且金银花提取物添加组的乳糖率高于对照组。叶清华[35]研究发现，金银花提取物对大鼠的糖代谢具有改善作用，与本试验结果一致。葡萄糖是乳糖合成的前体物，1分子乳糖的合成需要消耗至少1分子葡萄糖和1分子半乳糖[36]。因此可以推断，金银花提取物可改善热应激奶牛葡萄糖代谢，促进了机体葡萄糖向乳糖的转化。
3.4 金银花提取物对热应激奶牛免疫功能的影响热应激通过内部和外部感受器同时刺激奶牛下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴引起皮质醇分泌增加[37]，皮质醇会抑制巨噬细胞的免疫功能，加速淋巴细胞凋亡，机体淋巴细胞数量减少，从而抑制机体免疫功能，导致发病率升高[38]。本试验中，饲粮添加28 g/d金银花提取物可显著提高热应激奶牛血清IgG含量。IgG是体液免疫的主要抗体，在血清中含量最多，并且是反映机体免疫应答的重要指标。崔晓燕[39]研究发现，金银花提取物对小鼠具有免疫调节作用，与本试验结果一致，表明金银花提取物可提高热应激奶牛免疫应答。
IL-4是辅助型T细胞2(Th2细胞)分泌的细胞因子，能够促进嗜酸性粒细胞的激活和分化，在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用[40]。本试验中，饲粮添加28 g/d金银花提取物可显著增加热应激奶牛血清IL-4含量。IL-4可辅助B细胞并提高IgG亚型的产量，从而增加IgG的分泌量[41]，血清IL-4含量显著升高的同时IgG含量也有所升高，与本试验结果一致。由此可以推断，金银花提取物提高热应激奶牛的免疫应答可能与提高IL-4的分泌量有关。
HSP-72是应激因素所诱导出的作用最为显著的蛋白质之一，除了具有作为分子伴侣的作用外，还会在各种应激后的蛋白质异常折叠、突变过程中发挥细胞内保护作用[42]。正常情况下，HSP-72的表达量极低，而奶牛处于热应激环境当中时，HSP-72的表达量会急剧升高[43]。本试验中，饲粮添加金银花提取物有降低热应激奶牛血清HSP-72含量的趋势，与Sun等[44]研究结果一致，表明饲粮添加金银花提取物有助于缓解奶牛热应激。
4 结论① 饲粮添加金银花提取物对热应激奶牛生产性能及呼吸频率无显著影响，但显著降低了直肠温度。
② 饲粮添加金银花提取物可提高热应激奶牛免疫应答，有助于缓解奶牛热应激。
③ 本试验条件下，饲粮添加28 g/d金银花提取物为有效缓解奶牛热应激的适宜添加量。
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